專利名稱：痕量元素含量提高的水稻品種及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物中的痕量元素含量通過活化0sNAS2基因或0sNAS3基因得以提高；還涉及功能性食品，其包括由所述轉(zhuǎn)基因植物制備的產(chǎn)物。
背景技術(shù)：
雖然鐵(Fe)是世界上第四普遍的元素，但植物對它的利用率很低。這是因為Fe主要以氧化物形式存在，在土壤中的溶解度非常低。此外，全世界大約30%的土壤是堿性的，F(xiàn)e在其中處于溶解度極低的Fe2O3形式,這阻礙著植物的生長(Mori, Curr Opin PlantBiol 2:250-253,1999)。Fe缺乏對植物有致命的影響。具體來說，F(xiàn)e缺乏影響葉綠素的合成和葉綠體發(fā)育，最終使植物產(chǎn)量減少。Fe對人體健康也很關(guān)鍵。Fe是多種細(xì)胞功能所必須的微營養(yǎng)素之一。據(jù)世界衛(wèi)生 組織(WHO)，世界人口的大約30%患有Fe缺乏造成的貧血，多數(shù)在不發(fā)達(dá)國家。缺鋅(Zn)阻礙植物的生長、對脅迫的抗性和植物中生成葉綠素。Zn對人體免疫反應(yīng)很重要，已知能夠提高對感染的抵抗力，并且參與細(xì)胞生長和傷口愈合。植物有兩種克服Fe缺乏的策略(Marschneret al. , J. Plant Nutr 9:3-7,1986)。多數(shù)植物通過將Fe3+還原為Fe2+來吸收鐵。但是，禾本科植物，比如水稻或大麥，在缺Fe時會向土壤中分泌能結(jié)合鐵的物質(zhì)，比如植物鐵載體，從而提高Fe3+的結(jié)合和溶解度，攝入與植物鐵載體形成復(fù)合體的Fe。水稻(Oryza sativa)是人類主要農(nóng)作物之一，因此開發(fā)Fe含量高的水稻新品種對提高人類健康狀況很重要。但是，利用基因工程培育Fe含量高的水稻品種被認(rèn)為是局限的傳統(tǒng)育種技術(shù)和解決人體缺Fe的健康問題的替代(Qu et al.，Planta222:225-233，2005)。為了實(shí)現(xiàn)這一目的，使用了通過提高植物中天然存在的Fe儲存蛋白鐵蛋白的含量來加強(qiáng) Fe 含量的方法(Theil et al. , Annu Rev Biochem 56:289-315，1997)。該方法是關(guān)于通過轉(zhuǎn)化大豆ferritin基因來開發(fā)種子中Fe含量是對照組大約3倍的水稻新品種，所述大豆基因帶有水稻glutelin啟動子，能夠在胚乳中特異表達(dá)(Goto et al.，NatBiotech 17:282-286,1999)。在水稻植株中過表達(dá)來自菜豆(Phaseolus vulgaris)的ferritin基因的結(jié)果是水稻種子中的Fe含量提高了兩倍(Lucca et al.，Theor ApplGenet 102:392-397,2001)。韓國專利10-471679公開了通過轉(zhuǎn)化分離自大豆和水稻植物的鐵蛋白表達(dá)基因獲得的有產(chǎn)生高Fe含量能力的水稻植物品種，所述鐵蛋白表達(dá)基因帶有分離自水稻或玉米的種子貯藏蛋白一球蛋白、谷蛋白和玉米醇溶蛋白(zein)的胚乳特異表達(dá)啟動子。該方法使用了來源于非水稻的作物(比如大豆和玉米)的基因。韓國專利10-454083公開的具有改進(jìn)的Fe吸收能力的禾本科植物是通過引入?yún)⑴c麥根酸生物合成途徑的煙酰胺氨基轉(zhuǎn)移酶(NAAT)獲得的。該方法使用了編碼NAAT的基因。
韓國專利公開10-2003-84892公開了通過引入還原酶基因制備對鐵缺乏抗性提高的植物，所述基因可以將煙酰胺(NA)的酮體還原為2’-脫氧麥根酸。該方法使用了編碼將NA酮體還原為2’ -脫氧麥根酸的還原酶的基因。NA作為植物中結(jié)合金屬元素的螯合劑對吸收金屬元素和維持穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要(Douchkov et al. , Plant Cell Environ 28:365-374,2005)。NA 是由三個 S-腺苷-L-甲硫氨酸分子經(jīng)煙酰胺合成酶(NAS)合成的。高血壓是最常見的慢性循環(huán)系統(tǒng)疾病。根據(jù)參與升高血壓的主要機(jī)制的腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)，血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)將血管緊張素I(AngI)轉(zhuǎn)化為血管緊張素IKAng II)，轉(zhuǎn)化生成的Ang II已知能夠引起血管收縮，使血壓升高。從這方面來說，為了緩和血壓，已開發(fā)并有了商品ACE抑制劑。煙酰胺據(jù)報道在許多研究結(jié)果中具有ACE抑制劑功能(Usuda et al.，Plant Biotech J 7:87-95，2009)。
本發(fā)明的發(fā)明人發(fā)現(xiàn)活化水稻中天然存在的0sNAS2基因或0sNAS2基因?qū)е潞哿控Ｋ睾刻崧?。發(fā)明詳述技術(shù)問題本發(fā)明提供了痕量元素含量提高的轉(zhuǎn)基因植物，所述元素含量通過活化植物中天然存在的基因被提高到超過野生型，還提供了包括由所述轉(zhuǎn)基因植物制備的產(chǎn)物的功能性食品。技術(shù)方案根據(jù)本發(fā)明的一方面，提供了痕量元素含量提高的植物。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了在缺乏鐵(Fe)和鋅(Zn)中的至少一種的條件下栽培植物的方法。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了在重金屬過量條件下栽培所述植物的方法。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了包含所述植物或由所述植物制備的產(chǎn)物的功能性食
品O根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了包含所述植物或由所述植物制備的產(chǎn)物的藥物組合物。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了產(chǎn)生所述痕量元素含量提高的植物的方法。根據(jù)本發(fā)明另一方面，提供了在高pH條件下栽培所述植物的方法。附圖簡述

圖1展示了根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方案的含有插入T-DNA的DNA構(gòu)建體。圖2A的圖形是定量實(shí)時逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)測量到的水稻葉子或根中0sNAS2基因的表達(dá)，所述水稻在添加O、1、10、100或500 μ MFe (III) -EDTA的MS培養(yǎng)基中生長大約7天；圖2Β的圖形是利用在不同時間從水稻葉子和根提取的RNA測量到的0sNAS2基因表達(dá)，所述亞洲栽培到在不含F(xiàn)e (III) -EDTA的MS培養(yǎng)基中生長大約7天，然后生長在添加100 μ MFe (III) -EDTA的MS培養(yǎng)基中；圖3是0sNAS2基因相對0sNAS2_Dl及其野生型的表達(dá)水平的比較圖線；圖4是野生型和0sNAS2_Dl的表型圖像，所述植物分別生長在含有Fe和Zn的MS固體培養(yǎng)基(MS)、不含F(xiàn)e的MS固體培養(yǎng)基(Fe-)，和不含Zn的MS固體培養(yǎng)基(Zn-)中；
圖5是表型圖像，以及野生型和0sNAS2_Dl的植株高度圖形，植物生長在pH調(diào)節(jié)過的MS培養(yǎng)基(MS/pH 8. 5)中和pH調(diào)節(jié)過的包含F(xiàn)e的MS培養(yǎng)基(Fe-/pH 8. 5)中；圖6是野生型和0sNAS2-Dl的表型的圖像，植物分別生長在添加過量Zn(5mM)、Cu (O. 3mM)和Ni (O. 5mM)的固體MS培養(yǎng)基中；圖7展示了根據(jù)實(shí)施方案含有插入的T-DNA的DNA構(gòu)建體；圖8、9和10的圖形是顯示水稻葉子或根中0sNASl、0sNAS2或0sNAS3基因表達(dá)水平的定量實(shí)時RT-PCR結(jié)果，所述水稻生長在MS培養(yǎng)基或者不含F(xiàn)e、Zn、Cu或Mn的MS培養(yǎng)基中；圖11是0sNAS3-Dl及其野生型，以及0sNAS3_D2及其野生型中的0sNAS3表達(dá)水平的比較圖形；圖12是0sNAS3_Dl及其野生型中觀察到的萎黃病表型和葉子，所述植物分別生長在含有Fe和Zn的MS固體培養(yǎng)基(MS)、不含F(xiàn)e的MS固體培養(yǎng)基(Fe-)，和不含Zn的MS固體培養(yǎng)基(Zn-)中；圖13是0sNAS3_Dl及其野生型的表型圖像和植株高度圖形，所述植物分別生長在含有添加過量Zn (5mM)、Cu (O. 3mM)和Ni (O. 5mM)的固體MS培養(yǎng)基；和圖14是0sNAS3_Dl及其野生型的表型圖像和植株高度圖形，所述植物生長在pH調(diào)節(jié)過的MS培養(yǎng)基(MS/pH 8. 5)和pH調(diào)節(jié)過的不含F(xiàn)e的MS培養(yǎng)基(Fe-/pH 8. 5)中。最佳實(shí)施方式以下詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施方案。這些實(shí)施方案僅用于說明目的，不構(gòu)成對發(fā)明范圍的限制。實(shí)施例1: 0sNAS2基因表達(dá)被活化的轉(zhuǎn)基因植物的分離(1)水稻植株中存在的煙酰胺合成酶2 (0sNAS2)基因的表達(dá)檢測法據(jù)報道水稻(Oryza sativa)含有三種不同種類的有酶活性的煙酰胺合成酶(OsNASl、0sNAS2 和 0sNAS3) (Inoue et al. , Plant J 36:366-381,2003)。本實(shí)施例中，研究了 0sNAS2基因相對外部所提供鐵濃度的表達(dá)程度。水稻種子在分別添加了 0μΜ、1μΜ、10 μ Μ、100 μ M和 500 μ M Fe(III)-EDTA 的 MS 培養(yǎng)基(包含 O. ΙμΜ CuS04、30yM ZnSO4 和10 μ M MnSO4)中發(fā)芽，并分別生長大約7天。另外單獨(dú)的，水稻種子在未添加Fe(III)-EDTA的MS培養(yǎng)基中生長7天后，將得到的產(chǎn)物轉(zhuǎn)移到添加了 100 μ M Fe(III)-EDTA的MS培養(yǎng)基，觀察到0sNAS2表達(dá)的變化。從水稻植株的根和葉分離RNA，利用逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)實(shí)時定量RNA的表達(dá)水平。PCR條件為95°C I分鐘，94°C 15秒，56°C 10秒，和72°C 10秒(重復(fù)45次)。使用了以下引物。擴(kuò)增了水稻actin I基因作為表達(dá)對照基因。引物序列0sNAS2-正向引物；5’ -CGTCTGAGTGCGTGCATAGTA-3’ (SEQ.1D No. 3)0sNAS2-反向引物；5’ -GAAGCACAAACACAAACCGATA-3’ (SEQ.1D No. 4)OsActl-正向引物；5，-TGGAAGCTGCGGGTATCCAT-3，(SEQ.1D No. 5)OsActl-反向引物；5’-TACTCAGCCTTGGCAATCCACA-3' (SEQ.1D No. 6)結(jié)果如圖2所示。圖2中，縱軸表示基于水稻actin I表達(dá)量的表達(dá)水平。參見圖2中的A，發(fā)現(xiàn)當(dāng)生長在不含F(xiàn)e的培養(yǎng)基中時，來自葉子的0sNAS2基因被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，但在含有I μ M或更高Fe (III) -EDTA的培養(yǎng)基中沒有表達(dá)。對于來自根的OsNAS2基因，在不含F(xiàn)e的培養(yǎng)基中的表達(dá)水平最高，并隨著Fe濃度增加而下降。圖2中的B是在含有IOOyM Fe(III)-EDTAs的培養(yǎng)基中，0sNAS2基因相對時間的表達(dá)曲線。獲得圖2的結(jié)果使用的水稻品種是Dongjin。⑵0sNAS2基因表達(dá)被活化的轉(zhuǎn)基因植物的培育和分離pGA2715載體作為T-DNA載體被用做產(chǎn)生轉(zhuǎn)化水稻植物的構(gòu)建體(Jeong etal.，Plant Physiol. 130:1636-1644，2002)。pGA2715 載體包含緊挨右邊界的 β -葡萄糖醛酸苷酶(GUS)報告基因，和緊挨左邊界的來源于花椰菜花葉病毒(CaMV) 35S啟動子的四聚體化轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子。用PGA2715載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，后者然后被用于轉(zhuǎn)化野生型(WT)Dongjin水稻植物，得到轉(zhuǎn)導(dǎo)了 pGA2715的水稻植物群體(Lee et al, J. PlantBiol. 42:310-316, 1999;Jeong et al. , Plant Physiol. 130:1636-1644, 2002;Jeong etal.,Plant Journal 45:123-132,2006)。
對從轉(zhuǎn)導(dǎo)水稻植物中分離的基因組DNA進(jìn)行反向PCR來鑒定T-DNA在pGA2715載體中的插入位點(diǎn)。結(jié)果分離到一個T-DNA插在0sNAS2基因附近的轉(zhuǎn)基因植物(0sNAS2_Dl)。轉(zhuǎn)基因植物0sNAS2-Dl包含的T-DNA在左邊界含有35S增強(qiáng)子，其中所述T-DNA位于0sNAS2基因下游大約2. 06kb。圖1說明了 T-DNA在0sNAS2_Dl中的插入位點(diǎn)。實(shí)施例2:轉(zhuǎn)基因植物中0sNAS2表達(dá)的提高利用PCR確定實(shí)施例1中分離到的0sNAS2-Dl的基因型。從0sNAS2_DlT2代的葉子中提取基因組DNA，并用作PCR中的模板DNA。對于0sNAS2_Dl，使用了兩個基因特異性引物 F (5，-ACCTTACTCCCCCGAACTAA-3’ ;SEQ.1D No. 7)和 R(5，-CAAGGAGCTGTCCGTCTAAC-3’ ;SEQ.1D No. 8)，以及T-DNA特異性引物RB(5’ -CMGTTAGTCATGTAATTAGCCAC-3’ ; SEQ.1D No. 9)。為了鑒定表達(dá)水平，從在含有或不含100 μ M Fe(III)-EDTA的培養(yǎng)基中生長大約7天的幼苗的葉子和根、0sNAS2-Dl純合體和WT水稻(Dongjin)的旗葉、10-cm大小的花和未成熟種子中分離RNA，然后與逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)獲得cDNA。用cDNA做模板和含有SEQ.1D Nos.1和2的兩個引物進(jìn)行實(shí)時PCR來比較0sNAS2-Dl和WT水稻(Dongjin)中0sNAS2基因的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果如圖3所示。在圖3中，縱軸代表0sNAS2基因相對水稻actin I基因的轉(zhuǎn)錄水平。如圖3所示，與WT細(xì)胞相比，0sNAS2基因的表達(dá)水平在所有試驗條件下都更高。實(shí)施例3:轉(zhuǎn)基因植物種子中煙酰胺的量提高為了研究增強(qiáng)的0sNAS2基因表達(dá)對煙酰胺(酶功能產(chǎn)物)增加量的影響，測量了種子中煙酸胺的量。用 mult1-beads shocker (Yasui kikai, Osaka Japan)將種子細(xì)致地粉碎，用400 μ I 80%乙醇從20mg所得種子粉末中3次大約15分鐘提取煙酰胺。利用LC-ES1-T0F-MS對提取到的煙酰胺進(jìn)行定量分析。結(jié)果如下表I所示。表I
煙酰胺GiTiF
WT__5. 59 ±3. 06
0sNAS2-Dl 110. 45±11. 33參見以上表1，與WT相比，0sNAS2_Dl種子中的煙酰胺量是它的19. 8倍。
實(shí)施例4:轉(zhuǎn)基因植物中痕量元素量的測量為了研究0sNAS2基因的活化對水稻中痕量元素積累的影響，測量了 WT和轉(zhuǎn)基因植物0sNAS2-Dl中痕量元素的量。來自WT和轉(zhuǎn)基因植物的成熟種子和旗葉作為樣品，利用痕量元素測量方法(Lee et al.，Plant Physioll50:786_800, 2009)測量了痕量元素的量。在大約70°C干燥大約2天后，將每個樣品稱重，然后在180°C烤箱中在Iml IlN HNO3中分解大約3天。每個樣品稀釋后,進(jìn)行原子吸收光譜法(AAS) (SpectrAA-800, Varian, PaloAlto, CA, USA)來測量樣品中的Fe和Zn含量。表2顯示了轉(zhuǎn)基因植物中痕量元素的量。表 權(quán)利要求
1.痕量元素含量提高的植物，其中所述痕量元素選自鐵(Fe)、鋅(Zn)和銅(Cu)。
2.權(quán)利要求1所述的植物，其中所述植物是水稻、大麥或玉米。
3.權(quán)利要求1所述的植物，其中所述植物的0sNAS2基因或0sNAS3基因表達(dá)提高。
4.權(quán)利要求3所述的植物，其中0sNAS2基因或0sNAS3基因表達(dá)提高是由于在選自 0sNAS2基因和0sNAS3基因上游和下游的至少一個位點(diǎn)插入了增強(qiáng)子。
5.權(quán)利要求4所述的植物，其中帶有四個重復(fù)的花椰菜花葉病毒(CaMV)35S增強(qiáng)子的構(gòu)建體被插入到0sNAS2基因或0sNAS3基因下游的大約IOkb處。
6.權(quán)利要求1所述的植物，其中所述植物是在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC)保藏的保藏號為KCTC 11597BP的水稻0sNAS2_Dl或者保藏號為KCTC 11598BP的水稻0sNAS3_Dl。
7.功能性食品，其包含由權(quán)利要求1所述植物生產(chǎn)的產(chǎn)物。
8.藥物組合物，其包含由權(quán)利要求1所述植物生產(chǎn)的產(chǎn)物。
9.權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中所述藥物組合物是用于治療由于缺乏選自Fe、 Zn、Cu或者它們的組合的物質(zhì)導(dǎo)致的疾病。
10.權(quán)利要求8所述的藥物組合物，其中所述疾病選自由缺Fe導(dǎo)致的貧血、疲勞、蒼白、 脫發(fā)、易怒、虛弱、異食癖、脆弱或者帶溝紋的指甲、普盧默-文森綜合征(Plu_er-Vinson syndrome)、免疫功能受損和它們的組合；由缺Zn導(dǎo)致的低鋅血癥、脫發(fā)、皮損、腹灣、身體組織的耗損、腸病性肢端皮炎、厭食癥、認(rèn)知和運(yùn)動功能受損、痛經(jīng)和它們的組合；以及缺 Cu導(dǎo)致的貧血、全血細(xì)胞減少癥、神經(jīng)退行性變、門克斯病(Menkes disease)、痙攣、共濟(jì)失調(diào)、神經(jīng)病變和它們的組合。
11.產(chǎn)生痕量元素含量提高的植物的方法，其中所述痕量元素選自Fe、Zn和Cu，所述方法包括導(dǎo)入含有外來增強(qiáng)子的構(gòu)建體從而獲得0sNAS2基因或0sNAS3基因表達(dá)增強(qiáng)的植物。
12.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述給植物導(dǎo)入構(gòu)建體包括將含有來源于花椰菜花葉病毒(CaMv)啟動子的35S增強(qiáng)子的Ti質(zhì)粒導(dǎo)入植物，其中所述植物的獲得包括挑選在編碼0sNAS2活性或0sNAS3活性的基因的上游和下游中的至少一處插入了 35S增強(qiáng)子的植物。
13.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述35S增強(qiáng)子被插入到編碼氨基酸序列SEQ.1D No. 2或SEQ.1D No. 11的基因的下游大約IOkb處。
14.權(quán)利要求12所述的方法，其中所述35S增強(qiáng)子包含四個重復(fù)的35S增強(qiáng)子。
15.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述植物是水稻。
16.權(quán)利要求11所述的方法，其中所述植物是在韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(KCTC) 保藏的保藏號為KCTC 11597BP的水稻0sNAS2_DI或者保藏號為KCTC 11598BP的水稻 0sNAS3-Dl。
17.植物的栽培方法，所述方法包括使權(quán)利要求1-6中任一項所述的植物生長在缺乏選自Fe和Zn的至少一種的條件下。
18.植物的栽培方法，所述方法包括使權(quán)利要求1-6中任一項所述的植物生長在重金屬過量的條件下。
19.權(quán)利要求18所述的方法，其中所述重金屬是大約5mM或以上的Zn、大約O.3mM或以上的Cu，或者大約O. 5mM或以上的Ni。
20.植物的栽培方法，所述方法包括使權(quán)利要求1-6中任一項所述的植物生長在高pH 條件下。
21.權(quán)利要求20所述的方法，其中pH是大約8.5或以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物中的痕量元素含量通過活化OsNAS2基因或OsNAS3基因相比野生型得以提高；還涉及包含由所述轉(zhuǎn)基因植物制備的產(chǎn)物的功能性食品。
文檔編號A23L1/29GK103025152SQ200980163414
公開日2013年4月3日 申請日期2009年12月18日 優(yōu)先權(quán)日2009年12月10日
發(fā)明者安鎮(zhèn)興, 全恩實(shí), 金宥善, 李是哲, 金潤根 申請人:浦項工科大學(xué)校 產(chǎn)學(xué)協(xié)力團(tuán)