專利名稱：一對用于快速檢測、鑒別禾谷絲核菌的引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一對用于PCR的引物，能夠快速檢測、鑒別引起小麥紋枯病的禾谷絲核菌(lihizoctoniacerealis)，屬植物保護領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
由絲核菌侵染小麥引起的小麥紋枯病(sharp eyespot ofwheat)，是一種世界性小麥病害，幾乎遍布世界各溫帶小麥種植區(qū)。該病在我國冬麥區(qū)普遍發(fā)生，并已成為黃淮平原及長江流域麥區(qū)的主要病害之一。國內(nèi)許多學者對小麥紋枯病病原進行了較深入的研究，表明在我國小麥紋枯病的病原主要是禾谷絲核菌(Miizoctoniacerealis VanderHoeven)，屬雙核絲核菌的AG-D融合群，其有性型為擔子菌門的禾谷角擔菌 Ceratobasidium cereale Murray and Burpee)。從小麥紋枯病病斑上偶爾也能分離至Ij多核的立枯絲核菌(Miizoctonia solani Kilhn)，但其致病力極弱。禾谷絲核菌是一種土傳病原真菌，與其它一些土傳真菌如立枯絲核菌 (R. solani)、及能夠引起小麥全蝕病的小麥頂囊殼菌(Gaeumarmomyces graminis)、引起莖基褐腐的小麥根腐離蠕孢(Bipolarissorokiniana)、鐮孢菌(Fusarium spp.)等較難區(qū)分。傳統(tǒng)的病原菌的鑒定需進行病原菌的分離、培養(yǎng)、形態(tài)觀察、菌絲融合鑒定及分子生物學檢測，耗時耗力。利用本發(fā)明提出的引物，只需一次PCR反應即可特異性區(qū)分禾谷絲核菌，在保證靈敏性和特異性的前提下，簡化了操作，節(jié)省了成本。同時，對特定田塊中土壤總 DNA的檢測可用以判斷該田塊土壤中是否含有禾谷絲核菌。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供用于小麥紋枯病菌禾谷絲核菌特異性檢測的引物序列，并進一步給出了應用該引物的PCR檢測方法。1、引物設計根據(jù)小麥紋枯病菌禾谷絲核菌菌株R0301的β -tubulin基因序列(GenBank登錄號JF819943，JF819944)設計特異性引物，引物序列如下RTub1:5' -GAGGGAAATCGTTAACATCC-3‘RTub6 5' -TGCCTTCCAAAAAGCCTCG-3‘引物擴增目的核酸條帶的大小為236bp。2、真菌總DNA提取真菌菌絲的總DNA提取采用“植物基因組DNA快速提取試劑盒”購自廣東東盛生物科技有限公司(網(wǎng)址:http://www. dongshengbio. com,電話:020_87791；356，產(chǎn)品貨號 Nl 192)，具體操作參照產(chǎn)品說明書。3、土壤中微生物總DNA提取土壤中微生物總DNA提取采用美國Μ0ΒΙ0公司(網(wǎng)址http://www. mobio. com)的強力土壤DNA提取試劑盒(PowerSoil DNA Isolation Kit)，購自北京澤平科技有限責任公司(網(wǎng)址:http://www.bjzeping. com，定購電話:010_51觀8208)，具體操作參照產(chǎn)品說明書。4、聚合酶鏈式反應(PCR)以提取的真菌總DNA或土壤中微生物總DNA為模板，進行PCR擴增，反應體系包括
權(quán)利要求
1.一對小麥紋枯病菌禾谷絲核菌快速檢測鑒別的引物，其核苷酸序列為 RTubl 5' -GAGGGAAATCGTTAACATCC-3‘RTub6 5 ‘ -TGCCTTCCAAAAAGCCTCG-3‘
2.一種檢測小麥紋枯病菌禾谷絲核菌的方法，該方法以樣品總DNA為模板，利用權(quán)力要求1所述引物進行PCR擴增，反應結(jié)束后用瓊脂糖凝膠檢測擴增產(chǎn)物，根據(jù)特異性擴增的 DNA片段判定結(jié)果。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的快速檢測鑒別小麥紋枯病菌禾谷絲核菌的方法，其特征在于 PCR擴增中的退火溫度為58°C。
4.權(quán)力要求1所述引物在禾谷絲核菌檢測中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開了一對快速檢測、鑒別小麥紋枯病菌禾谷絲核菌的專用引物，還進一步提供了利用該引物的檢測方法，屬植物保護領(lǐng)域。本發(fā)明所提供的用于禾谷絲核菌檢測、鑒別的引物，是根據(jù)禾谷絲核菌的β-tubulin基因序列設計的兩條引物Rtub1，Rtub6。本發(fā)明所提供的檢測禾谷絲核菌的方法，是以待測物的基因組DNA為模板，用由Rtub1和Rtub6組成的一對引物進行PCR擴增，如擴增產(chǎn)物中具有236bp的核苷酸條帶，則該待測物中含有禾谷絲核菌。本發(fā)明引物特異性好，檢測方法快速、簡便、準確并且靈敏度高，不僅可以應用于菌株的檢測鑒定，還可應用于田間土壤中病菌的直接檢測。
文檔編號C12Q1/68GK102181562SQ20111011968
公開日2011年9月14日 申請日期2011年5月10日 優(yōu)先權(quán)日2011年5月10日
發(fā)明者孫海燕, 張愛香, 李偉, 郭英鵬, 陳懷谷 申請人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學院