本發(fā)明屬于植物病原真菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基，具體涉及綠豆粉在誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢上的用途；還涉及一種誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌大量產(chǎn)生分生孢子的培養(yǎng)基及方法。
背景技術(shù)：
：禾谷鐮刀菌(FusariumgraminearumSchw.)是世界上分布廣泛的重要病原菌，其寄主范圍廣，能侵染小谷物禾谷類作物(包括大麥、小麥、黑麥、燕麥和黑小麥)、玉米、水稻、高粱以及多種雜草，在作物不同時(shí)期引起多種不同的病害。其中，在糧食作物中主要引起麥類赤霉病和根、莖基腐病以及玉米穗、莖腐病。禾谷鐮刀菌不僅能引起多種作物病害而造成產(chǎn)量損失和谷物品質(zhì)的下降，更為嚴(yán)重的是禾谷鐮刀菌侵染籽粒后能產(chǎn)生多種對人、畜造成急性或慢性中毒的毒素，對人、畜健康造成威脅。禾谷鐮刀菌腐生能力很強(qiáng)，在土壤中殘留的麥稈、稻樁、玉米稈、豆稈、多種雜草、非禾谷類作物以及闊葉植物種子等植物殘?bào)w上存活，病殘?bào)w上產(chǎn)生的子囊孢子和分生孢子是下一個(gè)生長季的主要初侵染源。禾谷鐮刀菌侵染宿主通常是通過分生孢子進(jìn)行二次侵染，在自然條件下，病害的初侵染源主要來自病菌越冬后在各種殘?bào)w上產(chǎn)生的子囊孢子，在大麥與小麥混栽地區(qū)及東北春麥區(qū)，分生孢子也可成為初侵染源。冬茬作物上，在春季溫暖潮濕的天氣條件下，子囊殼開始形成和發(fā)育成熟并釋放出子囊孢子，孢子釋放后，借助風(fēng)、雨進(jìn)行傳播完成對冬茬作物的侵染并在病部形成大量分生孢子；在夏茬作物上，主要通過分生孢子完成對夏茬作物的侵染和危害。子囊孢子和分生孢子的產(chǎn)生也是病原菌遺傳變異的重要原因，是微生物學(xué)研究的重點(diǎn)，在研究病害的發(fā)生規(guī)律、品種抗性鑒定和防治技術(shù)上，利用分生孢子定量接種是不可缺少的手段。禾谷鐮刀菌在多種培養(yǎng)基上均以營養(yǎng)生長為主，不產(chǎn)生分生孢子，因此多數(shù)以菌絲體形式進(jìn)行病原菌保存，為了菌種的較長時(shí)間保存，需要頻繁轉(zhuǎn)接，而菌種長期在同一培養(yǎng)基中連續(xù)繼代培養(yǎng)，容易引起病原菌的變異及致病力的退化，因此掌握禾谷鐮刀菌大量產(chǎn)生大型分生孢子的培養(yǎng)基及方法是進(jìn)行禾谷鐮刀菌鑒定、長期穩(wěn)定保存，進(jìn)而進(jìn)行病害研究的先決條件。鐮刀菌鑒定手冊中通常用康乃馨葉片水瓊脂培養(yǎng)基(CLA)進(jìn)行大型分生孢子的培養(yǎng)，用于菌種的鑒定和低溫長期保存，但是利用該培養(yǎng)基產(chǎn)孢需要近紫外燈光的誘導(dǎo)，而且有些菌產(chǎn)大型分生孢子堆的數(shù)量少，濃度達(dá)不到菌種保存和接種濃度的要求，而在病原菌接種方面，多采用綠豆湯培養(yǎng)液或鐮刀菌液體培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)產(chǎn)生分生孢子懸浮液，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)產(chǎn)生的大型分生孢子形態(tài)變異較大，不適宜病原菌的鑒定和接種體的保存，而且存在產(chǎn)孢量低的不足，有時(shí)不能滿足接種濃度要求。而通過大型分生孢子堆形成的分生孢子比在培養(yǎng)基上通過菌絲上單個(gè)單瓶梗產(chǎn)生的大型分生孢子在孢子形狀和長度上更一致，適用于菌種的鑒定、保存等。經(jīng)檢索，目前還沒有能使禾谷鐮刀菌大量產(chǎn)生分生孢子、且以大型分生孢子堆的形式產(chǎn)生的培養(yǎng)基。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對目前培養(yǎng)基培養(yǎng)的禾谷鐮刀菌分生孢子產(chǎn)生數(shù)量少、難以滿足病原菌鑒定、菌種保存、接種需要等問題，本發(fā)明目的在于提供一種綠豆粉或綠豆渣在誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢上的應(yīng)用。本發(fā)明另一目的在于提供一種綠豆粉培養(yǎng)基。本發(fā)明第三目的在于提供上述綠豆粉培養(yǎng)基的制備方法。本發(fā)明第四目的在于提供利用上述綠豆粉培養(yǎng)基誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢的方法。本發(fā)明第五目的在于提供一種綠豆渣培養(yǎng)基。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的技術(shù)方案如下：本發(fā)明提供了綠豆粉或綠豆渣在誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌(FusariumgraminearumSchw.)產(chǎn)孢上的應(yīng)用。上述應(yīng)用中所述的綠豆粉的粒徑大小為250μm～1700μm。上述應(yīng)用中所述的綠豆粉，按照如下方法制備：用料理機(jī)將新鮮綠豆打碎，過10目～60目分樣篩，即得粒徑大小為250μm～1700μm的綠豆粉。上述應(yīng)用中所述綠豆渣的粒徑大小為1～2mm。上述應(yīng)用中所述的綠豆渣，按照如下方法制備：將新鮮綠豆洗凈，放入水中，煮沸20min，過濾得煮熟的綠豆，加水用料理機(jī)將煮熟的綠豆打碎，即得綠豆渣。本發(fā)明還提供了一種綠豆粉培養(yǎng)基，其原料組成及其重量比例為：綠豆粉20～80g，瓊脂粉15～25g，蒸餾水1000ml。上述綠豆粉培養(yǎng)基中所述的綠豆粉的粒徑大小為250μm～1700μm。上述綠豆粉培養(yǎng)基中所述的綠豆粉的重量比例優(yōu)選為50～80g；進(jìn)一步優(yōu)選為60g。上述綠豆粉培養(yǎng)基的制備方法，包括按照比例將綠豆粉和瓊脂粉加入到蒸餾水中，攪拌均勻，分裝，121℃高溫滅菌20min，冷卻至室溫。上述綠豆粉培養(yǎng)基在誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌(FusariumgraminearumSchw.)產(chǎn)孢上的應(yīng)用。利用上述綠豆粉培養(yǎng)基誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢的方法，按照5％～7％的體積比比例將禾谷鐮刀菌接種體接種到上述綠豆粉培養(yǎng)基上，然后在16～22℃、自然光條件下培養(yǎng)7～10d，用滅菌蒸餾水洗下培養(yǎng)皿上的大型分生孢子。上述方法中所述的禾谷鐮刀菌接種體為禾谷鐮刀菌孢子懸浮液；所述禾谷鐮刀菌孢子懸浮液中分生孢子的濃度為5×104分生孢子/mL。上述綠豆粉培養(yǎng)基的使用方法，按照比例將綠豆粉、瓊脂粉加入蒸餾水中，攪拌均勻，分裝，121℃高溫滅菌20min，冷卻至室溫，倒入直徑8cm的平皿，每皿培養(yǎng)基15～20mL，培養(yǎng)基平板放置表面干燥后，每皿接種禾谷鐮刀菌接種體1mL，涂勻。本發(fā)明還提供一種綠豆渣培養(yǎng)基：其原料組成成分及其比例為：綠豆渣20～80g，瓊脂粉15～25g，蒸餾水1000ml。上述綠豆渣培養(yǎng)基的制備方法，包括按照比例取新鮮綠豆20～80g，洗凈，放入1000ml水中，煮沸20min，過濾得到煮熟的綠豆，加100mL水用料理機(jī)打碎，得到大小為1～2mm的綠豆渣，加蒸餾水補(bǔ)足1000mL，再加入瓊脂粉20g，攪拌均勻，分裝，121℃濕熱滅菌20min。上述綠豆粉培養(yǎng)基或綠豆渣培養(yǎng)基還可以在誘導(dǎo)黃色鐮刀菌(Fusariumculmorum)或假禾谷鐮刀菌(Fusariumpseudograminearum)產(chǎn)孢上應(yīng)用。與現(xiàn)有的PDA、CLA培養(yǎng)基相比，本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和有益效果：(1)、在本發(fā)明綠豆粉培養(yǎng)基或綠豆渣培養(yǎng)基上禾谷鐮刀菌分生孢子產(chǎn)孢量大，每cm2產(chǎn)孢量可達(dá)到107，比常用的綠豆湯固體培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量約提高10倍，比CLA培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量約提高1000倍；且能產(chǎn)生大量的大型分生孢子堆，有利于大型分生孢子的收集與試驗(yàn)，能夠滿足病原菌鑒定、菌種保存、接種等需要。(2)、本發(fā)明方法簡單，對培養(yǎng)條件要求不高，不需要額外的近紫外燈光的誘導(dǎo)。(3)、本發(fā)明培養(yǎng)基組分簡單，易購易得，成本低。(4)、與液體培養(yǎng)基相比，本發(fā)明培養(yǎng)基能夠產(chǎn)生的大型分生孢子堆和大量分生孢子，易于較長時(shí)間保存，可隨時(shí)為病原菌的擴(kuò)繁提供接種體，而且在病原菌大量擴(kuò)繁過程中，本發(fā)明方法較液體培養(yǎng)方法節(jié)省空間。(5)、本發(fā)明培養(yǎng)基對其他不易產(chǎn)孢鐮刀菌有借鑒作用，用途廣泛。附圖說明圖1為在綠豆粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)的禾谷鐮刀菌大型分生孢子堆的照片。圖2為禾谷鐮刀菌大型分生孢子堆放大5倍的照片。圖3為禾谷鐮刀菌大型分生孢子顯微照片。具體實(shí)施方式下面以具體實(shí)施例來進(jìn)一步詳細(xì)說明本發(fā)明，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此。實(shí)施例1禾谷鐮刀菌在不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢對比試驗(yàn)(一)供試禾谷鐮刀菌菌株1449：為2014年從河北省石家莊趙縣采集到的小麥赤霉病病樣，按照植病研究法上病原真菌分離方法分離得到，初分離物經(jīng)過單孢分離培養(yǎng)獲得純培養(yǎng)菌株，經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法鑒定為禾谷鐮刀菌(FusariumgraminearumSchw.)，該菌株保存于河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所真菌病害實(shí)驗(yàn)室。(二)供試培養(yǎng)基及其制備：(1)PDA培養(yǎng)基：將洗凈去皮后的馬鈴薯切塊200g，加水1000mL，在沸水中煮半小時(shí)，用紗布過濾，取馬鈴薯汁，加水補(bǔ)足1000mL，加入葡萄糖和瓊脂粉各20g，攪拌均勻，分裝，121℃濕熱滅菌20min。(2)CLA培養(yǎng)基：在培養(yǎng)皿中放入滅菌康乃馨葉片(約1片/2mL瓊脂)，然后在培養(yǎng)皿中倒入滅菌的2％水瓊脂培養(yǎng)基。其中滅菌康乃馨葉片的制備方法：剪取未噴施過殺蟲和殺菌劑的新鮮康乃馨葉片，用自來水沖洗干凈，剪成5～8mm的小段，在70℃烘箱中烘3～4h直到葉片干燥但不失綠，用γ-射線滅菌，4℃保存。(3)2％綠豆湯培養(yǎng)液：稱取新鮮綠豆20g，洗凈，放入1000mL純凈水中煮沸20min，過濾去除綠豆，濾液加水補(bǔ)足1000mL，分裝，121℃濕熱滅菌20min。(4)2％綠豆湯培養(yǎng)基：稱取新鮮綠豆20g，洗凈，放入1000mL純凈水中煮沸20min，過濾去除綠豆，濾液加水補(bǔ)足1000mL，加入瓊脂粉20g，攪拌均勻，分裝，121℃濕熱滅菌20min。(5)2％綠豆渣培養(yǎng)基：稱取新鮮綠豆20g，洗凈，放入1000mL純凈水中煮沸20min，過濾出已煮熟綠豆，加100mL水用料理機(jī)打碎，得到粒徑大小為1～2mm的綠豆渣，加純凈水補(bǔ)足1000mL，加入瓊脂粉20g，攪拌均勻，分裝，121℃濕熱滅菌20min。(6)2％綠豆粉培養(yǎng)基：取新鮮綠豆用料理機(jī)打碎，過10目分樣篩，即得粒徑小于1770μm的綠豆粉，稱取綠豆粉20g、瓊脂粉20g加入1000ml蒸餾水中，攪拌均勻，分裝，121℃濕熱滅菌20min。(三)試驗(yàn)方法：(1)將活化后的供試禾谷鐮刀菌菌盤分別接種到PDA、CLA培養(yǎng)基上，然后置于22～24℃、365nm近紫外光和日光燈12h光暗交替培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10d，再用無菌水洗下培養(yǎng)皿上的大型分生孢子，鏡檢計(jì)數(shù)產(chǎn)孢量。(2)將5片活化后的供試禾谷鐮刀菌菌盤放入2％綠豆湯培養(yǎng)液中，在25℃、150rpm條件下振蕩培養(yǎng)3～5d，用滅菌水調(diào)整分生孢子懸浮液的濃度至5×104分生孢子/mL，分別取1mL孢子懸浮液涂于放置表面干燥的2％綠豆粉培養(yǎng)基、2％綠豆渣培養(yǎng)基或2％綠豆湯培養(yǎng)基平板上，置于16～22℃、自然光條件下培養(yǎng)10d，用無菌水洗下培養(yǎng)皿上的大型分生孢子，鏡檢計(jì)數(shù)產(chǎn)孢量。(3)對在不同培養(yǎng)基上培養(yǎng)的禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢量進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié)果(見表1)在2％綠豆渣培養(yǎng)基或2％綠豆粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)的禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢量均能達(dá)到106個(gè)大型分生孢子/cm2，產(chǎn)孢量比CLA培養(yǎng)基提高1000倍，比2％綠豆湯培養(yǎng)基提高10倍，其產(chǎn)孢量顯著高于PDA、CLA和2％綠豆湯培養(yǎng)基；而且本發(fā)明在2％綠豆粉培養(yǎng)基或2％綠豆渣培養(yǎng)基上可以快速產(chǎn)生由大型分生孢子聚生形成的橘黃色大型分生孢子堆(見圖1～圖3)，初見大型分生孢子堆時(shí)間比CLA早4d，比2％綠豆湯培養(yǎng)基提早2d。說明在本發(fā)明綠豆粉培養(yǎng)基和綠豆渣培養(yǎng)基上禾谷鐮刀菌的產(chǎn)孢量明顯高于其他培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量大，初見大型分生孢子堆時(shí)間短，效果好；并且與其他培養(yǎng)基相比，本發(fā)明綠豆粉培養(yǎng)基或綠豆渣培養(yǎng)基制備方法簡單、成本低。表1在不同培養(yǎng)基上禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢量對比試驗(yàn)結(jié)果培養(yǎng)基接菌方式產(chǎn)孢量(×105/cm2)初見分生孢子堆(天)PDA菌盤0.0aCLA菌盤0.01a72％綠豆湯培養(yǎng)基孢子懸浮液0.9a52％綠豆渣培養(yǎng)基孢子懸浮液11.0b32％綠豆粉培養(yǎng)基孢子懸浮液10.4b3實(shí)施例2不同粒徑綠豆粉誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢效果對比試驗(yàn)(一)供試培養(yǎng)基：不同粒徑2％綠豆粉培養(yǎng)基的配制：將新鮮綠豆用料理機(jī)打碎，然后分別過10目、20目、30目、60目的分樣篩，分別得到粒徑大小為<1770μm、830～1770μm、550～830μm、250～550μm和0～250μm五種不同粒徑的綠豆粉，按照實(shí)施例1的方法配制不同粒徑的2％綠豆粉培養(yǎng)基。(二)試驗(yàn)方法：挑取實(shí)施例1中綠豆粉培養(yǎng)基或綠豆渣培養(yǎng)基上產(chǎn)生的大型分生孢子堆，用滅菌水調(diào)整孢子懸浮液濃度至5×104分生孢子/mL，取孢子懸浮液1mL分別涂于放置干燥后的步驟(一)制備的不同粒徑2％綠豆粉培養(yǎng)基平板上，置于16～22℃、自然光條件下培養(yǎng)10d，用無菌水洗下培養(yǎng)皿上的大型分生孢子，鏡檢計(jì)數(shù)產(chǎn)孢量，并進(jìn)行差異顯著性分析。表2禾谷鐮刀菌在不同粒徑綠豆粉培養(yǎng)基產(chǎn)孢量對比試驗(yàn)結(jié)果篩網(wǎng)目數(shù)粒徑產(chǎn)孢量(×106/cm2)水平差異顯著性分析(P＝0.05)60目剩余0～250μm0.46a60250～550μm1.05b30550～830μm1.09b20830～1770μm0.91b10<1770μm1.04b結(jié)果(見表2)除0～250μm粒徑綠豆粉培養(yǎng)基產(chǎn)孢量顯著少于其他粒徑綠豆粉培養(yǎng)基外，在250～550μm、550～830μm、830～1770μm和<1770μm四種不同粒徑的2％綠豆粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)的禾谷鐮刀菌的產(chǎn)孢量分別達(dá)到1.05×106分生孢子/cm2、1.09×106分生孢子/cm2和0.91×106分生孢子/cm2，1.04×106分生孢子/cm2。說明不同粒徑綠豆粉配制的培養(yǎng)基對誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢量影響不大，本發(fā)明綠豆粉培養(yǎng)基中綠豆粉的粒徑可以為250～1770μm，但是以過10目分樣篩的粒徑<1770μm的綠豆粉培養(yǎng)基使用最方便。實(shí)施例3不同綠豆粉濃度的培養(yǎng)基誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢量對比試驗(yàn)(一)供試培養(yǎng)基：2％～8％綠豆粉培養(yǎng)基：制備方法同實(shí)施例1，綠豆粉的加入量分別為20g、30g、40g、50g、60g、70g和80g。(二)試驗(yàn)方法：挑取實(shí)施例1中綠豆粉培養(yǎng)基或綠豆渣培養(yǎng)基上產(chǎn)生的大型分生孢子堆，用滅菌水調(diào)整孢子懸浮液濃度至5×104分生孢子/mL，取孢子懸浮液1mL分別涂于放置干燥后的步驟(一)制備的2％～8％綠豆粉培養(yǎng)基平板上，置于16～22℃、自然光條件下培養(yǎng)10d，用無菌水洗下培養(yǎng)皿上的大型分生孢子，鏡檢計(jì)數(shù)產(chǎn)孢量，并進(jìn)行差異顯著性分析。結(jié)果(見表3)在2％～8％綠豆粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)的禾谷鐮刀菌的產(chǎn)孢量均能達(dá)到106分生孢子/cm2，其中以綠豆粉濃度為6％、7％、8％的綠豆粉培養(yǎng)基產(chǎn)孢量較大，分別為1.00×107分生孢子/cm2、1.61×107分生孢子/cm2和2.34×107分生孢子/cm2，顯著高于2％～5％綠豆粉培養(yǎng)基的產(chǎn)孢量。說明2％～8％綠豆粉培養(yǎng)基都可以用于誘導(dǎo)禾谷鐮刀菌產(chǎn)孢，且隨著培養(yǎng)基濃度增加產(chǎn)孢量加大，但是7％、8％綠豆粉培養(yǎng)基濃度太大，倒平板操作過程中容易造成培養(yǎng)基的浪費(fèi)，因此，6％綠豆粉培養(yǎng)基性價(jià)比最高。表3不同濃度綠豆粉培養(yǎng)基對產(chǎn)孢量的影響培養(yǎng)基產(chǎn)孢量(×106/cm2)水平差異顯著性分析(P＝0.05)2％綠豆粉1.95a3％綠豆粉3.13b4％綠豆粉3.68b5％綠豆粉8.26c6％綠豆粉10.04d7％綠豆粉16.07e8％綠豆粉23.39f當(dāng)前第1頁1 2 3