一種鹽藻培養(yǎng)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
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[0001]本發(fā)明屬于藻類生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鹽藻培養(yǎng)方法，以同時增加鹽藻繁殖速度，提高生物量和促進(jìn)β-胡蘿卜素積累，所培養(yǎng)的鹽藻可用于醫(yī)療保健和衛(wèi)生防疫技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
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[0002]鹽藻是一種生存在高濃鹽湖中的單細(xì)胞真核藻類，隸屬于綠藻門綠藻綱團(tuán)藻目鹽藻科鹽藻屬，為綠色單細(xì)胞藻，形體微小，無細(xì)胞壁，具有糖蛋白形成的包被，是目前發(fā)現(xiàn)的唯一能在高濃度鹽水中生存的奇特生命，由于富含獨特而豐富的生命元素，被世界科學(xué)界譽(yù)為“細(xì)胞的動力源”，“生命的保護(hù)劑”，鹽藻富含胡蘿卜素，可人工培養(yǎng)從中提取甘油或胡蘿卜素，還可作魚、蝦、貝等幼體的餌料；在醫(yī)療衛(wèi)生領(lǐng)域可預(yù)防和輔助治療冠心病、心腦血管疾病、糖尿病、癌癥、肝臟疾病、胃部常見病、口腔潰瘍、白內(nèi)障、干眼癥，減輕化療不良反應(yīng)、改善視力、提高免疫力、抗氧化、延緩衰老；由于鹽藻無細(xì)胞壁，添加到動物飼料中，可促進(jìn)飼料轉(zhuǎn)化率提高動物的生長速度，減少疾病，開發(fā)“綠色飼料”對提高動物飼料產(chǎn)品質(zhì)量具有重大意義；鹽藻巨大的經(jīng)濟(jì)價值和獨特的優(yōu)點已使其成為大規(guī)模培養(yǎng)的對象，很多國家和地區(qū)都在培養(yǎng)和開發(fā)鹽藻，包括澳大利亞、日本、以色列、美國等，我國的海南和內(nèi)蒙古也進(jìn)行了鹽藻的培養(yǎng)，目前的培養(yǎng)方法采用低強(qiáng)度光照和溫度，適合鹽藻生物量的快速生長，但是不利于胡蘿卜素的累積，而且營養(yǎng)元素相對缺乏，特別是氮元素，降低了營養(yǎng)價值；采用高強(qiáng)度光照和溫度，有利于胡蘿卜素的積累，但是嚴(yán)重影響了鹽藻的生長繁殖量。因此研發(fā)既能增加鹽藻繁殖速度，提高生物量，又能促進(jìn)胡蘿卜素積累的培養(yǎng)方法很有應(yīng)用前景和社會價值。

【發(fā)明內(nèi)容】

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[0003]本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點，尋求設(shè)計一種既能增加鹽藻繁殖速度，提高生物量，又能促進(jìn)胡蘿卜素積累的工藝方法，可應(yīng)用于醫(yī)療保健、衛(wèi)生防疫、動物飼料領(lǐng)域。
[0004]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明涉及的鹽藻培養(yǎng)方法包括鹽藻繁殖和β -胡蘿卜素積累兩個步驟:
[0005](I)鹽藻繁殖:先在鹽藻培育反應(yīng)器內(nèi)安置光源，調(diào)整光照強(qiáng)度為2000— 4000LX，溫度為25— 28°C，鹽藻培養(yǎng)劑中的鹽的重量百分比濃度為I一 1.2%，氮源(KNO3)為I—1.5mL，磷源(KH2PO4)為0.3mL，無機(jī)碳源(NaHCO4)為10 — 15mL，在鹽藻培養(yǎng)劑中接種鹽藻，鹽藻培育分別經(jīng)過I一2天的生長期、I一2天的對數(shù)生長期和I一2天的平臺期后分別測量鹽藻培養(yǎng)劑中氮源(KNO3)、磷源(KH2PO4)和無機(jī)碳源(NaHCO4),使其分別達(dá)到0.5mL、0.1mL和1mL以下時，進(jìn)行鹽藻生物量測定，使其達(dá)到最高值，完成鹽藻繁殖；
[0006](2) β-胡蘿卜素積累:再將鹽藻培育反應(yīng)器內(nèi)所安置的光源調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度為7000— 9000Lx，溫度為31—35 °C ;向鹽藻培養(yǎng)劑中分別添加食鹽、KNO3^KH2PO4、NaHCO4,使得鹽的重量百分比濃度為3.2—3.5%，氮源(KNO3)為0.5mL，磷源(KH2PO4)為0.lmL，無機(jī)碳源(NaHCO4)為10mL，再經(jīng)3—5天培養(yǎng)后鹽藻由深綠色逐漸變成褐色，實現(xiàn)β-胡蘿卜素的積累，然后測定其胡蘿卜素達(dá)到預(yù)期值，完成鹽藻的培養(yǎng)。
[0007]本發(fā)明涉及的鹽藻生物量測定工藝方法是:取ImL鹽藻繁殖階段的鹽藻培養(yǎng)劑，用0.1mL無水酒精麻醉后滴入血球計數(shù)板測量得ImL中微藻絕對值，同時用分光光度計在吸光度A700nm時測定微藻絕對值對應(yīng)的光密度(OD值)，分別測量5次得5個微藻絕對值和光密度(OD值)，并按照微藻絕對值和光密度(OD值)對應(yīng)關(guān)系繪制鹽藻生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線，以后只需測定鹽藻光密度(OD值)即可對應(yīng)得出鹽藻生物量，實現(xiàn)鹽藻生物量的測定。
[0008]本發(fā)明涉及的胡蘿卜素測定工藝方法是:取5mLf3_胡蘿卜素積累階段的鹽藻培養(yǎng)劑，加入一滴重量百分比濃度為20%的氫氧化鈉(NaOH)混勻后以3000r/min的速度離心3分鐘，棄上清液；再加入一滴重量百分比濃度為80%的丙酮(C3H6O)水溶液搖勻后離心I分鐘，提取色素，反復(fù)提取至鹽藻培養(yǎng)劑為無色，合并含丙酮(C3H6O)提取液定容為25mL混合液，用分光光度計在吸光度A450nm時測定混合液光密度(0D值)，然后依據(jù)鹽藻生物量測定的對應(yīng)關(guān)系推得鹽藻中胡蘿卜素的值。
[0009]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，將鹽藻的培養(yǎng)工藝分為兩個階段，第一階段主要是增加鹽藻的繁殖速度，提高生物量，第二階段主要是加大協(xié)迫因素，促進(jìn)胡蘿卜素的積累，其培養(yǎng)工藝科學(xué)合理，步驟簡單，性能穩(wěn)定，不受外界環(huán)境影響，產(chǎn)品利用率高。
【具體實施方式】
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[0010]下面通過實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步描述。
[0011]實施例1:
[0012]本實施例涉及的鹽藻培養(yǎng)過程包括鹽藻繁殖和β -胡蘿卜素積累兩個步驟:
[0013](I)鹽藻繁殖:先在鹽藻培育反應(yīng)器內(nèi)安置光源，調(diào)整光照強(qiáng)度為2000— 4000LX，溫度為25— 28°C，鹽藻培養(yǎng)劑中的鹽的重量百分比濃度為I一 1.2%，氮源(KNO3)為I—1.5mL，磷源(KH2PO4)為0.3mL，無機(jī)碳源(NaHCO4)為10 — 15mL，在鹽藻培養(yǎng)劑中接種鹽藻，鹽藻培育分別經(jīng)國I一2天的生長期、I一2天的對數(shù)生長期和I一2天的平臺期后分別測量鹽藻培養(yǎng)劑中氮源(KNO3)、磷源(KH2PO4)和無機(jī)碳源(NaHCO4)使其分別達(dá)到0.5mL、0.1mL和1mL以下時，進(jìn)行鹽藻生物量測定，使其達(dá)到最高值，完成鹽藻繁殖；
[0014](2) β-胡蘿卜素積累:再將鹽藻培育反應(yīng)器內(nèi)所安置的光源調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度為7000—9000Lx，溫度為31—35°C，用添加食鹽、KN03、KH2P04、NaHC04的方法調(diào)整鹽藻培養(yǎng)劑，使鹽的含量重量百分比濃度為3.2—3.5%，氮源(KNO3)為0.5mL，磷源(KH2PO4)為0.1mL,無機(jī)碳源(NaHCO4)為10mL，再經(jīng)3—5天培養(yǎng)后鹽藻由深綠色逐漸變成褐色，實現(xiàn)β-胡蘿卜素的積累，然后測定其胡蘿卜素達(dá)到預(yù)期值，完成鹽藻的培養(yǎng)。
[0015]本實施例涉及的鹽藻生物量測定工藝方法是:取ImL鹽藻繁殖階段的鹽藻培養(yǎng)劑，用0.1mL無水酒精麻醉后滴入血球計數(shù)板測量得ImL中微藻絕對值，同時用分光光度計在吸光度A700nm時測定微藻絕對值對應(yīng)的光密度(0D值)，分別測量5次得5個微藻絕對值和光密度(0D值)，并按照微藻絕對值和光密度(0D值)對應(yīng)關(guān)系繪制鹽藻生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線，以后只需測定鹽藻光密度(0D值)即可對應(yīng)得出鹽藻生物量，實現(xiàn)鹽藻生物量的測定。
[0016]本實施例涉及的胡蘿卜素測定工藝方法是:取5mLf3_胡蘿卜素積累階段的鹽藻培養(yǎng)劑，加入一滴重量百分比濃度為20%的氫氧化鈉(NaOH)混勻后以3000r/min的速度離心3分鐘，棄上清液；再加入一滴重量百分比濃度為80%的丙酮(C3H6O)水溶液搖勻后離心I分鐘，提取色素，反復(fù)提取至鹽藻培養(yǎng)劑為無色，合并含丙酮(C3H6O)提取液定容為25mL混合液，用分光光度計在吸光度A450nm時測定混合液光密度(0D值)，然后依據(jù)鹽藻生物量測定的對應(yīng)關(guān)系推得鹽藻中胡蘿卜素的值。
[0017]實施例2:
[0018]本實施例涉及的鹽藻培養(yǎng)方法過程為:
[0019](I)鹽藻藻種培育:從中國水科院黃海水產(chǎn)研宄所藻種庫引進(jìn)杜氏鹽藻藻種，經(jīng)三級擴(kuò)種后，進(jìn)行產(chǎn)業(yè)化培育；
[0020](2)鹽藻繁殖:將鹽藻培育反應(yīng)器內(nèi)安置的光源調(diào)整其光照強(qiáng)度為3000LX，溫度為28 °C，培養(yǎng)劑包括氯化鈉(NaCl) 1g,氮源(KNO3) ImL,磷源(KH2PO4) 0.1mL,無機(jī)碳源(NaHCO4) 10mL，麥飯石導(dǎo)出液50mL，水(H2O) 100mL，在鹽藻培養(yǎng)劑中接種重量占培養(yǎng)劑20%的藻種，藻種培育5天經(jīng)生長期、對數(shù)生長期和平臺期后用分光光度計測量鹽藻光密度(0D值)，對應(yīng)出鹽藻生物量，測量培養(yǎng)劑氮源(KNO3)低于0.3mL時，完成鹽藻繁殖；
[0021](3) β-胡蘿卜素積累:將鹽藻培育反應(yīng)器內(nèi)安置的光源調(diào)整其光照強(qiáng)度為8000Lx，溫度為35°C，在培養(yǎng)劑中添加氯化鈉(NaCl)使其中鹽的重量百分比濃度達(dá)到3.2%，進(jìn)行協(xié)迫培養(yǎng)3-5天，鹽藻變成黃褐色時，測定鹽藻中β-胡蘿卜素的含量，完成
胡蘿卜素積累，實現(xiàn)鹽藻的培養(yǎng)；
[0022](4)采收、干燥:采收鹽藻并噴霧干燥成藻粉，包裝成袋。
[0023]本實施例涉及的鹽藻生物量測定和β -胡蘿卜素測定按照實施例1的步驟和方法進(jìn)行。
【主權(quán)項】
1.一種鹽藻培養(yǎng)方法，其特征在于具體包括鹽藻繁殖和β -胡蘿卜素積累兩個步驟: (1)鹽藻繁殖:先在鹽藻培育反應(yīng)器內(nèi)安置光源，調(diào)整光照強(qiáng)度為2000—4000LX，溫度為25— 28°C，鹽藻培養(yǎng)劑中的鹽的重量百分比濃度為I一 1.2%，氮源為I一 1.5mL，磷源為0.3mL，無機(jī)碳源為10 — 15mL，在鹽藻培養(yǎng)劑中接種鹽藻，鹽藻培育分別經(jīng)國I一2天的生長期、I一2天的對數(shù)生長期和I一2天的平臺期后分別測量鹽藻培養(yǎng)劑中氮源、磷源和無機(jī)碳源使其分別達(dá)到0.5mL、0.1mL和1mL以下時，進(jìn)行鹽藻生物量測定，使其達(dá)到最高值，完成鹽藻繁殖； (2)β-胡蘿卜素積累:再將鹽藻培育反應(yīng)器內(nèi)所安置的光源調(diào)節(jié)光照強(qiáng)度為7000—9000Lx，溫度為31—35°C，用添加食鹽、KN03、KH2PO4, NaHCOj^]方法調(diào)整鹽藻培養(yǎng)劑，使鹽的含量重量百分比濃度為3.2—3.5%，氮源為0.5mL，磷源為0.lmL，無機(jī)碳源為10mL，再經(jīng)3— 5天培養(yǎng)后鹽藻由深綠色逐漸變成褐色，實現(xiàn)β-胡蘿卜素的積累，然后測定其胡蘿卜素達(dá)到預(yù)期值，完成鹽藻的培養(yǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽藻培養(yǎng)方法，其特征在于鹽藻生物量測定工藝方法是:取ImL鹽藻繁殖階段的鹽藻培養(yǎng)劑，用0.1mL無水酒精麻醉后滴入血球計數(shù)板測量得ImL中微藻絕對值，同時用分光光度計在吸光度A700nm時測定微藻絕對值對應(yīng)的光密度，分別測量5次得5個微藻絕對值和光密度，并按照微藻絕對值和光密度對應(yīng)關(guān)系繪制鹽藻生物量標(biāo)準(zhǔn)曲線，以后只需測定鹽藻光密度即可對應(yīng)得出鹽藻生物量，實現(xiàn)鹽藻生物量的測定。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鹽藻培養(yǎng)方法，其特征在于β-胡蘿卜素測定工藝方法是:取5mLf3 -胡蘿卜素積累階段的鹽藻培養(yǎng)劑，加入一滴重量百分比濃度為20%的氫氧化鈉混勻后以3000r/min的速度離心3分鐘，棄上清液；再加入一滴重量百分比濃度為80%的丙酮水溶液搖勻后離心I分鐘，提取色素，反復(fù)提取至鹽藻培養(yǎng)劑為無色，合并含丙酮提取液定容為25mL混合液，用分光光度計在吸光度A450nm時測定混合液光密度，然后依據(jù)鹽藻生物量測定的對應(yīng)關(guān)系推得鹽藻中胡蘿卜素的值。
【專利摘要】本發(fā)明屬于藻類生物培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種鹽藻培養(yǎng)方法，先將鹽藻培育反應(yīng)器內(nèi)的光照強(qiáng)度和溫度調(diào)整至適宜鹽藻繁殖，在包含鹽、氮源(KNO3)、磷源(KH2PO4)、無機(jī)碳源(NaHCO4)的鹽藻培養(yǎng)劑中接種鹽藻，鹽藻培育經(jīng)生長期、對數(shù)生長期和平臺期后分別測量鹽藻培養(yǎng)劑中氮源、磷源和無機(jī)碳源，使其分別達(dá)到設(shè)定值，進(jìn)行鹽藻生物量測定，完成鹽藻繁殖；調(diào)整光照強(qiáng)度和溫度至適宜β-胡蘿卜素積累，向鹽藻培養(yǎng)劑中分別添加食鹽、KNO3、KH2PO4、NaHCO4，使其達(dá)到設(shè)定值，經(jīng)過培養(yǎng)鹽藻變成褐色時，實現(xiàn)β-胡蘿卜素的積累，完成鹽藻的培養(yǎng)；其培養(yǎng)工藝科學(xué)合理，步驟簡單，性能穩(wěn)定，不受外界環(huán)境影響，產(chǎn)品利用率高。
【IPC分類】C12R1-89, C12N1-12
【公開號】CN104711195
【申請?zhí)枴緾N201510152906
【發(fā)明人】丁河峰, 吳洪星, 徐權(quán)漢
【申請人】丁河峰
【公開日】2015年6月17日
【申請日】2015年4月2日