技術(shù)特征：

1.一種基于眼肌面積為首選性狀的肉牛早期選種方法，其特征在于：包括如下步驟：

(1)利用超聲波技術(shù)對待測犢牛進(jìn)行眼肌面積檢測，計算眼肌面積數(shù)值；

(1.1)在待選犢牛群體中對犢牛進(jìn)行保定，以確保其自然站立；

(1.2)測量時探頭放上耦合劑，剪掉測量部位毛，探頭直接放在體表；腰肌面積在橫斷面第十二、十三肋間測量，腰肌面積是一個圓周測量；在識別超聲影像時首先確定皮膚界面、脂間結(jié)締組織和背最長肌肌膜所產(chǎn)生的3～4條強(qiáng)回聲影帶，然后確定眼肌四周肌膜的強(qiáng)回聲影像，以確定眼肌面積周界；觀察并調(diào)節(jié)屏幕影像，調(diào)節(jié)灰度、對比度、增益度，使近場增大，遠(yuǎn)場減小，獲得理想影像時即凍結(jié)影像，并加注說明資料影像打印或存貯處理；圖像讀取時先確定上下界即橢圓短軸，然后確定兩端界點即為橢圓長軸；此時屏幕上顯示的平方厘米值就是近似橢圓形的眼肌的面積；

(2)利用HRM技術(shù)對目標(biāo)基因進(jìn)行基因分型；

(2.1)設(shè)計目標(biāo)基因序列的擴(kuò)增引物，確立最佳PCR反應(yīng)條件；

(2.2)進(jìn)行HRM分型，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化曲線區(qū)分出不同的基因型，然后從每個基因型中選取2-3個樣品進(jìn)行普通的PCR擴(kuò)增；

(2.3)PCR產(chǎn)物回收、測序，判斷目標(biāo)基因型；

(3)待選牛體重測定；

為空腹24小時后的體重；

(4)待選牛體尺測量；

體尺測量指標(biāo)涉及體長、胸圍；

(5)依照牛體型外貌評定標(biāo)準(zhǔn)，對待選牛外貌進(jìn)行評分；

(6)根據(jù)上述步驟(1)至步驟(5)的測定結(jié)果，建立早選指數(shù)計算公式；

早選指數(shù)ESI＝眼肌面積×0.35+基因標(biāo)記×0.25+體重指數(shù)×0.20+體軀指數(shù)×0.15+外貌指數(shù)×0.05；結(jié)合上述5項指標(biāo)的加權(quán)值，依據(jù)早選指數(shù)公式

得出早選指數(shù)值，然后根據(jù)早選指數(shù)進(jìn)行排序，選留數(shù)值高的個體；公式中，P_n為該性狀的個體表型值，為該性狀的個體表型值的平均值，w_i為個體性狀的經(jīng)濟(jì)重要性，h²為遺傳力。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于眼肌面積為首選性狀的肉牛早期選種方法，其特征在于：步驟(2.1)所述的設(shè)計目標(biāo)基因序列的擴(kuò)增引物，確立最佳PCR反應(yīng)條件，具體是：

H-FABP基因5‘UTR上游引物序列：5’-TCTGCGTCTTTCCCAACCTA-3’

H-FABP基因5‘UTR下游引物序列：5’-GGCTCCCCAACCT GAC-3’

通過梯度PCR試驗確定最佳試驗溫度，在200μL的PCR離心管中加入PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系：2×PCR mix 10μL，上下游引物各0.2μL，DNA 0.5μL，用雙蒸水ddH₂O補(bǔ)齊至20μL；其中，2×PCR mix表示2倍PCR反應(yīng)體系混合溶液；

將PCR管置于PCR儀中，設(shè)定反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4min；95℃變性40s；設(shè)置55℃-65℃梯度退火30s；70℃延伸30s，從第二步開始35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存；取5μL PCR產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混合后，用濃度為1％瓊脂糖凝膠在1×TAE中電泳檢測30min；根據(jù)條帶亮度及清晰度確定最終退火溫度；其中，6×上樣緩沖液表示6倍上樣緩沖液；1×TAE緩沖液的配置：先配置50×TAE緩沖液：Tris 242g，冰乙酸57.1m1,0.5M EDTA(pH 8.0)100m1，加水至1000ml，然后稀釋50倍以后即可得到1×TAE緩沖液；

在96孔PCR管中加入HRM反應(yīng)擴(kuò)增體系：取2×Master Mix 10μL加入上下游引物各0.5μL，MgCl2 2μL(2.5mM)，DNA 1μL(試驗前將DNA稀釋至50ng/μL)，用ddH₂O補(bǔ)齊至20μL；其中，2×Master Mix表示2倍熒光定量PCR反應(yīng)體系混合溶液；MgCl₂ 2μL(2.5mM)表示2.5毫摩爾每升的MgCl₂溶液2微升；

冰上操作，充分混勻后封膜離心30s，放入熒光定量PCR儀；

PCR反應(yīng)條件為：95℃10min，95℃10s，57℃退火15s，72℃20s，從第二步開始45 個循環(huán)；95℃1min，40℃1min，65℃1s，然后溫度以5℃/s的速率從65℃遞增到95℃，最后溫度降到40℃。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于眼肌面積為首選性狀的肉牛早期選種方法，其特征在于：步驟(2.2)所述的進(jìn)行HRM分型，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化曲線區(qū)分出不同的基因型，然后從每個基因型中選取2-3個樣品進(jìn)行普通的PCR擴(kuò)增，具體是：

在200μL的PCR離心管中加入PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系：10×PCR Buffer with MgCl2 6.25μL，dNTP Mixture(10mm)2.25μL，下游引物各1μL，Taq DNA polymerase(2U/μL)1.5μL，DNA 1μL，最后用ddH₂O補(bǔ)齊至50μL；其中，10×PCR Buffer with MgCl₂表示含有MgCl₂的10倍PCR緩沖液；dNTP Mixture(10mM)表示10毫摩爾每升的dNTP混合液；Taq DNA polymerase(2U/μL)表示2單位每微升的taqDNA酶；ddH₂O表示雙蒸水；

將PCR管置于PCR儀中，設(shè)定反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4min；95℃變性40s；退火30s；70℃延伸30s，從第二步開始35個循環(huán)；72℃延伸10min；4℃保存；取5μL PCR產(chǎn)物與6×上樣緩沖液混合后，用1％瓊脂糖凝膠在1×TAE中電泳檢測，電壓7～10V/cm，當(dāng)溴酚藍(lán)電泳至2～4cm，在紫外燈下觀察結(jié)果并用凝膠成像儀照相，PCR產(chǎn)物清晰且與預(yù)期大小一致的個體為符合要求個體，進(jìn)行下一步分析。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于眼肌面積為首選性狀的肉牛早期選種方法，其特征在于：步驟(2.3)所述的PCR產(chǎn)物測序，判斷目標(biāo)基因型，具體是：取每個樣品的PCR產(chǎn)物10μL，送測序公司測序；測序后，結(jié)合測序結(jié)果與分型的HRM標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，作為基因分型的判斷依據(jù)，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線圖進(jìn)行HRM基因分型，而后進(jìn)行后期的計算。