一株枯草芽孢桿菌及其在防治禾谷鐮刀菌方面的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株枯草芽孢桿菌及其在防治禾谷鐮刀菌方面的應(yīng)用。本發(fā)明公開的一株枯草芽孢桿菌（Bacillus?subtilis），其保藏編號(hào)為CGMCC?No.7621。作為小麥赤霉病的生物防治材料，無論開發(fā)新的生物農(nóng)藥或者生物防治菌劑，該菌都具有很好的應(yīng)用前景。
【專利說明】一株枯草芽孢桿菌及其在防治禾谷鐮刀菌方面的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一株枯草芽孢桿菌及其在防治禾谷鐮刀菌方面的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)是禾本科作物的重要病原菌之一,可引起麥類赤霉病(Fusarium Head Blight，F(xiàn)HB)，禾谷鐮刀菌為限制小麥產(chǎn)量的一個(gè)主要因素(Dubin, 1997)。我國(guó)氣候條件十分有利于麥類赤霉病的發(fā)生，長(zhǎng)江中下游地區(qū)常年病害造成產(chǎn)量損失10%-15%，大流行年份減產(chǎn)近50%(黃昌等，2000)。由于全球氣候變暖以及秸桿還田、免耕栽培等耕作制度改變的影響，我國(guó)麥類赤霉病的發(fā)生區(qū)域由長(zhǎng)江流域迅速向西北、華北擴(kuò)展(張昊，2011)，特別是在2008、2010和2012年，全國(guó)麥類赤霉病發(fā)生十分嚴(yán)重，造成了嚴(yán)重的產(chǎn)糧損失和不良的社會(huì)影響，嚴(yán)重威脅我國(guó)糧食安全。
[0003]禾谷鐮刀菌產(chǎn)生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(D0N，3，7，15三羥基-12，13環(huán)氧單端孢霉-9烯-8酮)是存在于赤霉病菌感染麥粒中的主要天然毒素之一。DON已被認(rèn)定為最危險(xiǎn)的自然發(fā)生食品污染物之一，被列入國(guó)際研究的優(yōu)先地位(Larsen et al.，2004) AON可致人免疫力下降、貧血、頭痛、腹痛、惡心；致動(dòng)物拒食、生長(zhǎng)延滯和流產(chǎn)(Rocha et al.，2005 ；Sobrova et al.，2010 ;Pestka，2010)。DON廣泛存在并大量污染小麥及其制品，對(duì)人畜構(gòu)成很大危害，嚴(yán)重威脅我國(guó)食品安全。
[0004]因此，加強(qiáng)禾谷鐮刀菌防控研究已成為保障我國(guó)糧食安全和食品安全的迫切需求。
[0005]多年來對(duì)麥類赤霉病防治主要依靠化學(xué)農(nóng)藥，但隨著化學(xué)農(nóng)藥帶來的環(huán)境問題，加之多年用藥已導(dǎo)致病原 菌抗藥性禾谷鐮刀菌菌株的出現(xiàn)(Changjun Chen et al.,2007),使防治難度加大。雖然在赤霉病抗性品質(zhì)方面國(guó)內(nèi)外投入大量的精力開展相關(guān)研究，但至今尚無理想的高抗小麥品種(李正輝等，2007)。
[0006]生物防治不僅可降低對(duì)環(huán)境的影響，還不易產(chǎn)生抗藥性，相關(guān)理論和技術(shù)的研究日益為人們所關(guān)注?？莶菅挎邨U菌營(yíng)養(yǎng)簡(jiǎn)單，在自然界中廣泛存在，對(duì)人畜無毒無害，不污染環(huán)境，能產(chǎn)生多種抗菌素和酶，具有廣譜抗菌活性和極強(qiáng)的抗逆能力，較其他微生物更具有開發(fā)為生物防控菌劑的潛力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一株枯草芽孢桿菌及其在防治禾谷鐮刀菌方面的應(yīng)用。
[0008]本發(fā)明提供的一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，其保藏編號(hào)為CGMCCN0.7621。
[0009]上述菌株在生物防治鐮刀菌引起的植物病害中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0010]上述應(yīng)用中，所述鐮刀菌為禾谷鐮刀菌。
[0011 ] 上述任一所述的應(yīng)用中，所述病害為赤霉病或穗腐病或根腐病。
[0012]上述任一所述的應(yīng)用中，所述植物為谷物；所述谷物為麥類作物或玉米；所述麥類作物具體為小麥。
[0013]上述菌株在制備抑制鐮刀菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0014]上述應(yīng)用中，所述的鐮刀菌為禾谷鐮刀菌。
[0015]一種防治鐮刀菌引起的植物病害的方法也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，該方法是在植物生長(zhǎng)過程中進(jìn)行噴霧處理；所述噴霧為上述枯草芽孢桿菌的菌懸液或發(fā)酵液或代謝產(chǎn)物。
[0016]上述方法中，所述生長(zhǎng)過程為揚(yáng)花期。
[0017]上述任一所述的方法中，所述鐮刀菌為禾谷鐮刀菌。
[0018]上述任一所述的方法中，所述病害為赤霉病或穗腐病或根腐病。
[0019]上述任一所述的方法中，所述植物為谷物；所述谷物為麥類作物或玉米；所述麥類作物具體為小麥。
[0020]本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌不僅在平板培養(yǎng)時(shí)可高效抑制禾谷鐮刀菌，而且在田間小區(qū)實(shí)驗(yàn)中其防治效果高達(dá)77.4%，是多菌靈1000倍稀釋液防治效果的2倍，即防治效果明顯優(yōu)于目前普遍施用的多菌靈。作為小麥赤霉病的生物防治材料，無論開發(fā)新的生物農(nóng)藥或者生物防治菌劑，該菌都具有很好的應(yīng)用前景。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0021]圖1為對(duì)峙培養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)。
【具體實(shí)施方式】
[0022]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0023]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0024]NB液體培養(yǎng)基:由溶劑和溶質(zhì)組成；溶質(zhì)為蛋白胨、牛肉膏和NaCl，溶劑為水；蛋白胨在NB液體培養(yǎng)基中的濃度為1%，牛肉膏在NB液體培養(yǎng)基中的濃度為0.3%，NaCl在NB液體培養(yǎng)基中的濃度為0.5%，所述％均為質(zhì)量體積百分比(g/100ml)。
[0025]NA固體培養(yǎng)基:在NB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂(瓊脂與液體培養(yǎng)基的比例為1.5g:100ml)，得到NA固體培養(yǎng)基。
[0026]PDA培養(yǎng)基:馬鈴薯200g，加入少量水煮20min，三層紗布過濾，取濾液用水定容至1L,加入20g葡萄糖，15g瓊脂，121°C高壓滅菌20min。
[0027]綠豆湯培養(yǎng)基:綠豆10g，加入少量水煮20min，三層紗布過濾，取濾液用水定容至1L,分裝后121°C高壓滅菌20min。
[0028]禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum) FGl在文獻(xiàn)“楊慧勇，李飛鳳，陸瓊嫻，徐劍宏，史建榮.拮抗菌株AFR0406對(duì)小麥赤霉病菌和紋枯病菌的生物活性測(cè)定.江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006 (06)，142-144.”中公開過，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所獲得。
[0029]小麥?zhǔn)?28品種在文獻(xiàn)“孫志軍，楊曉麗，張輝，張廣輝.小麥新品種石新828選育過程及高產(chǎn)栽培技術(shù).現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2011 (09),96-97.”中公開過，公眾可從中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)廣品加工研究所獲得。
[0030]實(shí)施例1、菌的分離與 鑒定
[0031]一、菌的分離[0032](-)2011年10月，在超凈工作臺(tái)中，將京郊采集的絲瓜花藥放在無菌蒸餾水中振蕩15分鐘制備菌懸液,搖床轉(zhuǎn)速為180rpm。
[0033](二)將菌懸液用無菌蒸餾水進(jìn)行濃度梯度稀釋后涂布在NA培養(yǎng)基平板上，30°C條件下培養(yǎng)24小時(shí)，菌落布滿整個(gè)平板，用接種環(huán)挑取平板上形態(tài)、大小、顏色、透明度不同的菌株平板劃線純化，點(diǎn)接純化后的菌株應(yīng)用于禾谷鐮刀菌對(duì)峙培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。將得到的對(duì)禾谷鐮刀菌拮抗能力最強(qiáng)的一株菌命名為SG6。
[0034]二、鑒定
[0035](一)按照“伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)”(第八版)和“常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)”(東秀珠，蔡妙英等編著，北京:科學(xué)出版社，2001.2)中描述的方法，對(duì)菌株SG6進(jìn)行形態(tài)特征、培養(yǎng)特性和生理生化特性鑒定，具體結(jié)果如下:
[0036]菌體的形態(tài)特征:
[0037]呈桿狀，周生鞭毛，革蘭氏陽(yáng)性。
[0038]培養(yǎng)特性:
[0039]菌落呈污白色或微黃色，表面粗糙不透明，菌落軟而濕潤(rùn)、質(zhì)地均勻。
[0040]生理生化特性:
[0041]葡萄糖:+ ;木糖:+ ；L-阿拉伯糖:+ ;甘露醇:+ ;乳糖:_ ;發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)氣:+ ;利用檸檬酸鹽:+ ;50°C生長(zhǎng):+ ；pH5.7生長(zhǎng):+ ；7%NaCl生長(zhǎng):+ ;淀粉水解:+ ;分解酪素:+ ;硝酸鹽還原:+。
[0042](二)16S rDNA 試驗(yàn)
[0043]提取SG6的總DNA，以其為模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到長(zhǎng)度約為1.4kb的擴(kuò)增產(chǎn)物，將擴(kuò)增產(chǎn)物回收并進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得的序列如SEQ ID N0.1所
/Jn o
[0044]根據(jù)Gen-Bank 序列同源性比較，菌株 SG6 與 Bacillus subtilis strainCICC10163 (GenBank 登錄號(hào) DQ005496.1)同源性為 100%，與 Bacillus amyloliquefaciensM20J (GenBank登錄號(hào)AB735995.1)同源性為100%，初步判定該菌為芽孢桿菌屬細(xì)菌(Bacillus sp.)o
[0045]基于以上特征，將菌株SG6鑒定為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。該菌株已于2013年5月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC，地址:北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101)，保藏號(hào)為 CGMCC N0.7621。
[0046]實(shí)施例2、枯草芽孢桿菌SG6對(duì)禾谷鐮刀菌的拮抗作用
[0047]采用對(duì)峙培養(yǎng)法檢測(cè)枯草芽孢桿菌SG6對(duì)禾谷鐮刀菌的拮抗。
``[0048]—、用直徑為5mm的打孔器在培養(yǎng)好的病原真菌禾谷鐮刀菌(Fusariumgraminearum) FGl菌落邊緣打取菌盤，用滅菌的牙簽將菌盤挑入PDA平板中心。
[0049]二、在距PDA平板中心25mm處四點(diǎn)劃線接種相同體積和濃度的SG6，以僅接種禾谷鐮刀菌菌盤的PDA平板為對(duì)照組，28°C培養(yǎng)4-5天，觀察有無抑菌帶形成。每個(gè)組做三個(gè)平行。結(jié)果如圖1和表1所示。
[0050]圖1`中，1:對(duì)照組；2:SG6組
[0051]圖1表明，SG6對(duì)禾谷鐮刀菌有很強(qiáng)的抑制效果。[0052]表1培養(yǎng)5天后SG6對(duì)禾谷鐮刀菌的抑制作用
[0053]
【權(quán)利要求】
1.一株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtil is)，其保藏編號(hào)為CGMCC N0.7621。
2.權(quán)利要求1所述的菌株在生物防治鐮刀菌引起的植物病害中的應(yīng)用。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于:所述鐮刀菌為禾谷鐮刀菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的應(yīng)用，其特征在于:所述病害為赤霉病或穗腐病或根腐病。
5.根據(jù)權(quán)利要求2-4任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物為谷物；所述谷物為麥類作物或玉米；所述麥類作物具體為小麥。
6.權(quán)利要求1所述的菌株在制備抑制鐮刀菌的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
7.一種防治鐮刀菌引起的植物病害的方法，是在植物生長(zhǎng)過程中進(jìn)行噴霧處理；所述噴霧為權(quán)利要求1所述的枯草芽孢桿菌的菌懸液或發(fā)酵液或代謝產(chǎn)物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于:所述鐮刀菌為禾谷鐮刀菌。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于:所述病害為赤霉病或穗腐病或根腐病。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一所述的方法，其特征在于:所述植物為谷物；所述谷物為麥類作物或玉米；所述麥類作 物具體為小麥。
【文檔編號(hào)】A01P3/00GK103497916SQ201310438739
【公開日】2014年1月8日 申請(qǐng)日期:2013年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2013年9月24日
【發(fā)明者】劉陽(yáng), 趙月菊, 邢福國(guó), 周露, 王龑 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所