本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體的說(shuō)，涉及一種黃鱔醛酮還原酶基因及其體外表達(dá)方法。
背景技術(shù)：
：醛酮還原酶(Aldo-ketoreductase，AKR)廣泛存在于生物界，是一類依賴于NAD(P)H的分子量為34kDa-37kDa的單體還原酶蛋白?，F(xiàn)報(bào)道的AKR超家族成員有16個(gè)亞家族共190多個(gè)成員，包括醛糖還原酶、酮還原酶、羥化類固醇脫氫酶、2，5-二酮基-D-葡萄糖酸還原酶、多元醇脫氫酶、二氫二醇脫氫酶等多種能夠代謝機(jī)體羰基化合物的酶類。在結(jié)構(gòu)上，AKR超家族都包含一個(gè)(α/β)8的桶狀結(jié)構(gòu)、相似的輔酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域和一個(gè)高度保守的Asp，Tyr，Lys，His催化四分體。在功能上，AKR不僅在生物體應(yīng)對(duì)外源性或內(nèi)源性羰基化合物解毒過(guò)程中具有重要作用，還參與了生物體內(nèi)氧化應(yīng)激、致癌化合物的降解、糖尿病并發(fā)癥及腫瘤發(fā)生等過(guò)程。通過(guò)輔酶NAD(P)H提供還原力，AKR可以將醛酮類化合物通過(guò)加氫的方式還原成相對(duì)應(yīng)的醇類化合物，從而降低毒害作用。其底物包括脂肪類醛酮化合物、芳香類化合物、醛糖、兒茶酚胺、甾類、視黃醛、前列腺素、黃曲霉素等。研究發(fā)現(xiàn)，AKR除了參與機(jī)體的疾病發(fā)生過(guò)程，還作為重要的防御酶存在。AKR抑制劑在癌癥及糖尿病并發(fā)癥臨床治療等方面具有重要的意義，目前已成為研究的熱點(diǎn)。相比哺乳動(dòng)物，對(duì)于魚類AKR的研究報(bào)道較少。國(guó)外有學(xué)者研究了苯并芘(BaP)處理羅非魚后其肝組織AKR1A1基因的表達(dá)情況，認(rèn)為羅非魚的AKR1A1可能在BaP解毒過(guò)程中具有重要的作用。除此之外，其它魚類的AKR基因及其功能的研究國(guó)內(nèi)外尚無(wú)報(bào)道。從黃鱔(Monopterusalbus)中克隆到醛酮還原酶(Eakr)基因，對(duì)其進(jìn)行體外表達(dá)，對(duì)于進(jìn)一步探索魚類醛酮還原酶基因的功能具有重要意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：有鑒于此，本發(fā)明提供一種其能表達(dá)出大量高質(zhì)量的黃鱔Eakr蛋白的黃鱔醛酮還原酶基因及其體外表達(dá)方法。一種黃鱔的醛酮還原酶基因，其核苷酸序列為SEQIDNO：1。一種如上所述的黃鱔的醛酮還原酶基因所編碼的氨基酸序列，其序列編號(hào)為SEQIDNO：2。一種黃鱔Eakr基因的體外表達(dá)方法，包括以下步驟：步驟(1)黃鱔Eakr基因的克?。喊凑誘rizol試劑說(shuō)明書提取黃鱔總RNA，用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA第一鏈，于-80℃保存；根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道的AKR基因序列，設(shè)計(jì)第一對(duì)特異性引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得黃鱔Eakr基因cDNA片段；根據(jù)SmartRACE試劑盒說(shuō)明書，進(jìn)行5’RACE-PCR和3’RACE-PCR擴(kuò)增，獲得黃鱔Eakr基因cDNA片段的5’末端和3’末端，拼接獲得黃鱔Eakr基因全長(zhǎng)cDNA序列；黃鱔Eakr基因的核苷酸和氨基酸序列分別如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示；步驟(2)黃鱔Eakr基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)黃鱔Eakr基因全長(zhǎng)cDNA序列，設(shè)計(jì)第二對(duì)特異性引物re-ex-F和re-ex-R，分別在上、下游引物添加了EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)；以黃鱔cDNA為模板，re-ex-F和re-ex-R為引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增；將PCR產(chǎn)物和pET-28a(+)表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，回收純化，連接轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，獲得原核表達(dá)載體pET-Eakr；步驟(3)黃鱔Eakr重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和純化：將步驟(2)得到的原核表達(dá)載體pET-Eakr轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，在含有50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)至OD值為0.6時(shí)，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)；離心收集菌體，超聲破碎，然后加入5×上樣緩沖液進(jìn)行12％SDS-PAGE電泳檢測(cè)目標(biāo)蛋白的表達(dá)情況；以1％的接種量將能表達(dá)重組蛋白的BL21添加到含有50μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，大量培養(yǎng)，誘導(dǎo)表達(dá)；將誘導(dǎo)好的菌液離心，收集菌體超聲波破碎，再離心收集沉淀；將沉淀用平衡緩沖液溶解，收集上清，上樣、結(jié)合、洗脫、透析，獲得純化的黃鱔Eakr重組蛋白；用BCA法測(cè)蛋白濃度，SDS-PAGE電泳檢測(cè)純化的黃鱔Eakr重組蛋白。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益效果：1)本發(fā)明采用分子生物學(xué)的方法，首次分離鑒定了黃鱔醛酮還原酶基因；2)利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建了黃鱔Eakr基因原核表達(dá)載體，并純化了其表達(dá)蛋白，為進(jìn)一步制備抗體奠定基礎(chǔ)；3)黃鱔Eakr重組蛋白能夠催化丙酮醛、丙酮、黃體酮和甲睪酮等不同底物，對(duì)醛酮還原酶的工業(yè)化應(yīng)用具有理論指導(dǎo)意義和應(yīng)用參考價(jià)值。附圖說(shuō)明圖1為菌液PCR擴(kuò)增和雙酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)圖；圖2為黃鱔Eakr基因小量表達(dá)和重組蛋白純化后的常規(guī)SDS-PAGE電泳檢測(cè)圖。具體實(shí)施方式下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例。下面通過(guò)參考附圖描述的實(shí)施例是示例性的，僅用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。為本發(fā)明實(shí)施方式提供一種黃鱔的醛酮還原酶基因的體外表達(dá)方法，其包括以下步驟：步驟1黃鱔Eakr基因的克?。喊凑誘rizol試劑說(shuō)明書提取黃鱔總RNA，利用M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，cDNA第一鏈的合成根據(jù)SmartRACE試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，于﹣80℃低溫保存。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)已報(bào)道的AKR基因序列進(jìn)行同源比對(duì)，設(shè)計(jì)特異性引物AKR-F(5’-ACATCCAGACCAGCGACCTGCA-3’)和引物oligod(T)(5’-TGCCGAATCTTTTTTTTTTTTTAGC-3’)。以黃鱔cDNA第一鏈為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得黃鱔Eakr基因cDNA片段；特異性引物AKR-F與oligod(T)的核苷酸序列分別如SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示。PCR反應(yīng)體系(25μL)組成體積(μL)ddH2O16.210×buffer2.5dNTP2AKR-F1oligod(T)1DNA2TaqE0.3PCR反應(yīng)程序：根據(jù)所得黃鱔Eakr基因cDNA片段，設(shè)計(jì)特異性引物AKR-GSP5(5’-GTATCTCTTGTCGCTATAGTCCCACCAGTG-3’)和AKR-GSP3(5’-TGTGGGCTGCAGGCTAGGTGTCGC-3’)，特異性引物AKR-GSP5與AKR-GSP3的核苷酸序列分別如SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示。按照SmartRACE試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行5’RACE和3’RACE擴(kuò)增，獲得黃鱔Eakr基因cDNA片段的5’末端和3’末端。將黃鱔Eakr基因的5’末端和3’末端進(jìn)行拼接，獲得其cDNA全長(zhǎng)序列。黃鱔Eakr基因的核苷酸和氨基酸序列分別如SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示。5’RACE-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為(50μL)：組成體積(μL)PCR-gradewater3510×BDAdvantagebuffer2PCRbuffer5dNTPMix(10mM)1μPM5GSP15’-RACE-ReadycDNA2150×BDAdvantage2PolymeraseMix13’RACE-PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為(50μL)：反應(yīng)條件為：步驟2黃鱔Eakr基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建：根據(jù)黃鱔Eakr基因的cDNA序列，設(shè)計(jì)特異性引物re-ex-F(5’-GCCGAATTCATGCCTGTGGTTCCCAAAG-3’)和re-ex-R(5’-CCGAAGCTTTTAGCTCCTGTACTCATCGC-3’)，分別在上、下游引物添加了EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)。以黃鱔cDNA為模板，采用引物re-ex-F和re-ex-R擴(kuò)增黃鱔Eakr基因的成熟肽片段。特異性引物re-ex-F與re-ex-R的核苷酸序列分別如SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示。PCR反應(yīng)體系(25μL)：反應(yīng)條件為：將PCR產(chǎn)物與原核表達(dá)載體pET-28a同時(shí)進(jìn)行EcoRI和HindIII雙酶切，分別用DNA凝膠回收試劑盒純化酶切產(chǎn)物，經(jīng)T4DNA連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，在含有卡那霉素(50μg/mL)的平板上進(jìn)行抗性篩選。挑取陽(yáng)性克隆接種到LB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，37℃、220r/m，培養(yǎng)8h后用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，采用質(zhì)粒PCR和雙酶切的方法驗(yàn)證重組質(zhì)粒。驗(yàn)證結(jié)果如圖1所示，已成功構(gòu)建原核表達(dá)載體，命名為pET-Eakr；其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；1為PCR擴(kuò)增結(jié)果；2為雙酶切結(jié)果。步驟3黃鱔Eakr重組蛋白的表達(dá)和純化：黃鱔Eakr重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：取1ng原核表達(dá)載體pET-Eakr轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，涂布于含50μg/mL的卡那霉素平板上進(jìn)行抗性篩選，培養(yǎng)溫度為37℃，培養(yǎng)時(shí)間為過(guò)夜培養(yǎng)。篩選結(jié)束后轉(zhuǎn)至LB培養(yǎng)基(含卡那霉素50μg/mL)中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，200r/min。菌體進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期后加添加IPTG至終濃度0.1mmol/L，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)3小時(shí)后離心收集菌體沉淀，超聲波破碎，加入5×上樣緩沖液進(jìn)行12％常規(guī)SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)情況。常規(guī)SDS-PAGE電泳檢測(cè)重組蛋白的表達(dá)結(jié)果如圖2所示，重組蛋白分子量為37.7kDa。黃鱔Eakr重組蛋白的純化：將上述經(jīng)過(guò)IPTG誘導(dǎo)的菌液按照1：100的比例接種到500mLLB培養(yǎng)基(含卡那霉素50μg/mL)中進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37℃，200r/min培養(yǎng)時(shí)間為過(guò)夜培養(yǎng)。培養(yǎng)結(jié)束后，離心收集菌體沉淀，用50mmol/L的PBS(pH8.0)懸浮菌液，進(jìn)行超聲波破碎并收集沉淀部分，用裂解緩沖液(6mol/L鹽酸胍，10mmol/L咪唑，50mmol/LPBSpH＝8.0)洗滌3次。加入適量裂解緩沖液溶解，對(duì)上清液進(jìn)行過(guò)濾；濾液用1mL的親和層析鎳柱His-Binding-Resin進(jìn)行純化；純化后的蛋白用不同濃度的鹽酸胍緩沖液進(jìn)行透析復(fù)性，鹽酸胍緩沖液濃度為6、3、1.5、0.5、0.1mol/L，用透析袋濃縮透析液；將收集到的黃鱔Eakr蛋白用BCA法測(cè)蛋白濃度，并用常規(guī)SDS-PAGE法，檢測(cè)重組蛋白的條帶大小，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，黃鱔Eakr重組蛋白為單一條帶，分子量為37.7kDa；其中M為DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)；CK1為陰性對(duì)照；CK2為陽(yáng)性對(duì)照；1為重組質(zhì)粒pET-Eakr小量誘導(dǎo)產(chǎn)物；2為純化的黃鱔Eakr蛋白。`步驟4黃鱔Eakr重組蛋白活性的測(cè)定：醛酮還原酶的酶活單位定義：在一定條件下,在37℃下，1min消耗1μmolNADH/NADPH稱為一個(gè)酶活單位(U)。酶比活力是指每毫克質(zhì)量的蛋白質(zhì)中所含酶的催化活力。U(酶活力)＝ΔA*V/6.22U/mg(酶比活力)＝ΔA*V/(6.22*M)ΔA為1min內(nèi)340nm處吸光度的變化，V為反應(yīng)液體系(mL)，M為酶液中蛋白質(zhì)的質(zhì)量(mg)，6.22為摩爾吸收系數(shù)(L/mL/cm)酶活測(cè)定的方法：先加好PBS、底物和甲醇，37℃水浴5min，再加入Eakr重組蛋白和輔酶，340nm處檢測(cè)吸光度隨時(shí)間的變化值。體系為：1000μLPH7.4100mMPBS,850μL底物，80μL甲醇，50μL酶液(約0.014mg),20μL輔酶(10mg/mL)。對(duì)不同底物的酶活測(cè)定結(jié)果如表1所示，黃鱔Eakr重組蛋白對(duì)丙酮醛、丙酮、黃體酮等的酶比活力較高，而對(duì)十二酸甲睪酮和葡萄糖則沒(méi)有活力。本實(shí)施方式中，所述底物為丙酮醛、丙酮、黃體酮和甲睪酮中的至少一種。表1黃鱔Eakr重組蛋白對(duì)不同底物的酶比活力本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下有益效果：1)本發(fā)明采用分子生物學(xué)的方法，首次分離鑒定了黃鱔醛酮還原酶基因；2)利用基因工程技術(shù)，構(gòu)建了黃鱔Eakr基因原核表達(dá)載體，并純化了其表達(dá)蛋白，為進(jìn)一步制備抗體奠定基礎(chǔ)；3)黃鱔Eakr重組蛋白能夠催化丙酮醛、丙酮、黃體酮和甲睪酮等不同底物，對(duì)醛酮還原酶的工業(yè)化應(yīng)用具有理論指導(dǎo)意義和應(yīng)用參考價(jià)值。盡管已經(jīng)示出和描述了本發(fā)明的實(shí)施例，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以理解：在不脫離本發(fā)明的原理和宗旨的情況下可以對(duì)這些實(shí)施例進(jìn)行多種變化、修改、替換和變型，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求及其等同物限定。<110>長(zhǎng)江大學(xué)<120>一種黃鱔醛酮還原酶基因及其體外表達(dá)方法<160>8<210>1<211>1320<212>DNA<213>黃鱔（Monopterusalbus）<400>1acgttagtctgctgctgttggttcgagcacagcttgtaaggaggacaaacttctttccca60gcccttgtagcaggatgcctgtggttcccaaagtgacactgcctgggggtctggagatct120gtcgggtcctgaatgggatgtggcaggtgtctggtaagcacggggcagtggatcgagcca180aagcagttgaggccatgcaggcctatgtagatgctggtctgaccacattcgacatggcag240acatttatgggcctgcagaggaaatatttgggcagttcaacagcaagctgaagtcctctg300gagatgctgcaccagctgtgcagagtctgaccaaatacgttccacaaccaggaccaatgg360accgcaaggtggtggagaaggcaatacagctctccatgactcggatgcaggtggacagtc420tggactgtgttcagtttcactggtgggactatagcgacaagagatacctggaggcactgg480gacacctgtttgatatgcaacaggagggactcatacgtgagctttccctcactaacttcg540acacacagagactggaggagatcagcaacagaggcatccgcatttccagcaaccaggttc600agtactctgtgattgaccagcgacctgcagtgaagatggaacagttctgtctggccaatg660acatccagctcctcacttatggcactctggctggcggtctgctcacagagcgctatctgg720gcaaggcggagccaaactccaaggcggagctctatactgcctccctctcaagctacaaga780agatgatcgacacttggggtggctggagccttttccaggacctacttgttactttggagg840ctgttgccaggagacacaactgccccatggcctgtgtcgcaacgcgttacgtgctggacc900gccctgcagtgggcggggtcattgtgggctgcaggctaggtgtcgcaaatgcggggcagc960acatcggtgacagtctgcatagctgcagccctgacctgcggttgacagcggaggatctcg1020ctgctatcaaagctgtgacacagcgctccagggacctcatggtgtggattggggactgcg1080gcgatgagtacaggagctaaaggcagaaggggtgaggaatagaggcagagtaaagggaaa1140catgcagcagtcacacatgcaacagaataaaatgcagctgctgctgaaaatcatttcaat1200cctccatttcatttttaattgaatcaaattagtttttgcataaagtctgtagctgttcct1260ctgttacacactataaagaaccaacagcaaattgtaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa1320<210>2<211>341<212>PRT<213>黃鱔（Monopterusalbus）<400>2MetProValValProLysValThrLeuProGlyGlyLeuGluIleCys151015ArgValLeuAsnGlyMetTrpGlnValSerGlyLysHisGlyAlaVal202530AspArgAlaLysAlaValGluAlaMetGlnAlaTyrValAspAlaGly354045LeuThrThrPheAspMetAlaAspIleTyrGlyProAlaGluGluIle505560PheGlyGlnPheAsnSerLysLeuLysSerSerGlyAspAlaAlaPro65707580AlaValGlnSerLeuThrLysTyrValProGlnProGlyProMetAsp859095ArgLysValValGluLysAlaIleGlnLeuSerMetThrArgMetGln100105110ValAspSerLeuAspCysValGlnPheHisTrpTrpAspTyrSerAsp115120125LysArgTyrLeuGluAlaLeuGlyHisLeuPheAspMetGlnGlnGlu130135140GlyLeuIleArgGluLeuSerLeuThrAsnPheAspThrGlnArgLeu145150155160GluGluIleSerAsnArgGlyIleArgIleSerSerAsnGlnValGln165170175TyrSerValIleAspGlnArgProAlaValLysMetGluGlnPheCys180185190LeuAlaAsnAspIleGlnLeuLeuThrTyrGlyThrLeuAlaGlyGly195200205LeuLeuThrGluArgTyrLeuGlyLysAlaGluProAsnSerLysAla210215220GluLeuTyrThrAlaSerLeuSerSerTyrLysLysMetIleAspThr225230235240TrpGlyGlyTrpSerLeuPheGlnAspLeuLeuValThrLeuGluAla245250255ValAlaArgArgHisAsnCysProMetAlaCysValAlaThrArgTyr260265270ValLeuAspArgProAlaValGlyGlyValIleValGlyCysArgLeu275280285GlyValAlaAsnAlaGlyGlnHisIleGlyAspSerLeuHisSerCys290295300SerProAspLeuArgLeuThrAlaGluAspLeuAlaAlaIleLysAla305310315320ValThrGlnArgSerArgAspLeuMetValTrpIleGlyAspCysGly325330335AspGluTyrArgSer340<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>3acatccagaccagcgacctgca22<210>4<211>25<212>DNA<213>人工序列<400>4tgccgaatctttttttttttttagc25<210>5<211>30<212>DNA<213>人工序列<400>5gtatctcttgtcgctatagtcccaccagtg30<210>6<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>6tgtgggctgcaggctaggtgtcgc24<210>7<211>28<212>DNA<213>人工序列<400>7gccgaattcatgcctgtggttcccaaag28<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<400>8ccgaagcttttagctcctgtactcatcgc29當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3