專利名稱：一種蘋果蠹蛾鑒定引物及鑒定方法與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種蘋果蠹蛾鑒定引物及利用該特異性鑒定引物對待鑒定樣品進(jìn)行 快速鑒定識別蘋果蠹蛾的方法，本發(fā)明還涉及上述蘋果蠹蛾鑒定引物在區(qū)分蘋果蠹蛾、桃 小食心蟲、梨小食心蟲和李小食心蟲上的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
Cydia pomonella L.Laspeyresia Pomonolla L.，f谷禾爾H/J、· 蛾，屬鱗翅目，卷蛾科，主要危害蘋果、梨、沙果、海棠、李、桃、山楂等多種果樹，是仁果和核 果類果樹的毀滅性害蟲，屬世界性檢疫有害生物。該蟲以幼蟲蛀果為害，造成大量蟲果，嚴(yán) 重影響果實(shí)的品質(zhì)；幼蟲還有轉(zhuǎn)果危害的習(xí)性，導(dǎo)致果實(shí)采收前大量落果和腐爛，幼蟲的蛀 果率通常在50%左右，嚴(yán)重時可達(dá)70% -100%。蘋果蠹蛾原產(chǎn)歐洲東南部，現(xiàn)已遍及全世 界69個國家和地區(qū)。50年代，該蟲于我國新疆被發(fā)現(xiàn)；80年代中期已進(jìn)入甘肅省敦煌和 酒泉地區(qū)；2006年進(jìn)入山丹，且有進(jìn)一步向東擴(kuò)展的趨勢。如果蘋果蠹蛾蔓延到陜西、山東 等蘋果大省，我國的蘋果出口將會受到限制，經(jīng)濟(jì)損失將會極其嚴(yán)重。因此，進(jìn)一步提高對 蘋果蠹蛾的識別、鑒定能力對于防止外來入侵害蟲蘋果蠹蛾在我國進(jìn)一步擴(kuò)展具有重要意 義，而蘋果蠹蛾的快速鑒定方法也成為防止蘋果蠹蛾進(jìn)一步入侵的重要手段。杉匕小食心蟲 Carposina sasakii、梨小食心蟲 Grapholitha molestaBusck 禾口李小 食心蟲Grapholita funebrana為我國常見的3種食心蟲，此3種食心蟲的低齡幼蟲與蘋果 蠹蛾幼蟲在外部形態(tài)上非常相似，沒有顯著差異。目前，我國檢疫部門對蘋果蠹蛾的分類鑒 定主要是以老熟幼蟲或成蟲的外部形態(tài)特征作為依據(jù)。但在口岸實(shí)際檢疫工作中，截獲的 往往是低齡幼蟲或卵，通常的作法是對其進(jìn)行室內(nèi)飼養(yǎng)待獲得老熟幼蟲后再進(jìn)行鑒定，這 樣不僅延長了進(jìn)出口物品的通關(guān)時間，而且增加了檢疫人員的工作強(qiáng)度。因此對蘋果蠹蛾 進(jìn)行準(zhǔn)確快速的鑒定，無論是在口岸檢疫上還是在防治上都具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的在于提供一種蘋果蠹蛾鑒定引物、使用該鑒定引物鑒定蘋果蠹蛾的方 法及該鑒定引物在區(qū)分蘋果蠹蛾、桃小食心蟲、梨小食心蟲和李小食心蟲上的應(yīng)用。本發(fā)明首先提供了一種蘋果蠹蛾鑒定引物，所述鑒定引物的序列為引物 1F:5' -ATTACCCCCATCTATTATACTT-3‘，引物 1R 5 ‘ -TGGTAATGATAAAAGAAGTAAAAGAGC-3 ‘，該引物能夠擴(kuò)增出一條289bp的片段。本發(fā)明利用COI通用引物對采自全國不同 地區(qū)的蘋果蠹蛾、桃小食心蟲、梨小食心蟲和李小食心蟲樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測序得到長度 為502bp的序列，將4種食心蟲的COI序列用CLUSTALX軟件進(jìn)行對比，找出蘋果蠹蛾與其 它3種食心蟲的差異位點(diǎn)，利用Primer5. O軟件設(shè)計(jì)引物，并利用Blast程序檢驗(yàn)引物特異 性，從而設(shè)計(jì)出針對蘋果蠹蛾的特異性鑒定引物。來自全國10個地區(qū)的蘋果蠹蛾樣本在使 用上述引物F/R時均能擴(kuò)增出289bp的明亮條帶，而桃小食心蟲、梨小食心蟲和李小食心蟲樣本在使用上述弓I物時則不能擴(kuò)增出條帶。
本發(fā)明還提供了一種使用上述蘋果蠹蛾鑒定引物鑒定蘋果蠹蛾的方法，包括以下 步驟(a).待鑒定樣品DNA模板的提取；(b).使用權(quán)利要求1所述蘋果蠹蛾鑒定引物對模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(c).電泳檢測有無289bp條帶。作為優(yōu)選，上述鑒定蘋果蠹蛾的方法，步驟(a)中，待鑒定樣品DNA模板的提取方 法為鹽析法。作為優(yōu)選，上述鑒定蘋果蠹蛾的方法，步驟(a)中，所述鹽析法包括以下步驟(1).酒精保存的待鑒定樣品，除去酒精后，晾干；(2).晾干的樣本轉(zhuǎn)移至裝有提取液的離心管中充分研磨；(3).將勻菜移至60 70°C水浴15 30min ；(4).在勻漿中加入NaAcJKS ；(5).冰浴后的混合液離心；(6).上青液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入等體積異丙醇后，離心，棄上清液；(7).向留有沉淀的離心管中加入70%乙醇洗滌DNA，離心，棄上清；(8).步驟(7)重復(fù)1 2次；(9).自然晾干后，向離心管中加入無菌水溶解DNA，冷凍保存。作為優(yōu)選，上述鑒定蘋果蠹蛾的方法，步驟⑷中，所述NaAC為8mol/I的冷NaAc， 冰浴時間10 20min ；步驟(9)中，所述冷凍保存的溫度是_20°C。作為優(yōu)選，上述鑒定蘋果蠹蛾的方法，步驟(2)中，所述提取液由0. 2M蔗糖、0. IM Tris,0. IM NaCl.O. 05M EDTA、0. 5% SDS 配制成，pH8. 5 9. 5。作為優(yōu)選，上述鑒定蘋果蠹蛾的方法，步驟(5)和(6)中，所述離心于4°C下，以 10000rp/min的速度離心15 20min ；步驟(7)中，所述離心于4°C下，以10000rp/min的 速度離心4 6min。作為優(yōu)選，上述鑒定蘋果蠹蛾的方法，步驟(b)中，所述PCR擴(kuò)增的條件為常規(guī)PCR 體系，退火溫度為55°C 57°C，退火時間為30s。作為優(yōu)選，上述鑒定蘋果蠹蛾的方法，步驟(C)中，所述電泳檢測為1 1. 5% (質(zhì) 量百分比)瓊脂糖凝膠電泳檢測。作為優(yōu)選，上述鑒定蘋果蠹蛾的方法，上述電泳檢測利用紫外光檢測電泳結(jié)果。本發(fā)明還進(jìn)一步提供了上述蘋果蠹蛾鑒定引物在區(qū)分蘋果蠹蛾、桃小食心蟲、梨 小食心蟲和李小食心蟲上的應(yīng)用。本發(fā)明提供的蘋果蠹蛾鑒定引物結(jié)構(gòu)簡單，對蘋果蠹蛾的目的片段具有良好的擴(kuò) 增效果；利用該特異性引物鑒定區(qū)分蘋果蠹蛾、桃小食心蟲、梨小食心蟲和李小食心蟲時， 快速簡便，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確，PCR反應(yīng)為常規(guī)條件，成功率高；實(shí)驗(yàn)結(jié)果以電泳圖的形式呈現(xiàn)， 僅根據(jù)289bp條帶的有無，即可對樣本進(jìn)行鑒定，結(jié)果清晰明了，不需對低齡幼蟲或卵進(jìn)行 室內(nèi)飼養(yǎng)至老熟幼蟲后再進(jìn)行鑒定。本發(fā)明提供的蘋果蠹蛾鑒定引物及利用該引物鑒定蘋 果蠹蛾應(yīng)用到口岸實(shí)際檢疫工作中，不僅能大大縮短進(jìn)出口物品的通關(guān)時間，而且還能降 低檢疫人員的工作強(qiáng)度。


圖1為蘋果蠹蛾特異引物對采集自我國不同地區(qū)的10份蘋果蠹蛾樣本總DNA的 擴(kuò)增結(jié)果。圖1中，M 為 marker ；1-10依次為采集自甘肅張掖、酒泉、敦煌，新疆哈密、烏魯木齊、庫爾勒、喀什、奎 屯、精河、伊犁的蘋果蠹蛾樣本；11-15依次為采集自甘肅平?jīng)?、張掖，陜西楊凌、鳳縣，遼寧沈陽的桃小食心蟲樣 本；16-19依次為采集自甘肅張掖，新疆烏魯木齊、喀什，陜西楊凌的梨小食心蟲樣 本；20-22依次為采集自新疆烏魯木齊、奎屯、喀什的李小食心蟲樣本。序列表說明 序列表1為甘肅、新疆兩省6個地區(qū)蘋果蠹蛾與美國、白俄羅斯、澳大利亞、德國4 地蘋果蠹蛾COI序列比對。其中，GS-JQ代表甘肅酒泉，GS-DH代表甘肅敦煌，XJ-HM代表新 疆哈密，XJ-KEL代表新疆庫爾勒，XJ-KS代表新疆喀什，XJ-YL代表新疆伊犁。序列表2為蘋果蠹蛾與梨小食心蟲、李小食心蟲和桃小食心蟲COI序列的比對?？?中為特異性蘋果蠹蛾鑒定引物的所在位置。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明基于目前的分子生物學(xué)技術(shù)手段，從待鑒定樣品的DNA模板提取、蘋果蠹 蛾特異引物設(shè)計(jì)和電泳圖譜的獲得三方面入手，通過開發(fā)新的方法以達(dá)到使蘋果蠹蛾的鑒 定方法更加簡單、快速、準(zhǔn)確的目的。其中待鑒定樣品DNA模板的提取方法為鹽析法，具體步驟如下1.隨機(jī)挑選單頭食心蟲標(biāo)本(純酒精保存)，幼蟲取頭部，成蟲取足或胸部肌肉； 樣本取出后浸入無菌水中除去酒精，并在吸水紙上晾干；2.樣本晾干后轉(zhuǎn)移至裝有100 μ L提取液的1. 5ml離心管中充分研磨；3.將勻菜移至60 70°C水浴15_30min ；4.在勻漿中加入10 μ L冷的8mol/LNaAc，冰浴15min ；5.將冰浴后的混合液4°C，10000rp/min,離心20min ；6.上清液轉(zhuǎn)移至另一 1.5ml離心管中，加入等體積異丙醇，lOOOOrp/min離心 15min，棄上清；7.向留有沉淀的離心管中加入70%乙醇Iml洗滌DNA，10000rp/min離心5min，棄
上清；8.步驟7重復(fù)1 2次。9.自然晾干后向管內(nèi)加入50 μ L無菌水溶解DNA，-20°C冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆?。電泳檢測使用的瓊脂糖凝膠電泳為常規(guī)方法。蘋果蠹蛾鑒定引物的設(shè)計(jì)為本發(fā)明的核心，為了得到對蘋果蠹蛾特異而準(zhǔn)確的鑒 定引物，我們進(jìn)行了以下研究
1.蘋果蠹蛾COI基因種內(nèi)保守性研究通過采集中國甘肅、新疆兩省共6個地區(qū)的蘋果蠹蛾成蟲及幼蟲標(biāo)本，以COI通用引物mtD7. 2F 5‘ -GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3‘mtD9. 2R 5‘ -CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3‘經(jīng)過常規(guī)PCR擴(kuò)增和常規(guī)測序得到蘋果蠹蛾線粒體基因COI片段序列。同時，我們還從NCBI上搜索4條蘋果蠹蛾相關(guān)序列，序列號分別為FJ217763、 FJ217761、FJ217754、FJ217752，序列相關(guān)標(biāo)本分別來源于美國、白俄羅斯、澳大利亞和德 國。用CLUSTAL X軟件對上述的蘋果蠹蛾COI序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)不同來源的蘋果蠹蛾在 COI區(qū)域的保守性很高，從而保證了引物的準(zhǔn)確性(序列表1)。2.桃小食心蟲、梨小食心蟲和李小食心蟲COI基因種內(nèi)保守性研究通過采集中 國不同地區(qū)的桃小食心蟲、梨小食心蟲和李小食心蟲成蟲及幼蟲標(biāo)本，以COI通用引物mtD72F 5' -GGAGGATTTGGAAATTGATTAGTTCC-3‘mtD9. 2R 5' -CCCGGTAAAATTAAAATATAAACTTC-3‘經(jīng)過常規(guī)PCR擴(kuò)增和常規(guī)測序得到此3種食心蟲COI片段序列。同時，我們還從NCBI上搜索了此3種食心蟲的相關(guān)序列，通過對上述3種食心蟲 COI序列分別進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)3種食心蟲的COI區(qū)域均具有很高的保守性。3.蘋果蠹蛾與其它三種食心蟲(桃小食心蟲、梨小食心蟲和李小食心蟲)的COI 序列比對為了設(shè)計(jì)出針對蘋果蠹蛾的特異引物，我們對4種食心蟲的COI序列進(jìn)行了比對 (序列表2)。通過序列表1、序列表2可以看出，設(shè)計(jì)蘋果蠹蛾特異引物所選取的區(qū)域?yàn)榉N間變 異區(qū)，該區(qū)域存在一定的堿基差異，而在種內(nèi)又十分保守，因此，該區(qū)域序列可以作為蘋果 蠹蛾的特異引物。4.通過PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蘋果蠹蛾特異引物的特異性及對蘋果蠹蛾目的片段的 擴(kuò)增效果，具體步驟如下(I)PCR反應(yīng)體系反應(yīng)體系以50yL為參考，引物用去離子水調(diào)至lOpmol/yL，各 試劑用量分別為10 X TaqDNA 聚合酶緩沖液(Mg2+) 5 μ LdNTP(IOmM)4μ L引物IFIuL引物IRIuL模板 DNA4 μ LTaqDNA 聚合酶(5U/ μ L)0. 4 μ LddH2034. 6 μ I(2)PCR反應(yīng)條件反應(yīng)在PCR儀上進(jìn)行，95°C預(yù)變性2min，然后按下列參數(shù)進(jìn)行 40次循環(huán)反應(yīng)變性95°C15s退火55°C30s延伸72°C45s循環(huán)結(jié)束后72°C補(bǔ)償延伸lOmin，反應(yīng)產(chǎn)物保存在4°C。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示(圖1)，僅蘋果蠹蛾在289bp處有明亮條帶，其余三種食心蟲在該位 置均無條帶，說明蘋果蠹蛾特異引物對蘋果蠹蛾是特異的，從而從實(shí)驗(yàn)上證明了該引物的 特異性及對蘋果蠹蛾的目的片段具有良好的擴(kuò)增效果。綜上所述，本發(fā)明利用蘋果蠹蛾與其它三種食心蟲的序列差異，設(shè)計(jì)出針對蘋果 蠹蛾的特異引物，并以此引物為核心，開發(fā)出一種利用該引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增以快速鑒別蘋 果蠹蛾的方法。這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于蘋果蠹蛾鑒定引物特異性強(qiáng)，對蘋果蠹蛾的目的片段 具有良好的擴(kuò)增效果，保證了鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性；PCR反應(yīng)為常規(guī)條件，成功率高；實(shí)驗(yàn)結(jié) 果以電泳圖形式呈現(xiàn)，僅根據(jù)289bp條帶的有無，即可對樣本進(jìn)行鑒定，結(jié)果清晰明了。實(shí)施例利用特異性的蘋果蠹蛾鑒定引物IF/R對采集自中國不同地區(qū)的蘋果蠹蛾、桃小食心蟲、梨小食心蟲和李小食心蟲標(biāo)本進(jìn)行快速鑒定。引物 IF 5 ‘ -ATTACCCCCATCTATTATACTT-3 ‘引物 1R 5 ‘ -TGGTAATGATAAAAGAAGTAAAAGAGC-3 ‘步驟1 待鑒定食心蟲的總DNA提取1.標(biāo)本采集信息采集來自我國不同地區(qū)的10份蘋果蠹蛾樣本，5份桃小食心蟲 樣本，4份梨小食心蟲樣本和3份李小食心蟲樣本。 2. DNA模板的提取隨機(jī)挑選單頭食心蟲標(biāo)本(純酒精保存)，幼蟲取頭部，成蟲取足或胸部肌肉；樣 本取出后浸入無菌水中除去酒精，并在吸水紙上晾干；樣本晾干后轉(zhuǎn)移至100 μ L提取液中 充分研磨；將勻漿移至60 70°C水浴15 30min ；在勻漿中加入10 μ L冷的8mol/L NaAc, 冰浴15min ；離心20min(10000rp/min 4°C )；吸取上清液，在上清液中加入等體積異丙醇， 離心 15min(10000rp/min)，棄上清；加入 70% 乙醇 Iml 洗滌 DNA，離心 5min (10000rp/min)， 棄上清；再加入70%乙醇Iml洗滌DNA，離心5min (10000rp/min)，棄上清；自然晾干后加入 50 μ L無菌水溶解DNA，該DNA溶液可用于PCR擴(kuò)增。步驟2:PCR擴(kuò)增PCR反應(yīng)所用引物為本發(fā)明提供的特異性蘋果蠹蛾鑒定引物IF/R引物 IF 5 ‘ -ATTACCCCCATCTATTATACTT-3 ‘引物 1R 5 ‘ -TGGTAATGATAAAAGAAGTAAAAGAGC-3 ‘PCR 反應(yīng)采用 50 μ L 標(biāo)準(zhǔn)體系，含有 10 X Taq buffer (Mg2+) 5 μ L, IOmmoldNTP 4 μ L 混合液，引物各 1 μ L，TaqDNA 聚合酶(5U/ μ L) 0. 4 μ L，模板 DNA 溶液 4 μ L，ddH20 34. 6 μ L。反應(yīng)條件為95°C預(yù)變性2min，95°C 15s，55°C 30s，72°C 45s,40個循環(huán)后72°C補(bǔ)償延伸 IOmin0步驟3 瓊脂糖凝膠電泳及紫外檢測瓊脂糖凝膠電泳所用的瓊脂糖凝膠濃度為1 %，含少量EB，總上樣量 4 μ L(3 μ LPCR 產(chǎn)物，1 μ Lloading buffer)，電泳電壓為 120v，時間為 30min。用紫外光檢測儀檢測電泳結(jié)果并拍照，結(jié)果如附圖1顯示，僅蘋果蠹蛾擴(kuò)增出 289bp的明亮條帶，而桃小食心蟲、梨小食心蟲和李小食心蟲樣本則不能擴(kuò)增出條帶。以上所述實(shí)施例僅是為充分說明本發(fā)明而所舉的較佳的實(shí)施例，本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于此。本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明基礎(chǔ)上所作的等同替代或變換，均在本發(fā)明 的保護(hù)范圍之內(nèi)。本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。序列表權(quán)利要求
一種蘋果蠹蛾鑒定引物，其特征在于所述鑒定引物的序列為引物1F5′-ATTACCCCCATCTATTATACTT-3′；引物1R5′-TGGTAATGATAAAAGAAGTAAAAGAGC-3′。
2.使用權(quán)利要求1所述蘋果蠹蛾鑒定引物鑒定蘋果蠹蛾的方法，其特征在于包括以 下步驟(a).待鑒定樣品DNA模板的提取；(b).使用權(quán)利要求1所述蘋果蠹蛾鑒定引物對模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(c).電泳檢測有無289bp條帶。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定蘋果蠹蛾的方法，其特征在于步驟(a)中，待鑒定樣品 DNA模板的提取方法為鹽析法。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的鑒定蘋果蠹蛾的方法，其特征在于所述鹽析法包括以下步驟(1).酒精保存的待鑒定樣品，除去酒精后，晾干；(2).晾干的樣本轉(zhuǎn)移至裝有提取液的離心管中充分研磨；(3).將勻漿移至60 70°C水浴15 30min；(4).在勻漿中加入NaAcjKS；(5).冰浴后的混合液離心；(6).上清液轉(zhuǎn)移至另一離心管中，加入等體積異丙醇后，離心，棄上清液； (J).向留有沉淀的離心管中加入70%乙醇洗滌DNA，離心，棄上清；(8).步驟(7)重復(fù)1 2次；(9).自然晾干后，向離心管中加入無菌水溶解DNA，冷凍保存。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鑒定蘋果蠹蛾的方法，其特征在于步驟(4)中，所述NaAC為 8mol/L的冷NaAc，冰浴時間10 20min ；步驟(9)中，所述冷凍保存的溫度是_20°C。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的鑒定蘋果蠹蛾的方法，其特征在于步驟(5)和(6)中，所述 離心于4°C下，以10000rp/min的速度離心15 20min ；步驟(7)中，所述離心于4°C下，以 10000rp/min的速度離心4 6min。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鑒定蘋果蠹蛾的方法，其特征在于步驟(b)中，所述PCR擴(kuò) 增的條件為常規(guī)PCR體系，退火溫度為55°C 57°C，退火時間為30s。
8.根據(jù)權(quán)利要求2 7任一項(xiàng)所述的鑒定蘋果蠹蛾的方法，其特征在于步驟(c)中， 所述電泳檢測為1 1. 5% (質(zhì)量百分比)瓊脂糖凝膠電泳檢測。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的鑒定蘋果蠹蛾的方法，其特征在于所述電泳檢測是利用紫 外光檢測。
10.權(quán)利要求1所述蘋果蠹蛾鑒定引物在區(qū)分蘋果蠹蛾、桃小食心蟲、梨小食心蟲和李 小食心蟲上的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種蘋果蠹蛾鑒定引物，引物1F5’-ATTACCCCCATCTATTATACTT-3’；引物1R5’-TGGTAATGATAAAAGAAGTAAAAGAGC-3’。使用上述引物鑒定蘋果蠹蛾的方法，包括以下步驟(1)待鑒定樣品DNA模板的提??；(2)使用權(quán)利要求1所述蘋果蠹蛾鑒定引物對模板DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)電泳檢測有無289bp條帶。本發(fā)明提供的蘋果蠹蛾鑒定引物對蘋果蠹蛾的目的片段具有良好的擴(kuò)增效果，用于鑒定時僅根據(jù)289bp條帶的有無，即可對樣本進(jìn)行鑒定，快速簡便、結(jié)果清晰、準(zhǔn)確。
文檔編號C12Q1/68GK101838687SQ20101000096
公開日2010年9月22日 申請日期2010年1月21日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月21日
發(fā)明者馮紀(jì)年, 楊建強(qiáng), 董昆, 趙驍 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)