本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種新型哮喘多肽疫苗及其制備方法。
背景技術(shù)：
：據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，目前全球有約三億人正罹患哮喘。哮喘是兒童中的最常見非傳染性疾病。哮喘不僅僅是高收入國家的公共衛(wèi)生問題，它發(fā)生在所有國家，無論發(fā)展水平高低。大多數(shù)與哮喘有關(guān)的死亡發(fā)生在低收入和中低收入國家。支氣管哮喘(Bronchialasthma，簡稱哮喘)是一種主要的非傳染性疾病，以呼吸困難和喘息反復發(fā)作為特征，它是由多種細胞(如嗜酸性粒細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、中性粒細胞、氣道上皮細胞等)和細胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病。這種慢性炎癥與氣道高反應(yīng)性相關(guān)，通常出現(xiàn)廣泛多變的可逆性氣流受限，并引起反復發(fā)作性的喘息、氣急、胸悶或咳嗽等癥狀，常在夜間和(或)清晨發(fā)作、加劇，多數(shù)患者可自行緩解或經(jīng)治療緩解。支氣管哮喘如診治不及時，隨病程的延長可產(chǎn)生氣道不可逆性縮窄和氣道重塑。目前，哮喘的相關(guān)基因尚未完全明確，但有研究表明存在有與氣道高反應(yīng)性、IgE調(diào)節(jié)和特應(yīng)性反應(yīng)相關(guān)的基因，這些基因在哮喘的發(fā)病中起著重要作用。環(huán)境因素中主要包括某些激發(fā)因素，如塵螨、花粉、真菌、動物毛屑、二氧化硫、氨氣等各種特異和非特異性吸入物；感染，如細菌、病毒、原蟲、寄生蟲等；食物，如魚、蝦、蟹、蛋類、牛奶等；藥物，如普萘洛爾(心得安)、阿司匹林等；氣候變化、運動、妊娠等都可能是哮喘的激發(fā)因素。IL-13是由Th2細胞產(chǎn)生的具有調(diào)節(jié)炎癥和免疫應(yīng)答的多功能細胞因子，通過激活嗜酸性粒細胞，減少其凋亡，促進B細胞的生成和細胞因子IgE的分泌等，它參與哮喘等多種變態(tài)反應(yīng)性疾病的發(fā)生，也與多種黏附分子及趨化因子表達增多、支氣管杯狀細胞分泌黏液增多和氣道上皮下纖維化有關(guān)。因此，抑制IL-13的功能已經(jīng)成為哮喘治療的理想靶點。目前，已經(jīng)有IL-13的單克隆抗體及可溶性IL-13受體進入了臨床Ⅱ、Ⅲ期，但是還并沒有出現(xiàn)IL-13多肽相關(guān)疫苗。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種新型治療哮喘多肽疫苗及其制備方法，為本領(lǐng)域的哮喘治療提供一種新的有效選擇。為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是提供一種融合多肽，該融合多肽是由IL-13來源的多肽片段E3和輔助性T細胞抗原多肽片段連接而成。本發(fā)明融合多肽是在E3多肽的氮端連接DiTOX多肽或者PADRE多肽而成；所述的E3多肽的氨基酸序列為LTLKELIEELSNITQ；所述的DiTOX多肽的氨基酸序列為AYNFVESIINLFQVVHNSY；所述的PADRE多肽的氨基酸序列為aK-Cha-VAaWTLKAa。其中，上述的多肽的氨基酸序列為：AYNFVESIINLFQVVHNSYNLTLKELIEELSNITQ；或為aK-Cha-VAaWTLKAaLTLKELIEELSNITQ。其中的a表示D-丙氨酸；-Cha-表示L-環(huán)己基丙氨酸。其中，上述融合多肽的N端氨基被或者乙?；Ｆ渲?，上述融合多肽的C端羧基被酰胺化。進一步的，上述融合多肽的氨基酸序列為：Ac-AYNFVESIINLFQVVHNSYNLTLKELIEELSNITQ-NH2；或為Ac-aK-Cha-VAaWTLKAaLTLKELIEELSNITQ-NH2。其中Ac-表示所連氨基酸的氨基被乙?；?；-NH2表示所連氨基酸的羧基被酰胺化；a表示D-丙氨酸；-Cha-表示L-環(huán)己基丙氨酸；本發(fā)明還提供了上述的多肽在制備哮喘疫苗中的用途。本發(fā)明也提供了一種哮喘疫苗。該哮喘疫苗是以上述的多肽為主要活性成分制備而成。其中，上述的哮喘疫苗還含有佐劑。其中，上述的哮喘疫苗中所述的佐劑為氫氧化鋁佐劑、陽離子脂質(zhì)體佐劑、GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)、γ-干擾素中的至少一種。此外本發(fā)明還提供了制備上述的融合多肽的方法以及制備權(quán)利上述的哮喘疫苗的方法。本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明融合多肽分子量小，合成方便，可以方便的使用Fmoc固相多肽合成法合成，還可以加入佐劑，如氫氧化鋁，陽離子脂質(zhì)體，GM-CSF，γ-干擾素等制成各種臨床適用的疫苗劑型；而更重要的是本發(fā)明的多肽疫苗可以有效的誘導特異性的體液免疫，可以打破免疫耐受，對哮喘動物模型中有非常優(yōu)秀的療效，在制備哮喘治療性多肽疫苗方面具有很好的應(yīng)用前景。附圖說明圖1、三種IL-13抗原短肽相關(guān)融合多肽進行動物免疫后的小鼠血清抗體滴度趨勢圖。圖2、四種融合多肽治療哮喘的動物免疫后小鼠血清抗體滴度趨勢圖。圖3、四種融合多肽治療哮喘的動物免疫實驗肺泡灌洗液(BALF)細胞計數(shù)結(jié)果。圖4、四種融合多肽治療哮喘的動物免疫實驗的相關(guān)細胞因子檢測結(jié)果圖。圖5、四種治療哮喘多肽的動物免疫實驗OVA特異的抗體滴度的檢測結(jié)果圖。圖6：四種治療哮喘多肽的動物免疫實驗病理學分析結(jié)果圖。具體實施方式本發(fā)明融合多肽是由IL-13來源的多肽片段E3和輔助性T細胞抗原多肽片段連接而成。具體而言，本發(fā)明是在E3多肽的氮端連接DiTOX多肽或者PADRE多肽得到了一種新的融合多肽。所述的E3多肽的氨基酸序列為LTLKELIEELSNITQ；所述的DiTOX多肽的氨基酸序列為AYNFVESIINLFQVVHNSY；所述的PADRE多肽的氨基酸序列為aK-Cha-VAaWTLKAa。其中，上述融合多肽的氨基被或者乙?；ｔ然灰阴；癁榭梢栽黾佣嚯姆€(wěn)定性。其中，上述融合多肽的C端羧基被酰胺化。羧基被酰胺化為可增加多肽穩(wěn)定性。進一步的，上述融合多肽的氨基酸序列為：Ac-AYNFVESIINLFQVVHNSYNLTLKELIEELSNITQ-NH2；或者為Ac-aK-Cha-VAaWTLKAaLTLKELIEELSNITQ-NH2。其中Ac-表示所連氨基酸的氨基被乙?；?；-NH2表示所連氨基酸的羧基被酰胺化；a表示D-丙氨酸；-Cha-表示L-環(huán)己基丙氨酸；本發(fā)明還提供了上述的多肽在制備哮喘疫苗中的用途。本發(fā)明也提供了一種哮喘疫苗。該哮喘疫苗是以上述的多肽為主要活性成分制備而成。其中，上述的哮喘疫苗還含有佐劑。其中，上述的哮喘疫苗中所述的佐劑為氫氧化鋁佐劑、陽離子脂質(zhì)體佐劑、GM-CSF(粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)、γ-干擾素中的至少一種。上述的多肽疫苗的使用途徑包括但不限于肌肉注射、皮下注射、皮內(nèi)注射、靜脈注射和鼻粘膜滴注等。即上述多肽疫苗的劑型可為注射劑、滴注劑或噴霧劑。進一步的，所述的注射劑為肌肉注射劑、皮下注射劑、皮內(nèi)注射劑或靜脈注射劑中的任一種。當然，所述的注射劑可以為凍干劑或者注射液。此外本發(fā)明還提供了制備上述的融合多肽的方法以及制備權(quán)利上述的哮喘疫苗的方法。本發(fā)明中的多肽可以用人工合成等方法制得。其中一種可以選用的方法為Fmoc固相多肽合成法，該方法包括如下步驟：1)以氯甲基聚苯乙烯樹脂作為不溶性的固相載體，首先將一個氨基被封閉基團Fmoc-保護的氨基酸，加入適量的縮合劑、催化劑和堿，將氨基酸共價連接到固相載體上，再以10～50％的哌啶溶液脫去氨基的封閉基團，這樣第一個氨基酸即連接到固相載體上。2)另一個氨基被封閉基團Fmoc-保護的氨基酸，加入適量的縮合劑、催化劑和堿，將氨基酸共價連接到已經(jīng)連接了氨基酸的固相載體上，再以10～50％的哌啶溶液脫去氨基的封閉基團，這樣在固相載體上就連接了一個二肽。3)重復上述肽鍵生成反應(yīng)，使待合成的多肽的按順序?qū)㈦逆湉腃端向N端生長，直到達到所需要的肽鏈長度，水解肽鏈和固相載體之間的酯鍵，用高效液相色譜純化即可得到合成好的多肽。其中，上述方法中的縮合劑為DCC(二環(huán)己基碳二亞胺)、EDCI(1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽)、PyBOP(1H-苯并三唑-1-基氧三吡咯烷基六氟磷酸鹽)、HBTU(苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯)、TBTU(2-(1H-苯并三偶氮-1-基)-1,1,3,3-四甲基脲四氟硼酸酯)中的至少一種；所述催化劑為DMAP(N，N-二甲基吡啶)、HOBT(1-羥基苯并三氮唑)中的至少一種；所述堿為三乙胺、DIEA(二異丙基乙基胺)、N-甲基嗎啉中的至少一種。其中，所述方法中的催化劑為DMAP(N，N-二甲基吡啶)、HOBT(1-羥基苯并三氮唑)中的至少一種。其中上述方法中的堿為三乙胺、DIEA(二異丙基乙基胺)、N-甲基嗎啉中的至少一種。更具體的，具合成步驟如下：1.帶側(cè)鏈保護基的Fmoc-氨基酸原料可以參考使用以下的原料2.固相合成采用HBTU/HOBT法活化氨基酸，按照序列連接到氨基樹脂上：以10mmol規(guī)模為例，稱取固相合成樹脂20克(樹脂裝載率為0.5mmol/g)，倒入多肽合成儀反應(yīng)器內(nèi)，按照目標多肽的氨基酸序列從C-端向N-端稱取40mmol相應(yīng)的帶保護基氨基酸，并排列在合成儀中。在室溫條件下，按照電腦程序分別自動進行完成合成反應(yīng)。合成結(jié)束后，得到帶側(cè)鏈保護基的多肽樹脂。取出多肽樹脂，放入真空干燥器中干燥2小時后稱重。3.脫保護基及沉淀：將帶保護基的目標多肽樹脂置入帶塞的三角燒瓶中，加入裂解試劑如下表：恒溫在25℃條件下，攪拌反應(yīng)2小時；過濾、收集濾液，樹脂用少量三氟乙酸洗滌，過濾合并收集濾液。在攪拌下，滴加3000mL冰乙醚(-10℃)，得到白色沉淀，過濾，用少量冰乙醚洗滌粗品，并將粗品放入真空干燥器中干燥過夜。4.HPLC純化通過HPLC反相純化制備得到目標多肽純品三氟乙酸鹽溶液(純度＞95％)。①色譜柱：可選用50mm*250mm的KromasilRP-1810μm制備色譜柱②流動相：A：0.1％三氟乙酸水溶液B：0.1％三氟乙酸乙腈溶液③上樣溶液：將多肽粗品(純度約40％～50％)用0.1％三氟乙酸水溶液配成濃度為8.0mg/mL(按粗品計算)的溶液，并通過0.22μm濾膜過濾。④洗脫條件：采用線性梯度洗脫，流速為100mL/min，紫外254nm檢測，洗脫梯度如表1：表1時間(min)流動相B0-0.56％0.5-56％-20％5-1520％-40％15-2040％⑤樣品收集：在5-20分鐘期間，按照50mL/瓶分布收集洗脫主峰，并對各個樣品液進行分析檢測。合并所有純度大于98％的樣品液。(4)換鹽將純化好的樣品液通過HPLC反相換鹽制備得到多肽純品乙酸鹽溶液(純度＞98％)。①色譜柱：50mm*250mmKromasilRP-1810μm制備色譜柱②流動相：A：0.5％乙酸水溶液B：0.5％乙酸乙腈溶液③上樣溶液：向多肽純?nèi)芤杭尤氲润w積超純水④洗脫條件：采用線性梯度洗脫，流速為100mL/min，紫外254nm檢測，洗脫梯度如表2：表2⑤樣品收集：收集所有洗脫主峰溶液⑥除去乙腈：將多肽溶液倒入圓底燒瓶，25℃，-0.1MPa條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去所有乙腈，剩余液體通過0.22μm濾膜過濾，留待冷凍干燥。5.冷凍干燥：將目標多肽醋酸水溶液倒入真空冷凍干燥機樣品盤內(nèi)，按照電腦程序進行凍干。所得多肽均需通過質(zhì)譜驗證正確。顯然本領(lǐng)域技術(shù)人員也可以用其他方法合成本發(fā)明中涉及的多肽。以下通過具體實施例結(jié)合附圖對本發(fā)明的內(nèi)容進行更進一步的說明。實施例1本發(fā)明對哮喘IL-13短肽的篩選及確定通過查閱文庫、檢測已篩選出IL-13抗原短肽與MHC結(jié)合的親和性大小，以及IL-13抗原短肽與IL-13受體之間的相互作用，確立新型哮喘疫苗中最優(yōu)的IL-13抗原短肽。具體方法：從AlleleFrequencyNetDatabase(AFND,http://www.allelefrequencies.net/)數(shù)據(jù)庫中篩選哮喘相關(guān)的覆蓋率從13.5％(DRB1*09:01)到1％(DRB1*14:05)的人類白細胞DR表位，總覆蓋95.9％的中國人口，獲得了20個表位。作為疫苗的候選抗原多肽，它需要與MHC具有高親和性，所以將20例中國HLA-DRB1表位通過ImmuneEpitopeDatabase(IEDB,http://www.iedb.org)中六種常用的預測方法進行篩選。在這20個表位中，能與MHC一類分子結(jié)合的表位首先被篩除掉；其次，在考慮HLA-DRB1表位的親和性中，通過AccelrysDiscoveryStudio軟件確立排名前95且在5％或者低于此百分數(shù)的抗原表位能夠?？坑贗L-13受體上并且與受體相互作用。然后，將具有高親和性的能與IL-13受體相互作用的HLA-DR表位通過分子動力學模擬來確定其在IL-13蛋白和多肽疫苗中分子構(gòu)象的穩(wěn)定性。但是，很難在原子水平上試驗模擬候選的IL-13多肽疫苗和IL-13受體之間的相互作用。因此還需要做進一步的工作。從PDB數(shù)據(jù)庫下載獲得IL-13/IL-13R復合物結(jié)構(gòu)，而候選的IL-13抗原短肽結(jié)構(gòu)由AccelrysDiscoveryStudio軟件及Amber12package組件模塊模擬獲得。在分子動力學模擬之前，每個仿真系統(tǒng)都要求能量最小化以避免空間的復雜與溶劑之間的沖突。在平衡模擬的時候，使用了PME(ParticleMeshEwald)方法以用于處理空間結(jié)構(gòu)間遠程的靜電相互作用，而這種靜電切斷距離以及范德華力作用設(shè)立為10埃個單位。在網(wǎng)絡(luò)終端系統(tǒng)中，這個模擬系統(tǒng)以100ps的速度漸漸從0加熱到300K。最后，這種長時分子動力學模擬產(chǎn)物置于在周期性邊界條件下的NPT環(huán)境中檢測500ns。同時，用SHAKE方法將所有共價鍵的耐受力控制在10-5埃個單位值。溫度的耦合常數(shù)及壓力值設(shè)置在1.0ps。對于采樣參數(shù)，總復合體的坐標保存時間間隔為0.1ps。結(jié)果：基于上述方法，用分子動力學模擬出三種運行了500ns的能與IL-13受體復合的IL-13抗原短肽片段，有作為疫苗的前景。得到的3種抗原短肽的片段為E1(DTKIEVAHF)、E2(NSYTKQLFRHGPF)、E1(LTLKELIEELSNITQ)。為了提高免疫原性，我們考慮在上述的抗原短肽的氮端偶聯(lián)輔助性T細胞抗原多肽Ditox(AYNFVESIINLFQVVHNSYN)，與IL-13R復合物的RMSD值分別為0.17、0.19和0.23nm。通過人工化學合成途徑，采用Fmoc固相多肽合成法，并在氮端的氨基進行乙?；?、碳端的羧基進行酰胺化，得到了多肽Ditox-E1(V1)、Ditox-E2(V2)和Ditox-E3(V3)，V1、V2、V3的氨基酸序列和進行的修飾參見表3。分別按下列方案配制多肽疫苗，按每只小鼠總給藥量200μl體系，不足200μl的加入生理鹽水補到200μl，由于偶聯(lián)了相同的T細胞輔助表位，則每只一相同的分子量進行免疫，每組5只小鼠的給藥量配制，每只小鼠給藥劑量如下：1)NS組：200μlPBS2)DiTOX-E1(V1)組：200μgDiTOX-E1+1000μgAl(OH)3；3)DiTOX-E2(V2)組：225μgDiTOX-E2+1125μgAl(OH)3；4)DiTOX-E3(V3)組：244μgDiTOX-E3+1220μgAl(OH)3；②免疫方案選用6～8周齡，18-20g左右的雌性Balb/c小鼠，隨機分成上述五組，多點皮下給藥。在第0、2、4、6、8、10周分別給藥一次，1、3、5、7、9、11周眼眶取血。分離血清，檢測其誘導的體液免疫反應(yīng)。檢測指標及方法：通過ELISA法檢測各組小鼠血清中的抗體滴度的產(chǎn)生情況。ELISA檢測方法為：將多肽LTLKELIEELSNITQ-NH2用包被緩沖液(0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)稀釋至1μg/ml，在96孔板中每孔加入100μl，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，PBST洗滌3次。用5％脫脂奶粉37℃封閉1小時，PBST洗滌3次。血清樣品用5％脫脂奶粉稀釋(1:100-1:12,800)，每孔加100μl稀釋的血清樣品，37℃孵育1小時。PBST洗滌5次。其后，每孔加入100μlHRP-Pr.A(1:5000稀釋)，37℃孵育1小時。PBST洗滌5次。各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液100μl，室溫顯色20分鐘后，加入1NH2SO4100μl終止反應(yīng)，450nm波長讀數(shù)。結(jié)果見圖2，相較于生理鹽水免疫組和另外兩個實驗組，DiTOX-E3(V3)這種新型治療哮喘的疫苗注射后能誘導小鼠產(chǎn)生持續(xù)增高的免疫應(yīng)答結(jié)果。因此確定E3為最優(yōu)的IL-13抗原短肽，作為后繼試驗的基礎(chǔ)。實施例3以E3為基礎(chǔ)構(gòu)建的四種多肽的動物免疫實驗及抗體滴度的評估在將E3確定為三種候選IL-13抗原短肽中，最優(yōu)的、具有治療哮喘功能的表位后，本發(fā)明考慮偶聯(lián)不同的輔助T細胞表位多肽以增強IL-13抗原短肽的免疫原性，從而獲得能達到治療哮喘疾病最好的候選多肽，以開發(fā)為疫苗。由于在確定IL-13抗原短肽表位時，偶聯(lián)了的輔助T細胞DiTOX表位肽(AYNFVESIINLFQVVHNSYN)。但是，并不肯定該表位具有增加IL-13抗原短肽免疫原性最佳的效果，所以，我們篩選另外三種表位肽：PADRE；TT8；TT9；分別與E3進行偶聯(lián)獲得TT8-E3(V4)、TT9-E3(V5)和PADRE((V6)，與DiTOX-E3(V3)一起進行相關(guān)的治療效果評估。合成方式與DiTOX-E3合成步驟相同，也均在氮端的氨基進行乙?；?、碳端的羧基進行酰胺化。表3本發(fā)明中的融合多肽V1～V6試驗設(shè)計及分組：分別按下列方案配制多肽疫苗，按每只小鼠總給藥量200μl體系，不足200μl的加入生理鹽水補到200μl，由于偶聯(lián)了不同的T細胞輔助表位，則每只一相同的分子量進行免疫，每組5只小鼠的給藥量配制，每只小鼠給藥劑量如下：1)NS組：200μlPBS；2)DiTOX-E3(V3)組：244μgDiTOX-E3+1220μgAl(OH)3；3)TT8-E3(V4)組：205μgDiTOX-E2+1025μgAl(OH)3；4)TT9-E3(V5)組：250μgDiTOX-E3+1250μgAl(OH)3；6)PADRE-E3(V6)組：178μgDiTOX-E3+890μgAl(OH)3；免疫方案：選用6～8周齡，18～20g左右的雌性Balb/c小鼠，隨機分成上述五組，多點皮下給藥。在第0、2、4、6、8、10周分別給藥一次，1、3、5、7、9、11周眼眶取血。隨后進行哮喘模型的構(gòu)建。哮喘模型構(gòu)建：在第0、1、2周，連續(xù)三周對小鼠進行一定濃度OVA(卵清蛋白)腹腔致敏，每只小鼠腹腔致敏劑量為20μgOVA+2mgAl(OH)3，在第3周每次以1％OVA的濃度對每組小鼠進行霧化造模，每天一次，連續(xù)三天。36-72后處死小鼠，收集肺泡灌洗液，分離后進行細胞計數(shù)及相關(guān)細胞因子檢測；摘眼球取血，分離血清，檢測相關(guān)細胞因子和OVA特異性抗體。檢測指標及方法：通過ELISA法檢測各組小鼠血清中的抗體滴度的產(chǎn)生情況ELISA檢測方法為：將多肽LTLKELIEELSNITQ-NH2用包被緩沖液(0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)稀釋至1μg/ml，在96孔板中每孔加入100μl，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，PBST洗滌3次。用5％脫脂奶粉37℃封閉1小時，PBST洗滌3次。血清樣品用5％脫脂奶粉稀釋(1:100-1:12,800)，每孔加100μl稀釋的血清樣品，37℃孵育1小時。PBST洗滌5次。其后，每孔加入100μlHRP-Pr.A(1:5000稀釋)，37℃孵育1小時。PBST洗滌5次。各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液100μl，室溫顯色20分鐘后，加入1NH2SO4100μl終止反應(yīng)，450nm波長讀數(shù)。結(jié)果見圖2，可以發(fā)現(xiàn)經(jīng)過四種疫苗免疫后，小鼠體內(nèi)IgG抗體滴度均得到了一定程度的激發(fā)，并隨著免疫次數(shù)的增加，抗體滴度呈現(xiàn)明顯的上升趨勢。在第四次免疫后，滴度雖有一定的上升，但已經(jīng)趨于平穩(wěn)。V3組與V6組的抗體滴度達到了10000，V4組與V5組的數(shù)據(jù)也達到了1000。將V3組與V5組進行對比，呈現(xiàn)顯著的統(tǒng)計學差異(P﹤0.05)；與V6組對比，其差異也具有統(tǒng)計學意義。實施例4以E3為基礎(chǔ)構(gòu)建的四種多肽的動物免疫實驗的肺泡灌洗液(BALF)細胞計數(shù)和相關(guān)細胞因子檢測結(jié)果：分組實驗處理見實施例3。BALF計數(shù)檢測方法為：小鼠處死時用預冷的生理鹽水進行肺泡灌洗，收集約1mL肺泡灌洗液；4℃，1200rpm離心10min收集上清，于-80℃保存；沉淀用≥300ul生理鹽水重懸，送于進行GLP檢測嗜酸性粒細胞的計數(shù)。上清運用相關(guān)試劑盒檢測方法進行檢測。IFN-γ：檢測試劑盒為R&DSystemsMouseIFN-gamma(CatalogNumber:VAL607)IL-4:檢測試劑盒為R&DSystemsMouseIL-4(CatalogNumber:VAL603)IL-13:檢測試劑盒為eBioscienceMouseIL-13(CatalogNumber:88-7137)同時摘眼球取血，離心收集上清于-20℃保存，準備檢測TotalIgE。IgE:試劑盒eBioscienceMouseIL-13(CatalogNumber:88-50460)結(jié)果表明與Normal組小鼠進行對比，造模后肺泡灌洗液中總細胞數(shù)(Tcc)，嗜酸性粒細胞(Eos)和嗜中性粒細胞(Neu)均高于未造模的(圖3)。與哮喘造模NS組進行對比，疫苗免疫后小鼠細胞數(shù)Tcc、Eos、Neu均有一定程度的下調(diào)，其中，V3組的這三種細胞計數(shù)結(jié)果下降比較明顯，其差異具有統(tǒng)計學意義(P﹤0.05)，V6的效果也較顯著。同時，在各個哮喘相關(guān)的細胞因子檢測結(jié)果顯示(圖4)，免疫組四種細胞因子的含量均有比較明顯的下降，其中，相較于NS組，V3組、V6兩組下調(diào)趨勢比較明顯。V3組在IL-13、IL-4、IFN-γ和TotalIgE四組檢測結(jié)果分別為，1.86pg/ml、15.34pg/ml、9.44pg/ml和5.650ng/ml。V3組的每種細胞因子與其它組進行對比，均具有顯著的統(tǒng)計學差異(P﹤0.05)，具有最好的效果，V6的效果也較顯著。實施例5以E3為基礎(chǔ)構(gòu)建的四種多肽的動物免疫實驗的OVA特異抗體滴度的檢測結(jié)果本實施例通過ELISA法檢測各組小鼠血清中的OVA特異抗體滴度的產(chǎn)生情況。分組實驗處理見實施例3。ELISA檢測方法為：將Ovalbumin用包被緩沖液(0.05M碳酸鹽緩沖液，pH9.6)稀釋至1μg/ml，在96孔板中每孔加入100μl，4℃過夜。次日，棄去孔內(nèi)溶液，PBST洗滌3次。用5％脫脂奶粉37℃封閉1小時，PBST洗滌3次。血清樣品用5％脫脂奶粉稀釋(1:100-1:12,800)，每孔加100μl稀釋的血清樣品，37℃孵育1小時。PBST洗滌5次。其后，每孔加入100μlHRP-Pr.A/HRP-IgE(1:5000稀釋)，37℃孵育1小時。PBST洗滌5次。各反應(yīng)孔中加入臨時配制的TMB底物溶液100μl，室溫顯色20分鐘后，加入1NH2SO4100μl終止反應(yīng)，450nm波長讀數(shù)。結(jié)果見圖5，顯示與造模組的小鼠進行對比，新型疫苗免疫后的小鼠OVA特異的IgE和IgG及分型有顯著的下調(diào)作用。實施例6以E3為基礎(chǔ)構(gòu)建的四種多肽的動物免疫實驗的免疫實驗病理學分析實施例3中的各實驗組小鼠在免疫周期中，第0、2、4、6、8、10周測量小鼠體重，并且在處死小鼠時收集心、肝、脾、肺、腎放于4％多聚甲醛中固定保存。對組織進行包埋、切片后按照H&E、PAS的染色方法進行病理切片染色，分析小鼠在免疫新型哮喘藥物后炎癥細胞、杯狀細胞的浸潤等病理現(xiàn)象是否有所改變。結(jié)果見圖6，顯示在經(jīng)過疫苗免疫后的小鼠肺部HE和PAS染色病理切片的半定量數(shù)據(jù)分析，其肺部的炎癥細胞浸潤(圖6左，氣管周和肺泡周炎癥法盲管評分數(shù))和杯狀細胞的增殖(圖6右，為肺泡杯狀細胞百分比數(shù))與造模組的小鼠肺部組織進行對比有一定程度的減少，V6的效果較顯著，V3組的效果最為顯著。當前第1頁1 2 3