一種解脂耶氏酵母及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株解脂耶氏酵母及其應(yīng)用，屬于發(fā)酵領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002](R)-苯乙醇及其衍生物是合成多種手性藥物如(R)-地諾帕明、(R)-托莫西汀、(S)-氟西汀、(R)-沙丁胺醇等的重要中間體。為獲得光學(xué)活性純苯乙醇，應(yīng)用最廣的是化學(xué)催化不對稱合成法，但是其存在反應(yīng)條件劇烈，環(huán)境不友好的缺陷。近年來，生物催化法因反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)物立體選擇性高、對環(huán)境友好等優(yōu)點成為獲得光學(xué)活性產(chǎn)物的另一種有效途徑。目前，生物催化法制備手性芳香酮的相關(guān)報道較多，但仍然無法實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，主要原因是生產(chǎn)菌株催化活性不穩(wěn)定、產(chǎn)物積累量不高及立體選擇性較差。
[0003]解脂耶氏酵母(Yarrowia Iipolytica),屬于子囊酵母，是被廣泛研究的非常規(guī)菌種之一，該菌株安全、無毒，既能在海水中也能在淡水中生存，可以以葡萄糖、乙醇、乙酸和脂肪酸、烴類等物質(zhì)為碳源進(jìn)行生長，通常用于有機(jī)廢水的處理或者油脂的富集。Giancarlo Fantin etal., “Ant1-Prelog Microbial Reduct1n of Prochiral CarbonylCompounds”, Tetrahedron, Vol.52.N0.10, pp.3547-3552，報道了部分解脂耶氏酵母可以將苯乙酮轉(zhuǎn)化為(R)-苯乙醇，但是均難以兼顧轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物純度(產(chǎn)物e.e.值)，轉(zhuǎn)化率為55-70%時，產(chǎn)物純度僅為75%左右，產(chǎn)物純度接近100%時，轉(zhuǎn)化率最高僅25%。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明提供了一種新的解脂耶氏酵母及其在將苯乙酮轉(zhuǎn)化為(R)-苯乙醇中的應(yīng)用。
[0005]本發(fā)明解脂耶氏酵母，它是由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保藏的保藏號:CCTCC M2013606 的解脂耶氏酵母 cmq6_8 (Yarrowia lipolytica cmq6_8)。
[0006]本發(fā)明解脂耶氏酵母cmq6_8 (Yarrowia lipolytica cmq6_8),于 2013 年 11 月 27日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，其地址為:中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏號為CCTCC M 2013606。
[0007]本發(fā)明還提供了將苯乙酮轉(zhuǎn)化為(R)-苯乙醇的方法，包括如下步驟:
[0008](I)取保藏號:CCTCC M 2013606 的解脂耶氏酵母 cmq6_8 (Yarrowia lipolyticacmq6-8),加水至菌體細(xì)胞的濃度達(dá)到0.2?0.3g/ml,調(diào)pH為6.8?7.2,加甘油至濃度為I ?3% (v/v)；
[0009](2)往步驟(I)的溶液中加入底物苯乙酮至濃度為30?60mmol/L，在溫度25?35°C的條件下反應(yīng)至少24h，即可。
[0010]步驟(I)中，所述菌體細(xì)胞的濃度為0.25g/mL。
[0011]步驟(I)中，調(diào)節(jié)pH為7.0。
[0012]步驟(I)中，所述甘油的濃度為2% (v/v)。
[0013]步驟(2)中，所述底物苯乙醇的濃度為45mmol/L。
[0014]步驟(2)中，所述反應(yīng)溫度為30°C。
[0015]步驟(2)中，所述反應(yīng)時間為36h。
[0016]步驟(2)中，在添加底物苯乙酮時，同時添加乙醇至濃度為I?3 (v/v)。優(yōu)選地，所述乙醇濃度為2 (v/v)。
[0017]本發(fā)明解脂耶氏酵母，能夠高效地將苯乙酮轉(zhuǎn)化成(R)-苯乙醇，可以兼顧轉(zhuǎn)化率和產(chǎn)物純度，轉(zhuǎn)化獲得的產(chǎn)物純度(產(chǎn)物e.e.值)大于99%，同時，底物轉(zhuǎn)化率高達(dá)78.4%，工業(yè)應(yīng)用前景良好。
[0018]顯然，根據(jù)本發(fā)明的上述內(nèi)容，按照本領(lǐng)域的普通技術(shù)知識和慣用手段，在不脫離本發(fā)明上述基本技術(shù)思想前提下，還可以做出其它多種形式的修改、替換或變更。
[0019]以下通過實施例形式的【具體實施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容再作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實例。凡基于本發(fā)明上述內(nèi)容所實現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。
【附圖說明】
[0020]圖1基于26S rDNA Dl / D2區(qū)域序列和Neighbor-Joining法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹
【具體實施方式】
[0021]實施例1本發(fā)明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)的鑒定特征
[0022]1、鑒定方法
[0023]將從成都某手性化工廠污水處理池附近采集的土壤樣品中分離得到的本發(fā)明菌株，進(jìn)行如下生理生化和分子生物鑒定。
[0024](I)生理生化特征
[0025]利用顯微鏡及肉眼觀察細(xì)胞及固體平板上的菌落形態(tài)，并根據(jù)《酵母菌的特征與鑒定手冊》所列的酵母菌種鑒定方法進(jìn)行生化特征分析。
[0026](2)分子生物學(xué)鑒定
[0027]a、酵母基因組DNA提取:參考《酵母基因組提取試劑盒》的操作說明，提取酵母基因組DNA。
[0028]b、26S rDNA Dl / D2區(qū)域的PCR擴(kuò)增:26S rDNA Dl / D2區(qū)域的PCR擴(kuò)增采用通用弓 I 物對 NLl (5' -GCAT CAATAAGCGGAGGAAAAG-3 ’)和 NL4 (5' -GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3 ’)PCR 反應(yīng)體系(50μ L):10XPCR 緩沖液，5.0μ L ;Mg2+(5mmol / L)，3.0 μ L ;dNTP (各2.5mmol / L)，4.0 μ L ;引物(10 μ mol / L)各 1.0 μ L ；TaqDNA 聚合酶 0.5 μ L ;模板DNA2.0μ L ;去離子水 33.5uL。擴(kuò)增程序為:94°C 1min ；94°C lmin，50°C lmin，72°C Imin ；35個循環(huán)后72°C 1min0取5 μ L產(chǎn)物于1%的瓊脂糖凝膠(含GV染料)電泳，紫外燈下觀測結(jié)果。
[0029]C、序列分析和系統(tǒng)樹的構(gòu)建:將擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物40 μ L,送華大基因公司(北京)完成測序工作。根據(jù)供試菌株的26S rDNA序列，運用Blast程序在GenBank數(shù)據(jù)庫中分別進(jìn)行同源序列搜索。根據(jù)同源序列搜索的結(jié)果，下載相關(guān)菌種的26S rDNA序列，與供試菌株的序列一同用Clustal X1.83軟件進(jìn)行多序列比對，結(jié)果采用MEGA3.1中的鄰接法(Neighbor.Joining)進(jìn)行系統(tǒng)樹的構(gòu)建，并用Bootstrap對進(jìn)化樹進(jìn)行1000次可信度分析。
[0030]2、鑒定結(jié)果
[0031](I)生理生化特征
[0032]菌落成圓形，邊緣整齊，乳白色，不透明，有光澤，質(zhì)地軟；顯微鏡下菌株cmq6-8的細(xì)胞呈卵圓形，無菌絲體、未見出芽，有子囊孢子，有擲孢子產(chǎn)生；糖發(fā)酵試驗:麥芽糖+，葡萄糖+，乳糖-;碳源同化試驗:麥芽糖+，乳糖V，甘露醇V;未形成類淀粉化合物；在葡萄糖濃度為50%時菌未生長；可以分解尿素。
[0033](2) 26S rDNADl / D2 區(qū)域序列分析
[0034]PCR獲得了本發(fā)明菌株的26S rDNA D1/D2區(qū)域序列長度為593bp，利用BLAST軟件將該序列與GenBank中收錄的DNA序列進(jìn)行比對，并與相關(guān)菌種構(gòu)建進(jìn)化樹(如圖1所示)。圖中顯示本發(fā)明分離菌株與解脂耶氏酵母ATCC18942 (AF335986)聚成一支，序列同源性> 99.00%，表明兩者親緣關(guān)系最近。
[0035]結(jié)合生理生化特征和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，將本發(fā)明分離菌株鑒定為解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica),命名為解脂耶氏酵母 cmq6_8 (Yarrowia lipolyticacmq6-8)，并于2013年11月27日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，保藏號為CCTCCM2013606。
[0036]實施例2采用本發(fā)明解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)將苯乙酮轉(zhuǎn)化為(R)-苯乙醇的方法
[0037]1、實驗材料
[0038]1、斜面培養(yǎng)基:
[0039]去皮馬鈴薯200g，葡萄糖20g，瓊脂20g，ddH201000mL, pH自然。
[0040]2、種子培養(yǎng)基:
[0041]蛋白胨1g,酵母膏 5g,葡萄糖 20g, ddH201000mL, pH7.0。
[0042]3、發(fā)酵培養(yǎng)基:
[0043]蛋白胨10g，酵母膏 5g，葡萄糖 20g，(NH4) 2S045g，KH2P042g，ddH201000mL，ρΗ7.0。
[0044]4、實驗菌株:本發(fā)明保藏號為CCTCC Μ2013606的解脂耶氏酵母cmq6_8 (Yarrowialipolytica cmq6_8)。
[0045]2、實驗方法
[0046](I)、菌體細(xì)胞的培養(yǎng)
[0047]種子培養(yǎng):用無菌牙簽從PDA斜面上挑取少量菌苔接種于20mL種子培養(yǎng)基中，300C，170r/min,搖床培養(yǎng) 24h。
[0048]發(fā)酵培養(yǎng):按5%的接種量將種子液接入50mL發(fā)酵培養(yǎng)基中，30°C，170r/min,搖床培養(yǎng)48h。
[0049]收集菌體細(xì)胞:收集發(fā)酵液，于6000r/min，4°C，離心1min后