本發(fā)明屬于醫(yī)用生物材料技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種可注射水凝膠，具體涉及一種基于一步物理化學法成膠的可注射水凝膠及其制備方法。

背景技術(shù)：

可注射水凝膠是指注射前為流動液體，通過注射器注入皮下或肌肉組織后，可在注射部位原位凝膠化的水凝膠。較之于傳統(tǒng)的水凝膠，可注射水凝膠應(yīng)用于生物醫(yī)藥領(lǐng)域具有諸多優(yōu)異性能。如應(yīng)用于藥物、基因或細胞包封時，可通過簡單的物理混合負載各種藥物分子、基因或細胞，并實現(xiàn)病變部位的局部給藥和長效釋藥，同時還可最大限度地保持藥物、基因、細胞的生物活性；應(yīng)用于組織工程時，注入的液體可充滿整個具有不規(guī)則形狀的缺損部位，避免了預塑型支架材料難以與修復部位吻合的缺陷。此外，可注射水凝膠無需外科手術(shù)植入，避免了植入型支架材料帶來的手術(shù)創(chuàng)傷及并發(fā)炎癥。

根據(jù)凝膠化原理的不同，可注射水凝膠分為物理水凝膠和化學水凝膠兩類。目前普遍采用三種方法制備可注射水凝膠：(i)聚合物響應(yīng)于各種刺激如pH變化、溫度變化、光等的多層次自組裝；(ii)乙烯基單體包括乙烯基功能化的PEG、PVA與多糖的原位自由基交聯(lián)；(iii)大分子前體的縮聚如邁克爾型加成反應(yīng)、Diels-Alder反應(yīng)、席夫堿反應(yīng)和施陶丁格連接反應(yīng)。其中，聚合物的自組裝屬于物理交聯(lián)，具有相對溫和細胞毒性小等優(yōu)點，其凝膠化過程通常是可逆的，所得水凝膠具有良好的自愈合性能。盡管如此，物理水凝膠通常不如化學水凝膠堅固，且物理水凝膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性也遠不如化學水凝膠。然而，化學交聯(lián)方法由于其相對快速的凝膠化過程和交聯(lián)劑的使用往往具有較強的細胞毒性。

為解決上述問題，基于次序多步交聯(lián)法制備的雙網(wǎng)絡(luò)水凝膠已被廣泛報道，這種方法是通過先物理交聯(lián)后化學交聯(lián)或先化學交聯(lián)后物理交聯(lián)。其制備的水凝膠具有極高的機械強度(約幾十兆帕)、低摩擦系數(shù)、與天然軟骨相當?shù)哪湍バ裕约皟?yōu)異的可調(diào)節(jié)的多響應(yīng)性能、熱穩(wěn)定性和適宜細胞培養(yǎng)的特性。這些特點雖然克服了傳統(tǒng)純物理水凝膠或化學水凝膠相對較差的機械性能和功能單一性等問題，但次序多步交聯(lián)仍面臨諸多實際問題，如具有步驟繁瑣、復雜和耗時的凝膠過程，并且難以精確控制每種組分的摩爾比，導致最終形成的水凝膠可塑性差、3D網(wǎng)絡(luò)各向異性以及凝膠機械強度重復性有限。因此，迫切需要建立一種更簡單和通用的方法來實現(xiàn)純物理交聯(lián)和化學交聯(lián)的功能互補，并簡化次序多步交聯(lián)繁瑣的凝膠化過程。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于以上技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種基于一步物理化學法成膠的可注射水凝膠。該水凝膠同時結(jié)合物理和化學交聯(lián)，實現(xiàn)了一步凝膠化，且原料易得，制備方法簡單，可行性強。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

基于一步物理化學法成膠的可注射水凝膠，由以下質(zhì)量百分比的原料組成：活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺(NHS-PEG-MAL)5-35％和聚酰胺基胺(PAMAM)5％，余量為水。

本發(fā)明所述活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺與聚酰胺基胺的質(zhì)量比例為1～7:1，在該質(zhì)量比范圍內(nèi)的凝膠化速率非常適用于原位注射，所得凝膠孔隙均勻，機械性能好，可塑性強，細胞毒性小。

NHS-PEG-MAL和PAMAM可同時提供物理和化學交聯(lián)位點，并基于MAL和NH₂的氫鍵作用，NHS和NH₂的酯交換作用，以及MAL自身的π-π疊加作用，實現(xiàn)一步凝膠化。

本發(fā)明所述的聚酰胺基胺為三代樹狀大分子。PAMAM代數(shù)低于三代無法成膠，因為低代數(shù)的PAMAM剛性較差，樹枝狀結(jié)構(gòu)堆疊松散，不利于成膠。

本發(fā)明所述活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺的分子量為5000Da。NHS-PEG-MAL分子量低于5000Da無法成膠，因為低分子量的PEG柔韌性較差，鏈段較短，無法將PAMAM分子交聯(lián)在一起。

本發(fā)明可注射水凝膠的pH為6～8。在酸性條件(即pH<6)下，NH₂易質(zhì)子化并形成相應(yīng)的銨離子(NH₃⁺)，導致MAL和NH₂之間的氫鍵減少甚至消失，難以成膠；在堿性條件(即pH>8)下，MAL基團的緩慢水解也可能阻礙氫鍵以及水凝膠的形成。

本發(fā)明還提供了該可注射水凝膠的制備方法：在室溫下將活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺和聚酰胺基胺分別溶解在pH為7.2-7.5的磷酸鹽緩沖液中，再按比例混合，得水凝膠。

本發(fā)明的有益效果在于：

1、本發(fā)明的可注射水凝膠可以同時提供物理和化學交聯(lián)位點，并基于MAL和NH₂的氫鍵作用，基于NHS和NH₂的酯交換作用，以及MAL自身的π-π疊加作用，實現(xiàn)一步凝膠化。

2、傳統(tǒng)的化學交聯(lián)存在相對快速和高毒性的凝膠化過程，而物理交聯(lián)存在機械強度差等問題，針對這些缺點，本發(fā)明首次提出了物理和化學交聯(lián)同時進行的一步交聯(lián)法。該方法具有諸多優(yōu)點：1)與傳統(tǒng)化學交聯(lián)相比，由于引入了物理交聯(lián)位點，其凝膠過程相對溫和安全；2)與傳統(tǒng)物理凝膠相比，由于引入化學交聯(lián)位點，所得水凝膠具有較好的機械性能，且可以通過簡單地調(diào)節(jié)兩種凝膠單元的濃度和官能團的摩爾比，實現(xiàn)對凝膠速率和機械性能的高度可控；3)與次序多步交聯(lián)相比，具有非常簡單且易于控制的膠凝化步驟，所得凝膠的3D網(wǎng)絡(luò)具有高度的均質(zhì)性，且凝膠形狀具有優(yōu)異的可塑性。

3、本發(fā)明選用PAMAM和NHS-PEG-MAL為水凝膠原料，兩種原料能同時發(fā)生物理(氫鍵)和化學(酯交換)交聯(lián)作用，且制備簡單，并已實現(xiàn)商業(yè)化。因此，其選用及對此類凝膠方法的建立、推廣和促進其在組織工程和再生醫(yī)學中的應(yīng)用具有非常重要的價值。

附圖說明

圖1為本發(fā)明濃度為10％、25％和40％w/v水凝膠的FT-IR光譜。

圖2為0.1％w/v的PAMAM、MAL-PEG-MAL和MAL-PEG-MAL/PAMAM水溶液的UV-vis光譜。

圖3為MAL-PEG-MAL/PAMAM水凝膠(25％w/v)的pH敏感性示意圖

圖4為0.1％w/v的4arm-PEG-MAL的UV-vis光譜。

圖5為MAL-PEG-MAL分子量和PAMAM代數(shù)依賴性的凝膠化行為示意圖。

圖6為本發(fā)明中一步成膠法制得的可注射水凝膠的TEM圖片，比例尺＝500nm。

圖7為10％(A1)、25％(A2)和40％w/v(A3)的NHS-PEG-MAL/PAMAM水凝膠的SEM照片(插圖顯示相應(yīng)濃度下更高分辨率的SEM照片)，比例尺＝10μm；(B)新鮮制備的NHS-PEG-MAL/PAMAM水凝膠(25％w/v)的CLSM照片，其中PAMAM由Cy5.5熒光標記，比例尺＝50μm。

圖8為10％(A1)、25％(A2)和40％w/v(A3)的NHS-PEG-MAL/PAMAM水凝膠的流變性能；(B)不同形狀的NHS-PEG-MAL/PAMAM水凝膠，比例尺＝1cm。

圖9為HeLa細胞(A1)和NIH 3T3成纖維細胞(A2)在25％w/vNHS-PEG-MAL/PAMAM水凝膠中包封12小時、24小時和48小時的CCK-8檢測。(**：p<0.01，*：p<0.05，分別與12小時的對應(yīng)濃度相比)。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明的實質(zhì)性內(nèi)容作進一步詳細的描述。

實施例1

基于一步物理化學法成膠的可注射水凝膠，由以下質(zhì)量百分比的原料組成：活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺5％和聚酰胺基胺5％，余量為水。

實施例2

基于一步物理化學法成膠的可注射水凝膠，由以下質(zhì)量百分比的原料組成：活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺35％和聚酰胺基胺5％，余量為水。

所述活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺的分子量為5000Da。

所述的聚酰胺基胺為三代樹狀大分子。

該可注射水凝膠的pH為8。

實施例3

基于一步物理化學法成膠的可注射水凝膠，由以下質(zhì)量百分比的原料組成：活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺20％和聚酰胺基胺5％，余量為水。

所述活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺的分子量為5000Da。

所述的聚酰胺基胺為三代樹狀大分子。

該可注射水凝膠的pH為7.4。

實施例4

基于一步物理化學法成膠的可注射水凝膠，由以下質(zhì)量百分比的原料組成：活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺15％和聚酰胺基胺5％，余量為水。

所述活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺的分子量為5000Da。

所述的聚酰胺基胺為三代樹狀大分子。

該可注射水凝膠的pH為7.5。

實施例5

基于一步物理化學法成膠的可注射水凝膠，由以下質(zhì)量百分比的原料組成：活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺10％和聚酰胺基胺5％，余量為水。

所述活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺的分子量為5000Da。

所述的聚酰胺基胺為三代樹狀大分子。

該可注射水凝膠的pH為6。

實施例6

本實施例為實施例1的可注射水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

A、在室溫下將活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺和聚酰胺基胺分別溶解在pH 7.2的磷酸鹽緩沖液中，將活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺配制為100g/L的溶液，將聚酰胺基胺配制為100g/L的溶液。

B、將A步驟得到的活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺溶液與聚酰胺基胺溶液按1：1體積混合，得水凝膠。

實施例7

本實施例為實施例2的可注射水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

A、在室溫下將活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺和聚酰胺基胺分別溶解在pH 7.5的磷酸鹽緩沖液中，將聚酰胺基胺配制為100g/L的溶液，將活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺配制為700g/L的溶液。

B、將A步驟得到的活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺溶液與聚酰胺基胺溶液按1:1體積混合，得水凝膠。

實施例8

本實施例為實施例3的可注射水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

A、在室溫下將活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺和聚酰胺基胺分別溶解在pH 7.4的磷酸鹽緩沖液中，將聚酰胺基胺配制為100g/L的溶液，將活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺配制為400g/L的溶液。

B、將A步驟得到的活性酯聚乙二醇馬來酰亞胺溶液與聚酰胺基胺溶液按1:1體積混合，得水凝膠。

對照實驗

本發(fā)明選擇三代(G3)的PAMAM和NHS-PEG5000-MAL作為模型元素A和B。

實驗條件：室溫下在pH 7.4的磷酸鹽緩沖液(PBS)中混合100g/L的PAMAM與400g/L的NHS-PEG-MAL(質(zhì)量比為1:4)得到25％w/v凝膠。

對照品：使用相同PEG分子量為5000Da的(A組)馬來酰亞胺聚乙二醇甲氧基(MAL-PEG-OMe)和PAMAM、(B組)N-羥基琥珀酰亞胺聚乙二醇甲氧基(NHS-PEG-OMe)和PAMAM、(C組)MAL-PEG-MAL和PAMAM、(D組)NHS-PEG-NHS和PAMAM作為對照。

結(jié)果：A組和B組的混合溶液未發(fā)生凝膠化；而C組、D組和NHS-PEG-MAL在幾分鐘內(nèi)均與PAMAM形成穩(wěn)定的水凝膠。

由此可見，具有單一物理(僅MAL)或化學(僅NHS)交聯(lián)位點的PEG不能與PAMAM形成水凝膠。相反，如果它具有兩個交聯(lián)位點，兩個MAL或兩個NHS都可以與PAMAM形成穩(wěn)定的水凝膠。表明基于MAL的純物理交聯(lián)和基于NHS的純化學交聯(lián)均可以與PAMAM形成水凝膠。此外，基于NHS-PEG-MAL的水凝膠的形成強有力地證明了我們一步凝膠化方法的可行性，并通過以下驅(qū)動力實現(xiàn)：基于NHS和NH₂的酯交換作用，MAL和NH₂的氫鍵作用，以及NHS-PEG-PEG上的MAL基團之間的非共價π-π疊加作用。

光譜分析

為了證實兩個模型元素之間的氫鍵作用，進行傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜分析。如圖1所示，NHS-PEG-MAL上的MAL基團的α,β-不飽和酮羰基(-C＝O)的伸縮振動在1720cm^-1處具有典型的吸收帶。然而，當10g/L的NHS-PEG-MAL與不同濃度的PAMAM(100g/L,400g/L和700g/L)形成凝膠時，1720cm^-1處吸收強度顯著降低，表明MAL上的酮羰基與PAMAM上的NH₂之間存在氫鍵作用。

此外，碳-碳雙鍵(-C＝C)在1650cm^-1處的典型伸縮振動吸收強度的恒定，進一步證實了基于MAL和NH₂的相互作用是氫鍵而不是其它化學作用，如邁克爾加成。0.1％w/v PAMAM、MAL-PEG-MAL和MAL-PEG-MAL/PAMAM水溶液的UV-vis光譜可以進一步驗證該結(jié)論。

如圖2所示，PAMAM由于其飽和烷烴結(jié)構(gòu)無特征吸收帶，MAL-PEG-MAL在290nm處的特征吸收峰是源于MAL基團上ππ(C＝C)和nπ(C＝O)發(fā)色團的共軛效應(yīng)激發(fā)的。隨著PAMAM的加入，其吸收強度顯著的增加并伴隨明顯的藍移(從290移動到250nm)進一步表明MAL和NH₂之間未發(fā)生邁克爾加成反應(yīng)。因此，這些結(jié)果進一步證實了MAL和NH₂之間氫鍵作用的存在。

MAL-PEG-MAL/PAMAM水凝膠(25％w/v，通過混合100g/L PAMAM和400g/L MAL-PEG-MAL)優(yōu)異的pH敏感性和可逆性也證實了MAL和NH₂之間的氫鍵作用。如圖3所示，MAL-PEG-MAL/PAMAM水凝膠只能在中性條件(pH6～8)下形成。在酸性條件(即pH<6)下，NH₂易質(zhì)子化并形成相應(yīng)的銨離子(NH₃⁺)，導致MAL和NH₂基團之間的氫鍵作用減少甚至消失，難以成膠；在堿性條件(即pH>8)下，MAL基團的緩慢水解也可能阻礙氫鍵以及水凝膠的形成。

除了酯交換和氫鍵作用外，非共價π-π疊加也參與了一步物理化學水凝膠的形成，通過4arm-PEG-MAL水凝膠的形成可以證明這一結(jié)論。在這個體系中MAL基團是唯一的交聯(lián)位點，其非共價π-π疊加是形成水凝膠的唯一驅(qū)動力。為證明這一結(jié)論，在48小時內(nèi)跟蹤了4arm-PEG-MAL水溶液(0.1％w/v)的UV-vis光譜。如圖4所示，由于MAL基團的非共價π-π疊加作用，其在290nm處的特征發(fā)色團強度隨時間的推移逐漸增加。并且值得注意的是，25％w/v的4arm-PEG-MAL水凝膠的凝膠化時間(約12小時)遠遠長于比本發(fā)明的一步法水凝膠的凝膠時間(約幾十秒至幾分鐘)，表明非共價π-π堆疊是相對較弱的驅(qū)動力，可緩慢地參與3D網(wǎng)絡(luò)的逐漸完善過程。

圖1-圖4充分證明了酯交換、氫鍵作用和非共價π-π疊加是形成一步物理化學水凝膠的主要驅(qū)動力。除此之外，本發(fā)明還發(fā)現(xiàn)其他因素，如PEG的分子量和PAMAM的代數(shù)也可顯著影響水凝膠的形成。如圖5所示，PEG分子量低于5000Da(即2000和3500Da)的NHS-PEG-MAL在任何濃度和任何摩爾比下均不能與3代的PAMAM形成水凝膠。類似地，當PAMAM代數(shù)低于三代(即G2)時也不能與NHS-PEG5000-MAL在任何濃度和任何摩爾比下發(fā)生凝膠化。PEG分子量依賴性凝膠化行為可能與PEG的鏈長度和柔性相關(guān)。因為低分子量的PEG柔韌性較差，鏈段較短，無法將PAMAM分子交聯(lián)在一起；此外，PAMAM代數(shù)依賴性凝膠化行為可歸因于不同代數(shù)PAMAM的表面結(jié)構(gòu)和剛度的不同。代數(shù)低的PAMAM剛性較差，樹枝狀結(jié)構(gòu)堆疊膠松散，不利于成膠。

總之，上述結(jié)果驗證了本發(fā)明的一步凝膠化的可行性，這種水凝膠可通過兩種常見的，廣泛使用的和商業(yè)化的成膠單元(PAMAM和NHS-PEG-MAL)之間同時發(fā)生的物理(氫鍵和π-π堆疊)和化學(酯交換)交聯(lián)作用來實現(xiàn)。通過水凝膠的微觀結(jié)構(gòu)進一步證實了這一結(jié)論。如圖6所示，25％w/v水凝膠的TEM照片顯示其具有均勻且直徑約500nm的樹枝狀交聯(lián)結(jié)構(gòu)，這種樹枝狀的納米結(jié)構(gòu)很好地表明了PAMAM和NHS-PEG-MAL之間通過在PAMAM的納米球狀結(jié)構(gòu)表面上發(fā)生的酯交換作用,氫鍵作用和π-π堆疊相互作用纏結(jié)在一起。這種枝晶形態(tài)也在以前的研究中也曾被觀察到過。

性能評估

在建立這種新穎的一步凝膠化方法之后，本發(fā)明通過以下實驗系統(tǒng)地評估了該水凝膠在孔隙率、凝膠化速率、機械強度方面的可控性以及水凝膠的均勻性、可塑性和細胞毒性。

1、電子顯微鏡掃描

采用SEM觀察一步物理化學水凝膠的內(nèi)部形態(tài)，將100g/L PAMAM分別與不同質(zhì)量濃度(100g/L,400g/L和700g/L)的NHS-PEG-MAL混合(PAMAM:NHS-PEG-MAL＝1/1、1/4和1/7)制備10％，25％和40％w/v的水凝膠。如圖7A所示，三種凍干水凝膠的截面都呈現(xiàn)出連續(xù)的多孔結(jié)構(gòu)，孔隙率隨凝膠濃度的增加而逐漸增加。本發(fā)明的一步物理化學水凝膠除了在孔隙度方面具有良好的可控性外，還具有高度的均質(zhì)性，其結(jié)果如新鮮制備的25％w/v水凝膠的共聚焦顯微鏡照片所示(圖7B)。該水凝膠均勻的多孔結(jié)構(gòu)賦予它們諸多優(yōu)點，如可作為各種生物活性分子遞送或用于細胞包封和培養(yǎng)的理想載體或支架。此外，有研究表明水凝膠的高度均質(zhì)性有利于提高水凝膠的機械強度并為細胞粘附和增殖提供更合適的框架。

2、流變性能測試

使用動態(tài)流變儀測量水凝膠的凝膠化速率和機械性能，如圖8所示。圖8A1中，水凝膠的凝膠化時間(G'和G"之間的交叉點對應(yīng)的橫坐標)表現(xiàn)出對凝膠濃度的高度依賴性。通過將凝膠濃度從40％調(diào)節(jié)至10％w/v，凝膠化時間對應(yīng)的從幾十秒變?yōu)閹追昼?，表明了膠凝時間的優(yōu)異可控性，這是水凝聚用于原位注射的一個最基本和最重要的先決條件。此外，此類水凝膠的最低凝膠化濃度(MGC)為10％w/v。有趣的是，此類水凝膠的儲能模量(G')也具有凝膠濃度的高度依賴性，隨凝膠濃度從10％增加到40％w/v，G'從400Pa迅速增加1MPa。值得注意的是，40％w/v水凝膠的儲能模量(1MPa)顯著高于目前報道的大多數(shù)物理水凝膠。頻率掃描實驗進一步證實了此類水凝膠機械強度的良好可控性和40％w/v水凝膠超高的機械強度(圖8A2)。如圖8A3所示，在應(yīng)力小于等于100％時，40％w/v水凝膠的G'和G"值保持恒定，應(yīng)變達到1000％以上時，G'和G"值開始快速降低。以上結(jié)果表明一步凝膠法形成的水凝膠在承受相當大的外力破壞下能夠保持結(jié)構(gòu)完整性，并且這種抗破壞能力隨水凝膠濃度而增加。這種優(yōu)異的機械強度完全符合藥物遞送和組織工程應(yīng)用的期望，因為水凝膠應(yīng)用在這些領(lǐng)域時需要承受由外部機械負載引起的環(huán)境變化，還需要抵抗損傷區(qū)域中的高壓以避免包載的生物活性分子或細胞的突釋。

除了高度的均質(zhì)性，及孔隙率，凝膠速率和機械性能的優(yōu)異可控性外，本發(fā)明的水凝膠還具有優(yōu)異的可塑性。如圖8B所示，水凝膠可以形成我們期望的各種形狀，例如正方形，圓形，菱形和三角形，說明可以將凝膠的前體溶液直接注射到復雜形狀的病變區(qū)域中以實現(xiàn)原位和微創(chuàng)的凝膠過程。

如上所述，本發(fā)明的一步凝膠法與傳統(tǒng)的物理，化學和次序多步交聯(lián)策略相比具有諸多優(yōu)點，包括優(yōu)異的機械性能，良好的均質(zhì)性和可塑性，以及在凝膠化速率，孔隙率和機械性能等方面的優(yōu)異可控性。這種高度可控性可能源于交聯(lián)位點的確定性，參與交聯(lián)的官能團數(shù)目的精確性，以及兩種凝膠單元濃度的精確調(diào)控性。

3.細胞毒性檢測

眾所周知，阻礙可注射水凝膠廣泛使用的重要原因之一是原位凝膠化過程引起的細胞毒性。因此，本發(fā)明通過活/死細胞染色來檢測我們一步凝膠化過程的細胞毒性。本發(fā)明直接在已經(jīng)鋪展開的HeLa細胞和鼠源NIH 3T3成纖維細胞的表面原位成膠。并以相同質(zhì)量分數(shù)(25％w/v)的基于NHS-PEG-NHS和MAL-PEG-MAL的純化學和物理凝膠為對照材料。

孵育24小時后，在基于NHS-PEG-NHS的純化學水凝膠中可見大量死細胞，這可能是由于它們相對快速的凝膠化過程造成的。相比之下，在基于MAL-PEG-MAL的純物理水凝膠和本發(fā)明的一步物理化學水凝膠中幾乎無死細胞，表明本發(fā)明的一步凝膠化方法具有相對溫和安全的凝膠化過程。這是可注射水凝膠應(yīng)用于原位注射的一個先決條件。該結(jié)果表明本發(fā)明的一步物理化學水凝膠在各種生物醫(yī)學應(yīng)用(如原位藥物輸送系統(tǒng))中具有巨大的潛力。

本發(fā)明進一步將10⁵個HeLa細胞和NIH 3T3成纖維細胞直接與水凝膠前提溶液混合用于制備包封有細胞的水凝膠，并在分別培養(yǎng)12，24和48小時后進行活/死細胞染色和CCK8檢測。封裝在25％w/v水凝膠中的HeLa細胞和NIH3T3成纖維細胞在12至48小時內(nèi)呈現(xiàn)良好的生長趨勢，并且在成膠24小時后可以觀察到良好的拉伸紡錘形形態(tài)。CCK8結(jié)果也表明，所有水凝膠中的細胞都保持良好的活性，例如，在10％，25％和40％w/v水凝膠中HeLa細胞(圖9A1)的細胞存活率分別達到94％、85％和82％，略高于NIH 3T3細胞的約92％、86％和77％(圖9A2)。這些結(jié)果進一步證實本發(fā)明的一步凝膠化方法是溫和安全的，并具有良好的生物相容性，這可能歸結(jié)于此類水凝膠適宜的孔隙率和機械強度為細胞生長和增值提供了理想的微環(huán)境。

因此，本發(fā)明的一步物理化學水凝膠具有巨大的應(yīng)用潛力，如在再生醫(yī)學中用于細胞包封，甚至用作3D生物打印的生物墨水。此外，PAMAM獨特的納米球狀結(jié)構(gòu)不僅可以提供大的內(nèi)腔用于包封各種生物活性分子或藥物，而且還提供豐富的外周NH₂基團用于攜載或化學鍵合各種藥物或治療分子(即光敏劑，CO/NO釋放分子)用于化療、光動力學治療(PDT)、氣體治療，以及多種藥物聯(lián)合治療。

綜上，本發(fā)明提供了一種用于制備可注射水凝膠的同時結(jié)合了物理和化學交聯(lián)的一步凝膠化方法，該方法制備超簡便且具有多功能性。由于其確定的交聯(lián)位點，精確的交聯(lián)基團數(shù)目，以及兩種膠凝單元濃度(NHS-PEG-MAL和PAMAM)的精確可控性，該方法不僅在凝膠化速率，孔隙率和機械性能方面表現(xiàn)出優(yōu)異的可控性，還顯示出優(yōu)于傳統(tǒng)水凝膠的諸多優(yōu)點，如優(yōu)異的機械性能，良好的均質(zhì)性、可塑性和生物相容性。此外，PAMAM內(nèi)部的大內(nèi)腔和豐富的外圍NH₂賦予所獲得的水凝膠具有多重功能，使其可以成為聯(lián)合多種治療方法的平臺。