本發(fā)明屬于微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種枯草芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

根結(jié)線蟲(Meloidogyne)是一種高度?；偷碾s食性植物病原線蟲。已知危害蔬菜的線蟲主要有花生根結(jié)線蟲、北方根結(jié)線蟲、南方根結(jié)線蟲、爪哇根結(jié)線蟲以及甜菜根結(jié)線蟲等。線蟲寄主范圍廣泛，常危害瓜類、茄果類、豆類及蘿卜、胡蘿卜、萵苣、白菜等30多種蔬菜，還能傳播一些真菌和細(xì)菌性病害。根結(jié)線蟲是一種重要的農(nóng)作物病原物，每年造成大約數(shù)十億元的損失。根結(jié)線蟲主要侵染農(nóng)作物的根部，侵染后的根部膨大形成巨大的根結(jié)，可相互連接形成串珠狀，由于根部被破壞，影響正常的吸收機(jī)能，所以地上部生長(zhǎng)發(fā)育受阻，被侵染后的植株地上部表現(xiàn)矮化，葉部黃化，結(jié)果小而且少。天氣干燥時(shí)易萎蔫或枯萎。長(zhǎng)期連作的溫室中，特別是可以使西瓜、西瓜、番茄等絕產(chǎn)。

由于抗根結(jié)線蟲病的種質(zhì)資源稀少，所以在生產(chǎn)中化學(xué)防治仍然是防治根結(jié)線蟲的重要措施，如棉隆、氯化苦和百畝威等，這些藥劑雖然殺蟲快，但是會(huì)嚴(yán)重降低蔬菜質(zhì)量，污染環(huán)境，破壞生態(tài)平衡，使用過(guò)程中對(duì)人、畜不安全，因此生物防治措施日益受到人們的關(guān)注。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是為了解決現(xiàn)有技術(shù)中化學(xué)防治存在的污染環(huán)境、不安全的問(wèn)題，提供一種枯草芽孢桿菌菌株及其應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種枯草芽孢桿菌，所述菌株為枯草芽孢桿菌Bs-1，建議的分類命名為枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis；保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏日期為2016年4月18日，保藏編號(hào)為CGMCC 12364。

本發(fā)明還提供了利用枯草芽孢桿菌制備的生防菌劑。

本發(fā)明還提供了枯草芽孢桿菌制備的生防菌劑在防治根結(jié)線蟲中的應(yīng)用。

進(jìn)一步的，所述根結(jié)線蟲為南方根結(jié)線蟲。

本發(fā)明還提供了生防菌劑的制備方法，該方法包括以下步驟：

(1)將枯草芽孢桿菌Bs-1劃線接種在LB培養(yǎng)基上，恒溫培養(yǎng)后得到單株菌落；

(2)將枯草芽孢桿菌Bs-1的單株菌落接種在種子培養(yǎng)基中，恒溫振蕩培養(yǎng)后得到種子液；

(3)將種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得濃度為10⁴-10⁶cfu/mL的發(fā)酵液；然后將發(fā)酵液直接分裝成液體劑型。

進(jìn)一步的，步驟(1)中，在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48-72h，培養(yǎng)溫度為25-28℃。

進(jìn)一步的，步驟(1)中，LB培養(yǎng)基配方為：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，余量為水。

進(jìn)一步的，步驟(2)中，在恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速160rpm，溫度為25-28℃，振蕩培養(yǎng)12-36h。

進(jìn)一步的，步驟(3)中，將種子液以接種量2-4％接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵溫度為25-28℃。

進(jìn)一步的，步驟(2)中的種子培養(yǎng)基與步驟(3)中的發(fā)酵培養(yǎng)基均為L(zhǎng)B培養(yǎng)基。

本發(fā)明的有益效果為：本發(fā)明中的枯草芽孢桿菌分離自土壤，對(duì)于根結(jié)線蟲具有良好的防效，易于在土壤中定殖，且利于早期防控根結(jié)線蟲危害，該菌株對(duì)于解決根結(jié)線蟲的防治具有巨大的應(yīng)用潛力，有助于實(shí)現(xiàn)蔬菜的高產(chǎn)、安全、無(wú)公害生產(chǎn)；枯草芽孢桿菌Bs-1菌株的發(fā)酵液對(duì)根結(jié)線蟲的致死率達(dá)到100％，在溫室中的防治效果達(dá)到76.9％，防治效果高且穩(wěn)定，適于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)需求。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明枯草芽孢桿菌Bs-1的細(xì)菌形態(tài)圖；

圖2為本發(fā)明枯草芽孢桿菌Bs-1的菌落形態(tài)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例和附圖對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地解釋說(shuō)明。

實(shí)施例1

枯草芽孢桿菌的分離、純化及鑒定：

從順義番茄種植田塊中均勻取土壤樣品，10g土壤分別與100mL滅菌水進(jìn)行混合制成懸浮液，然后依次進(jìn)行梯度稀釋，取稀釋10000倍的土壤混液100μL涂布于LB培養(yǎng)基平板上，LB培養(yǎng)基的配方為：酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L、瓊脂粉1.3-1.5g/100mL，定容至1L，封口。將培養(yǎng)基置于37℃培養(yǎng)，待組織塊長(zhǎng)出菌落后，挑取單菌落在LB培養(yǎng)基上純化，用于分類鑒定。根據(jù)《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行形態(tài)學(xué)測(cè)定。

用滅菌的牙簽挑取單菌落，放入盛有300μL細(xì)菌裂解液SDS的EP管中，65℃裂解2小時(shí)，然后用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)提取細(xì)菌DNA，以DNA為模板，用引物27F和1492R分別進(jìn)行16srRNA序列擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系為50μL，含有5μL 10×Ex Taq Buffer、1μL Ex Taq酶、5μL dNTP(2.5mM each)、1μL正向引物、1μL反向引物、3μLDNA模板、無(wú)菌水20μL。擴(kuò)增條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸2.5min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳分離鑒定，PCR產(chǎn)物直接進(jìn)行雙向測(cè)序。

結(jié)果：

參見附圖1-2，獲得的Bs-1菌株在LB培養(yǎng)基平板上，在LB培養(yǎng)基平板上，25℃，培養(yǎng)3天后，菌落呈圓形，表面色暗，變厚和不透明。菌體桿狀，很少成鏈，染色均勻。鞭毛側(cè)生，內(nèi)生孢子0.8×1.5-1.8μm，游離孢子的表面著色弱。萌發(fā)時(shí)芽孢殼赤道裂。自營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞露出后，孢子殼消解緩慢。依照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》對(duì)Bs-1菌株形態(tài)進(jìn)行測(cè)定，確定該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

用引物27F和1492R分別進(jìn)行16s rRNA序列擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1％瓊脂糖凝膠電泳。經(jīng)測(cè)序分析菌株擴(kuò)增的16s rRNA序列長(zhǎng)為1360bp。將菌株的16s rRNA序列進(jìn)行BLAST分析后，結(jié)果顯示，Bs-1菌株與枯草芽孢桿菌相似度達(dá)到了100％，鑒定菌株為枯草芽孢桿菌Bs-1。

實(shí)施例2

1、Bs-1菌株發(fā)酵液的制備方法，包括以下步驟：

(1)將枯草芽孢桿菌Bs-1劃線接種在LB培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中平板培養(yǎng)60h，培養(yǎng)溫度設(shè)定為25℃，得到單株菌落；

(2)將枯草芽孢桿菌Bs-1的單株菌落接種在種子培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基)中，在恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速160rpm，溫度為25℃，振蕩培養(yǎng)24h；液體種子培養(yǎng)基配方為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，即酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl10g/L，定容至1L；

(3)將種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為3％，溫度設(shè)定為25℃，獲得濃度為10⁴cfu/mL的發(fā)酵液(原液)；液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，即酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，定容至1L。

將發(fā)酵液及其10倍、100倍稀釋液分別處理根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)，測(cè)定枯草芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)根結(jié)線蟲的殺死效果。

2、制備試驗(yàn)用線蟲

采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所溫室。將辣椒根系取出，用水輕輕沖洗，小心取下卵塊，放在1％的次氯酸鈉中消毒3min，再用無(wú)菌水沖洗3次，放在含有少量無(wú)菌水的培養(yǎng)皿中，在25℃恒溫箱中培養(yǎng)，每24h收集一次孵化的根結(jié)線蟲J2幼蟲。

3、試驗(yàn)方法

在無(wú)菌的細(xì)胞培養(yǎng)板上，分別向孔內(nèi)加入不同濃度的發(fā)酵液各1mL，并以無(wú)菌水作為對(duì)照，然后分別向處理和對(duì)照中加入100μL線蟲懸浮液(100條根結(jié)線蟲J2幼蟲)，放在室溫下24h，觀察根結(jié)線蟲的死亡情況，計(jì)算校正死亡率，即為殺線蟲效果，每個(gè)處理24個(gè)孔(樣本)，每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

校正死亡率(％)＝(處理線蟲死亡率－對(duì)照線蟲死亡率)/(1－對(duì)照線蟲死亡率)×100

4、試驗(yàn)結(jié)果：

通過(guò)上述試驗(yàn)，測(cè)定不同倍數(shù)發(fā)酵液處理24h對(duì)根結(jié)線蟲的防治效果，結(jié)果表明不同發(fā)酵液倍數(shù)對(duì)線蟲的作用效果不同，發(fā)酵液原液的作用根結(jié)線蟲的校正死亡率為100％，發(fā)酵液稀釋后防治效果明顯降低，在10倍稀釋液中殺線蟲過(guò)只有78.1％，而在100倍稀釋液中線蟲死亡率很低(<10％)，與對(duì)照的差異很小。試驗(yàn)說(shuō)明發(fā)酵液在高濃度下具有良好的防治根結(jié)線蟲效果。

表1不同濃度的Bs-1菌株發(fā)酵液殺線蟲效果

實(shí)施例3

1、Bs-1菌株發(fā)酵液的制備方法，包括以下步驟：

(1)將枯草芽孢桿菌Bs-1劃線接種在LB培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中平板培養(yǎng)60h，培養(yǎng)溫度為25℃，得到單株菌落；

(2)將枯草芽孢桿菌Bs-1的單株菌落接種在種子培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速160rpm，溫度為37℃，振蕩培養(yǎng)24h；液體種子培養(yǎng)基配方為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，即酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，定容至1L；

(3)將種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為3％，溫度設(shè)定為25℃，獲得濃度為10⁴cfu/mL的發(fā)酵液；液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，即酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，定容至1L。

在西瓜幼苗上接種10mL該菌培養(yǎng)液，2天后，接種南方根結(jié)線蟲J2幼蟲，每株接種500條，并在5周后檢測(cè)根結(jié)數(shù)量，計(jì)算防治效果。每個(gè)處理30株西瓜苗，每個(gè)處理重復(fù)3次。并以清水處理作為對(duì)照。

根結(jié)線蟲病情分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)為：

表2西瓜根結(jié)線蟲病病情級(jí)別劃分

根結(jié)指數(shù)計(jì)算：

調(diào)查每份鑒定材料根部發(fā)病情況，根據(jù)病害癥狀描述，逐份材料進(jìn)行調(diào)查，記載病情級(jí)別，計(jì)算出根結(jié)指數(shù)(RKI)。

根結(jié)指數(shù)按下列公式計(jì)算：

根結(jié)指數(shù)(％)＝∑(s×n)/N×M×100

式中：

∑—各病情級(jí)別代表數(shù)值與其相對(duì)應(yīng)病情級(jí)別病株數(shù)乘積的總和；

S—各病情級(jí)別代表數(shù)值；

n—各病情級(jí)別病株數(shù)；

N—調(diào)查總株數(shù)；

M—最高病情指數(shù)。

防治效果計(jì)算公式：

防治效果(％)＝(1－處理根結(jié)數(shù)/對(duì)照根結(jié)數(shù))×100

2、試驗(yàn)結(jié)果

處理結(jié)果見表2，通過(guò)試驗(yàn)可以看出在生防菌處理后西瓜植株上的根結(jié)數(shù)量顯著降低，在對(duì)照處理中根結(jié)數(shù)量平均為44.42個(gè)/株，而在菌株處理的西瓜中的根結(jié)數(shù)量平均為10.25個(gè)/株，Bs-1菌株對(duì)根結(jié)線蟲的防治效果達(dá)到了76.9％，說(shuō)明生防菌劑可以有效的防治黃瓜根結(jié)線蟲。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，特別是設(shè)施西瓜栽培中防治根結(jié)線蟲病具有重要價(jià)值。

表2不同處理根結(jié)數(shù)量及防治效果

實(shí)施例4

一種Bs-1菌株生防菌劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)將枯草芽孢桿菌Bs-1劃線接種在LB培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中平板培養(yǎng)48h，培養(yǎng)溫度設(shè)定為25℃，得到單株菌落；

(2)將枯草芽孢桿菌Bs-1的單株菌落接種在種子培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速160rpm，溫度為25℃，振蕩培養(yǎng)12h；液體種子培養(yǎng)基配方為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，即酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，定容至1L；

(3)將種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為2％，溫度設(shè)定為25℃，獲得濃度為10⁴cfu/mL的發(fā)酵液(原液)，液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，即酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，定容至1L；然后將得到的發(fā)酵液直接分裝成液體劑型。

實(shí)施例5

一種Bs-1菌株生防菌劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)將枯草芽孢桿菌Bs-1劃線接種在LB培養(yǎng)基上，在恒溫培養(yǎng)箱中平板培養(yǎng)72h，培養(yǎng)溫度為28℃，得到單株菌落；

(2)將枯草芽孢桿菌Bs-1的單株菌落接種在種子培養(yǎng)基中，在恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)，轉(zhuǎn)速160rpm，溫度為28℃，振蕩培養(yǎng)36h；液體種子培養(yǎng)基配方為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，即酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，NaCl 10g/L，定容至1L；

(3)將種子液接種到已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，接種量為4％，溫度設(shè)定為28℃，獲得濃度為10⁶cfu/mL的發(fā)酵液；液體發(fā)酵培養(yǎng)基配方為L(zhǎng)B培養(yǎng)基，即酵母粉5g/L、蛋白胨10g/L、NaCl 10g/L，定容至1L；然后將得到的發(fā)酵液直接分裝成液體劑型。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明實(shí)質(zhì)內(nèi)容上所作的任何修改、等同替換和簡(jiǎn)單改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。