一種鑒別蘋果蠹蛾細(xì)胞系的pcr引物及其鑒別方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于農(nóng)業(yè)生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種鑒別蘋果蠢蛾細(xì)胞系的PCR引物及 其鑒別方法。
【背景技術(shù)】 陽(yáng)00引蘋果蠢蛾（切diapomonella)屬鱗翅目、小卷葉蛾科，原產(chǎn)于歐洲中南部。20世 紀(jì)50年代入侵我國(guó)新疆，目前已入侵新疆、甘肅、寧夏、內(nèi)蒙古、黑龍江等地區(qū)，直接威脅我 國(guó)東部蘋果產(chǎn)區(qū)，對(duì)我國(guó)蘋果產(chǎn)業(yè)構(gòu)成嚴(yán)重威脅，已成為我國(guó)一種重要的檢疫性有害生物。 研究蘋果蠢蛾的生物學(xué)和生理學(xué)特性對(duì)于該蟲的綜合治理具有重要的意義，但在國(guó)內(nèi)非疫 區(qū)飼養(yǎng)蘋果蠢蛾具有一定的難度和潛在風(fēng)險(xiǎn)，建立蘋果蠢蛾細(xì)胞系不會(huì)造成蘋果蠢蛾對(duì)保 護(hù)區(qū)的入侵，可W通過培養(yǎng)的蘋果蠢蛾細(xì)胞來(lái)開展上述相關(guān)研究，細(xì)胞系的建立為相關(guān)研 究提供了一個(gè)便捷、快速的途徑。
[0003] 細(xì)胞系的建立及培養(yǎng)過程中可能會(huì)被其他細(xì)胞污染而轉(zhuǎn)變?yōu)槠渌ハx種類的細(xì) 胞系或多種不同種類昆蟲細(xì)胞共存的細(xì)胞系，運(yùn)就會(huì)對(duì)后期研究蘋果蠢蛾的昆蟲生理學(xué)及 生物學(xué)特性造成很大的影響。而目前鑒定細(xì)胞系的方法，如細(xì)胞系DNA擴(kuò)增產(chǎn)物指紋圖譜 (DAF)、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)等，其鑒定結(jié)果易受多種因素的影響，存在著重復(fù)性差 和靈敏度低等問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供一種鑒別蘋果蠢蛾細(xì)胞系的PCR引物及其鑒別方法，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有技 術(shù)的不足。 陽(yáng)0化]本發(fā)明首先提供一種用于檢測(cè)蘋果蠢細(xì)胞系的PCR引物對(duì)，其引物序列信息如 下：
[0006] 正向引物L(fēng)C01490 :5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'(SEQIDNO: 1)，
[0007] 反向引物肥02198 :5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'(SEQIDNO:2)。
[0008] 對(duì)上述的引物進(jìn)行了優(yōu)化，使優(yōu)化后的引物擴(kuò)增的靈敏性更高和重復(fù)性更好，優(yōu) 化后的引物的序列信息如下：
[0009] 正向引物MU1 :5' -GGTCAACAAATCATAAAGATACTGG-3'(沈QIDNo:3)，
[0010] 反向引物MD2 :5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAATAATA-3'(沈QIDNo:4)。
[0011] 本發(fā)明還提供一種蘋果蠢蛾細(xì)胞系的鑒別方法，其步驟如下： 陽(yáng)〇1引1)提取待鑒定樣品的基因組DNA，得到DNA提取液；
[0013] 2)利用上述的引物對(duì)步驟1)中的DNA提取液進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0014] 3)用限制性內(nèi)切酶化nfI對(duì)步驟2)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切；
[0015] 4)將步驟3)酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，當(dāng)PCR產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測(cè)樣 品在320bp和380bp有條帶時(shí)，則被測(cè)樣品確定為蘋果蠢蛾細(xì)胞系；
[0016] 所述步驟（2)的PCR擴(kuò)增體系如下： 陽(yáng)017] 基因組DM溶液1yL，10ymol/L的正向引物溶液1yL，10ymol/L的反向引物 溶液 1μL，5U/μLTaq酶 0. 5μL，10XTaq緩沖液 5μL，2. 5mmol/LdNTP4μL，滅菌純水 37. 5μLo
[0018] 所述步驟2)的PCR擴(kuò)增條件為：
[0019] 94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性1分鐘，54 °C退火1分鐘，72 °C延伸2分鐘，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；72 °C延伸5分鐘。
[0020] 所述步驟3)中限制性內(nèi)切酶化nfI酶切反應(yīng)條件為：37°C酶切1小時(shí)。
[0021] 本發(fā)明所述的限制性內(nèi)切酶為常用的限制性內(nèi)切酶，為鑒別蘋果蠢蛾細(xì)胞系提供 了簡(jiǎn)便、穩(wěn)定的酶切鑒別方法。
[0022] 本發(fā)明從分子水平探索了蘋果蠢蛾細(xì)胞系與其他幾種昆蟲（如暗黑觸金龜、甜菜 夜蛾和粉紋夜蛾）細(xì)胞系線粒體C0I基因片段序列的不同，建立了蘋果蠢蛾與暗黑觸金龜、 甜菜夜蛾和粉紋夜蛾等細(xì)胞系的鑒別方法。
【附圖說明】
[002引圖1為蘋果蠢蛾和其他幾種昆蟲細(xì)胞系C0I基因片段PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電 泳圖；其中M，DL5000DNAMarker;1-5,蘋果蠢蛾卵、蘋果蠢蛾細(xì)胞系、暗黑觸金龜細(xì)胞系、 甜菜夜蛾細(xì)胞系和粉紋夜蛾細(xì)胞系。
[0024]圖2為幾株蘋果蠢蛾細(xì)胞系C0I基因片段PCR擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中M，DL5000DNAMarker; 1-7,蘋果蠢蛾細(xì)胞系Cp-E-4、Cp-E-6、Cp-E-9、Cp-E-10、Cp-E-11、 Cp-E-12 和Cp-E-13。
[00巧]圖3為幾株蘋果蠢蛾細(xì)胞系PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)化nfI酶切后的瓊脂糖凝膠電泳 圖；其中M，DL5000DNAMarker;1-7,蘋果蠢蛾細(xì)胞系Cp-E-4、Cp-E-6、Cp-E-9、Cp-E-10、 Cp-E-ll、Cp-E_12 和Cp-E_13。 陽(yáng)0%] 圖4為蘋果蠢蛾與暗黑觸金龜、甜菜夜蛾和粉紋夜蛾細(xì)胞系PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)化nf I酶切后的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中M，DL5000DMMarker; 1-4,蘋果蠢蛾細(xì)胞系、暗黑觸 金龜細(xì)胞系、甜菜夜蛾細(xì)胞系和粉紋夜蛾細(xì)胞系。
【具體實(shí)施方式】
[0027] 下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。
[0028] 實(shí)施例1:蘋果蠢蛾細(xì)胞系與其他幾種昆蟲細(xì)胞系基因組C0I基因片段的擴(kuò)增和 序列分析
[0029] 申請(qǐng)人分析了擴(kuò)增獲得的蘋果蠢蛾細(xì)胞系C0I基因部分序列（SEQIDNo:5)與蘋 果蠢蛾卵基因組擴(kuò)增的C0I基因部分序列（SEQIDNo:6);在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行Blast比 對(duì)，利用DNASTAR軟件對(duì)蘋果蠢蛾和其他幾種昆蟲的C0I基因片段進(jìn)行對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)蘋果 蠢蛾與暗黑觸金龜?shù)腃0I基因核巧酸一致性為81. 6%，與甜菜夜蛾的C0I基因核巧酸一致 性為87. 9%，與粉紋夜蛾的C0I基因核巧酸一致性為83. 9%，結(jié)果表明蘋果蠢蛾的C0I基 因核巧酸序列與其他幾種昆蟲的C0I基因核巧酸序列存在明顯的差異。
[0030] 根據(jù)序列分析結(jié)果，申請(qǐng)人設(shè)計(jì)了如下的引物： 陽(yáng)的1]正向引物L(fēng)C01490 :5' -GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3'(沈QIDNO:1)，
[0032]反向引物肥02198 :5' -TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3'(沈QIDNO:2)。 陽(yáng)03引利用上述的引物對(duì)，PRIMER5. 0軟件對(duì)蘋果蠢蛾和其他幾種昆蟲的C0I基因片段 序列進(jìn)行分析，首先保證該引物不僅能夠擴(kuò)增蘋果蠢蛾細(xì)胞系與蘋果蠢蛾卵基因組DNA中 的線粒體C0I基因片段，還能擴(kuò)增其他幾種昆蟲（如暗黑觸金龜、甜菜夜蛾和粉紋夜蛾）的 線粒體C0I基因片段；而且，擴(kuò)增的產(chǎn)物中確保蘋果蠢蛾C0I的擴(kuò)增片段可被限制性內(nèi)切酶 HinfI酶切（酶切位點(diǎn)為GANTC)，而其他昆蟲（如暗黑觸金龜、甜菜夜蛾和粉紋夜蛾）的 C0I基因片段不能被限制性內(nèi)切酶化nfI酶切。從而能夠有效的區(qū)分蘋果蠢蛾細(xì)胞系，并 確定蘋果蠢蛾細(xì)胞系是否被其它遺傳背景近似的細(xì)胞系污染。
[0034] 利用設(shè)計(jì)的引物對(duì)進(jìn)行檢測(cè)，具體步驟如下：
[0035] (1)蘋果蠢蛾及暗黑觸金龜、甜菜夜蛾和粉紋夜蛾細(xì)胞系基因組DNA的提取
[0036] 對(duì)蘋果蠢蛾細(xì)胞系Cp-E-10及暗黑觸金龜細(xì)胞系化-E-1、甜菜夜蛾細(xì)胞系Se-1和 粉紋夜蛾細(xì)胞系化9-4s的細(xì)胞懸液用Ma姐xtractor-Genome試劑盒進(jìn)行基因組DNA的提 取，得到幾種昆蟲細(xì)胞系的基因組DNA溶液。
[0037] (2)蘋果蠢蛾及暗黑觸金龜、甜菜夜蛾和粉紋夜蛾細(xì)胞系C0I基因片段的PCR擴(kuò)增
[0038] 分別W蘋果蠢蛾、暗黑觸金龜、甜菜夜蛾和粉紋夜蛾細(xì)胞系的基因組DNA溶液為 模板，W優(yōu)化前的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0039]PCR擴(kuò)增體系為： W40] 細(xì)胞系的基因組DNA溶液：lyL，10ymol/L的正向引物：溶液lyL，10ymol/L 的反向引物溶液：1yL，5U/yLTaq酶：0. 5yL，10XTaq緩沖液：5yL，2. 5mmol/LdNTP: 4μL，滅菌純水：37. 5μL。
[0041]PCR擴(kuò)增條件為：
[0042] 94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性1分鐘，54 °C退火1分鐘，72 °C延伸2分鐘，進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；72 °C延伸5分鐘。
[0043] 用1. 0 %的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)步驟似制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)。