一種海膽物種特異性檢測引物及應(yīng)用
【專利說明】-種海膽物種特異性檢測引物及應(yīng)用
[0001]
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種海膽物種特異性檢測引物及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0003] 海膽屬棘皮動物口，海膽綱。因其生殖腺含有大量的蛋白質(zhì)、氨基酸、高度不飽和 脂肪酸、糖類等生理活性物質(zhì)，海膽不但具有較高的食用價值，還具有極好的藥用價值，尤 其是對屯、血管疾病具有較好的防治效果。價格相對其他水產(chǎn)品相對較高，消耗量極大，高達 數(shù)千噸，我國每年需從美國、韓國等地進口大量海膽填補國內(nèi)空缺。通過形態(tài)學(xué)特征進行判 斷是對海膽識別的傳統(tǒng)方法，但是運些形態(tài)學(xué)特征的可塑性強，受環(huán)境影響大，具有人為的 主觀傾向性，且存在豐富的近緣物種，近緣種間的形態(tài)差異細微，所W傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)特征識 別方法存在識別困難與識別錯誤的問題。
[0004] 采用DNA技術(shù)鑒定動物物種是物種識別方法中最為熱口也是發(fā)展最快的分子技 術(shù)?？焖龠M化并呈母系遺傳的線粒體DNA是種群遺傳學(xué)和進化遺傳學(xué)的理想研究對象。海 膽與其它近源物種的序列相似度在85-94%之間，而CoxI基因序列有較大差異，目前，貝類 動物的分子檢測主要集中于運一序列。已發(fā)表的檢測方法包括普通PCR方法和實時巧光 PCR方法等，運些方法或存在交叉反應(yīng)，或?qū)υO(shè)備要求很高，目前尚沒有一種簡便的PCR方 法可W將海膽的基因與其它貝類動物基因完全區(qū)分。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的是克服上述不足問題，提供一種海膽物種特異性檢測引物及應(yīng)用方 法。本發(fā)明可W檢測出來自動物樣品的微量DNA，完全區(qū)分海膽的基因與其它貝類動物基 因，檢測靈敏度高，方法快速，易操作。
[0006] 本發(fā)明為實現(xiàn)上述目的所采用的技術(shù)方案是：一種海膽物種特異性檢測引物，其 特征在于：其序列是： 上游引物：5' -tagtaaaatagcacacgccg-3，； 了貧字弓1? :5，一tc曰邑曰C曰曰曰t曰曰邑邑邑曰曰邑曰C邑一3,〇
[0007] -種所述海膽物種特異性檢測引物的應(yīng)用，其特征在于：利用所述海膽物種特異 性檢測引物進行海膽物種PCR特異性檢測。
[0008] 進一步地，所述海膽物種PCR特異性檢測方法為：采用海膽物種特異性檢測引物 PCR擴增海膽的CoxI基因，PCR擴增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳會產(chǎn)生一條160bp大小的特異性 電泳條帶，從而將海膽成分進行特異性鑒定。
[0009] 進一步地，所述PCR擴增海膽的CoxI基因的25μL反應(yīng)體系如下表1 : 表1.PCR擴增海膽的CoxI基因的反應(yīng)體系
[0010] 進一步地，所述PCR擴增海膽的CoxI基因的反應(yīng)參數(shù)如下表2: 表2.PCR擴增海膽的CoxI基因的反應(yīng)參數(shù)
[0011] 本發(fā)明特異性引物設(shè)計合理，用于海膽物種檢測，特異性好，檢測靈敏度高。采用 本方法檢測海膽動物成分結(jié)果顯示，采用海膽物種特異性檢測引物PCR擴增海膽的CoxI 基因，PCR擴增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳會產(chǎn)生一條160bp大小的特異性電泳條帶，即可將海膽 成分進行準(zhǔn)確鑒定，具有很好的特異性。
【附圖說明】
[0012] 圖1為5種引物PCR結(jié)果圖，圖中：M.DL2000marker，1.P1P2引物擴增結(jié)果，2.P3P4 引物擴增結(jié)果，3.P5P6引物擴增結(jié)果，4.P7P8引物擴增結(jié)果，5.P9P10引物擴增結(jié)果，6. 陰性對照，7.空白對照。
[0013] 圖2為海膽與其他海洋動物的PCR特異性檢測結(jié)果圖，圖中：M.mark, 1.紫海膽， 2.馬糞海膽，3.夏夷扇貝，4.貽貝，5.太平洋牡頗，6.魅蝴，7.陰性對照，8.空白對照。
[0014] 圖3為靈敏度分析結(jié)果圖，圖中：M.DL2000marker，l. 10ng/yL擴增結(jié)果，2. 5ng/μL擴增結(jié)果，3.1ng/μL擴增結(jié)果，4.0.5ng/μL擴增結(jié)果，5.0.1ng/μL擴增結(jié) 果，6.陰性對照，7.空白對照。
【具體實施方式】
[0015] 下面結(jié)合附圖和實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但本發(fā)明并不局限于具體實施 例。
[0016] 本實施例中所利用的海膽物種特異性檢測引物，其序列是： 5，-t曰gt曰曰曰曰t曰gc曰C曰cgccg-3，（上游）； 5， 一tc曰邑曰C曰曰曰t曰曰邑邑邑曰曰邑曰C邑一3， （了貧字）〇
[0017] 一種所述海膽物種特異性檢測引物的應(yīng)用，即利用所述海膽物種特異性檢測引物 進行海膽物種PCR特異性檢測，具體步驟如下： 1.海膽物種特異性檢測引物合成：在寶生物公司合成海膽物種特異性檢測引物5對， 其序列(見表3): 表3.PCR擴增海膽的CoxI基因的引物序列：
2.海膽DM的提取：采用DM提取試劑盒(購于寶生物公司）提取海膽模板DM,用微 量分光光度計檢測提取海膽模板DNA的濃度為10化邑。
[001引 3.PCR擴增海膽的CoxI基因：配制25μLPCR反應(yīng)體系如下表4 : 表4.PCR擴增海膽的CoxI基因的反應(yīng)體系
使用該海膽物種特異性檢測引物時設(shè)置PCR的反應(yīng)參數(shù)如下表5 : 表5.PCR擴增海膽的CoxI基因的反應(yīng)參數(shù)
4.瓊脂糖凝膠電泳檢測：^?1?2，？3?4、？5?6、？7?8、？9?10等5對特異性引物口0? 擴增海膽的CoxI基因后，W2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結(jié)果顯示巧日圖1所示)，經(jīng)瓊脂 糖凝膠電泳檢測后會分別產(chǎn)生16化P、12化P、10化P、IWbp、104bp大小的特異性電泳條帶。 WP1P2作為上下游引物進行特異性PCR擴增，電泳效果最好，PCR擴增效率最高，因此選取 P1P2作為擴增體系的特異性擴增引物。
[0019] 利用所述海膽物種特異性檢測引物進行海膽的物種成分實時檢測時，采用本方法 檢測海膽動物成分結(jié)果顯示，采用海膽物種特異性檢測引物PCR擴增檢測紫海膽、馬糞海 膽、夏夷扇貝、貽貝、太平洋牡頗、魅蝴等樣品，PCR擴增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，如圖2所示， 海膽樣品產(chǎn)生一條160bp大小的特異性電泳條帶，其他樣品無電泳條帶，即可將海膽成分 進行準(zhǔn)確鑒定，具有很好的特異性。
[0020] 采用DNA提取試劑盒提取各待測樣品的模板DNA，用微量分光光度計分別檢測所 提取的模板DNA梯度稀釋，制備成 10ng/μL5ng/μL1ng/μL、0. 5ng/μL、0. 1ng/ μL5個濃度梯度樣品，分別按照上述步驟3中所述反應(yīng)體系及反應(yīng)參數(shù)進行PCR擴增，后W2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，W確定本標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測靈敏度，結(jié)果如圖3所示，所產(chǎn)生 的大小為160bp的特異性電泳條帶即為海膽，當(dāng)DNA濃度>Ing/μL時均可W特異擴增，即 該標(biāo)準(zhǔn)方法的檢測靈敏度為Ing/μL。此方法可W準(zhǔn)確的對海膽的成分進行鑒定，具有很好 的靈敏度。
[0021]W上內(nèi)容是結(jié)合優(yōu)選技術(shù)方案對本發(fā)明所做的進一步詳細說明，不能認定發(fā)明的 具體實施僅限于運些說明。對本發(fā)明所屬技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明 的構(gòu)思的前提下，還可W做出簡單的推演及替換，都應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明的保護范圍。
【主權(quán)項】
1. 一種海膽物種特異性檢測引物，其特征在于：其序列是： 上游弓丨物：5' -tagtaaaatagcacacgccg_3,; 下游弓丨物：5' -tcagacaaataagggaagacg-S'。2. -種根據(jù)權(quán)利要求1所述的海膽物種特異性檢測引物的應(yīng)用，其特征在于：利用所 述海膽物種特異性檢測引物進行海膽物種PCR特異性檢測。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的海膽物種特異性檢測引物的應(yīng)用，其特征在于：所述海膽物 種PCR特異性檢測方法為：采用海膽物種特異性檢測引物PCR擴增海膽的CoxI基因，PCR 擴增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳會產(chǎn)生一條160bp大小的特異性電泳條帶，從而將海膽成分進行 特異性鑒定。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的海膽物種特異性檢測引物的應(yīng)用，其特征在于：所述PCR擴 增海膽的CoxI基因的反應(yīng)體系如下表1 : 表1.PCR擴增海膽的CoxI基因的反應(yīng)體系5. 根據(jù)權(quán)利要求3或4任一所述的海膽物種特異性檢測引物的應(yīng)用，其特征在于：所 述PCR擴增海膽的CoxI基因的反應(yīng)參數(shù)如下表2 : 表2.PCR擴增海膽的CoxI基因的反應(yīng)參數(shù)〇
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種海膽物種特異性檢測引物及應(yīng)用。一種海膽物種特異性檢測引物，其序列是：5’-tagtaaaatagcacacgccg-3’（上游）；5’-tcagacaaataagggaagacg-3’（下游）。一種海膽物種特異性檢測引物的應(yīng)用，采用海膽物種特異性檢測引物PCR擴增海膽的CoxⅠ基因，PCR擴增后經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳會產(chǎn)生一條160bp大小的特異性電泳條帶，從而將海膽成分進行特異性鑒定。本發(fā)明特異性引物設(shè)計合理，用于海膽物種檢測，特異性好，檢測靈敏度高，即經(jīng)過PCR分析，即可將海膽成分進行準(zhǔn)確鑒定，具有很好的特異性。
【IPC分類】C12Q1/68, C12N15/11
【公開號】CN105255880
【申請?zhí)枴緾N201510787607
【發(fā)明人】萬超, 劉淑艷, 宋大賀, 王剛
【申請人】萬超, 劉淑艷, 宋大賀, 王剛
【公開日】2016年1月20日
【申請日】2015年11月17日