本發(fā)明涉及一種農(nóng)業(yè)微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種解磷菌PC05及其分離篩選方法。

背景技術(shù)：

磷在植物體中的含量?jī)H次于氮和鉀，是植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵營(yíng)養(yǎng)元素之一。缺磷土壤一般是指土壤有效磷(P)小于10mg/kg的土壤，我國(guó)缺磷土壤面積超過耕地總面積的74％，土壤中的磷絕大部分以難溶性磷酸鹽形式存在，植物無法直接吸收利用。為滿足生產(chǎn)需要，我國(guó)絕大部分的耕種田都要大量補(bǔ)充磷化肥，由于長(zhǎng)期的累積和富集，造成了土壤板結(jié)、營(yíng)養(yǎng)元素失衡等一系列生產(chǎn)、生態(tài)問題，故如何改善和提高我國(guó)耕作田土壤磷的利用率，仍然是一項(xiàng)戰(zhàn)略性課題。從已有的文獻(xiàn)報(bào)道來看，解磷菌種類繁多復(fù)雜，解磷能力也參差不齊，并且應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的菌種種類少，缺乏創(chuàng)新，從這個(gè)角度看，篩選具有較強(qiáng)解磷能力野生菌株的工作仍然具有重大意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種解磷菌PC05及其分離篩選方法，可以豐富野生解磷菌遺傳資源，獲取具有較強(qiáng)解磷能力的解磷菌株。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案為：一種解磷菌PC05，所述解磷菌PC05菌株名稱為Inquilinusginsengisoli PC05，已于2016年6月24日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2016347，地址：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)。

一種如權(quán)利要求1所述的解磷菌PC05的分離篩選方法，包括如下步驟：

(1)無機(jī)磷固體培養(yǎng)基的制備：按重量份數(shù)計(jì)，培養(yǎng)基由下述成分組成：葡萄糖10g、(NH₄)₂SO₄ 0.5g、MgSO₄·H₂O 0.3g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、FeSO₄·7H₂O 0.03g、MnSO₄·H₂O 0.03g、Ca₃(PO₄)₂ 5g、瓊脂20g、蒸餾水1000g；將Ca₃(PO₄)₂與其余成分分開滅菌后混合，調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2；

(2)取10mL豬泡糞液樣品，放入帶有玻璃珠的試劑瓶中，加入90mL無菌水，在28～30℃恒溫振蕩30～45min，使樣品均勻分散于無菌水中，得到稀釋倍數(shù)為10^-1的菌懸液，將菌懸液靜置后取上清液，依次稀釋得到10^-3、10^-5、10^-7倍濃度梯度的樣品菌懸液，10^-3、10^-5、10^-7倍濃度梯度的菌懸液各取0.1mL，依次均勻的涂布在無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，放入恒溫培養(yǎng)箱中，在30℃條件下恒溫培養(yǎng)3～5天后，觀察并記錄菌落及溶磷圈的大小，做好菌種標(biāo)記，篩選出6株解磷菌PC01、PC02、PC03、PC04、PC05、PC06，比較6株解磷菌在無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上的溶磷圈直徑(HD)與菌落直徑(CD)的比值，篩選出HD/CD值最大的菌株即為解磷菌PC05。

如上述所述的解磷菌PC05的鑒定方法為：利用引物27F和1492R對(duì)菌株P(guān)C05進(jìn)行擴(kuò)增和正向測(cè)序，得到序列長(zhǎng)度為1445bp，通過BLAST將序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行對(duì)比，其與NR_112560.1相似性超過99％，鑒定其為Inquilinus ginsengisoli。

本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明所提供的菌株豐富了野生解磷菌遺傳資源，擴(kuò)大了解磷菌全基因組育種的后備庫，該菌具有較強(qiáng)的解磷能力，能提高土壤中有效磷的含量，提高磷肥利用效率，提高農(nóng)作物產(chǎn)量，減少水土流失，具有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說明

圖1為本發(fā)明篩選的六株解磷菌用鉬銻抗比色法測(cè)定水溶性磷含量的測(cè)定結(jié)果圖；

圖2為四組盆栽接種解磷菌PC01組、PC05組、PC01+PC05混合組、CK組后的油菜生長(zhǎng)長(zhǎng)勢(shì)圖；

圖3為四組盆栽接種解磷菌PC01組、PC05組、PC01+PC05混合組、CK組后的油菜根系生長(zhǎng)圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)描述，本部分的描述僅是示范性和解釋性，不應(yīng)對(duì)本發(fā)明的保護(hù)范圍有任何的限制作用。

本發(fā)明的一種解磷菌PC05，所述解磷菌PC05菌株名稱為Inquilinusginsengisoli PC05，已于2016年6月24日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2016347，地址：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)。

實(shí)施例1

無機(jī)磷固體培養(yǎng)基的制備：按重量份數(shù)計(jì)，培養(yǎng)基由下述成分組成：葡萄糖10g、(NH₄)₂SO₄ 0.5g、MgSO₄·H₂O 0.3g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、FeSO₄·7H₂O 0.03g、MnSO₄·H₂O 0.03g、Ca₃(PO₄)₂ 5g、瓊脂20g、蒸餾水1000g；將Ca₃(PO₄)₂與其余成分分開滅菌后混合，調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2。

取10mL豬泡糞液樣品，放入帶有玻璃珠的250mL三角瓶中，加入90mL無菌水，在28～30℃恒溫振蕩30～45min，使樣品均勻分散于無菌水中，得到稀釋倍數(shù)為10^-1的菌懸液，將菌懸液靜置后取上清液，依次稀釋得到10^-3、10^-5、10^-7倍濃度梯度的樣品菌懸液，10^-3、10^-5、10^-7倍濃度梯度的菌懸液各取0.1mL，依次均勻的涂布在無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，放入恒溫培養(yǎng)箱中，在30℃條件下恒溫培養(yǎng)3～5天后，觀察并記錄菌落及溶磷圈的大小，做好菌種標(biāo)記，篩選出6株解磷菌PC01、PC02、PC03、PC04、PC05、PC06，比較6株解磷菌在無機(jī)磷固體培養(yǎng)基上的溶磷圈直徑(HD)與菌落直徑(CD)的比值，篩選出HD/CD值最大的菌株(即解磷能力較大的菌株)，如表1所示，解磷能力從大到小依次為：PC05〉PC02〉PC01〉PC03〉PC06〉PC04，其中PC05HD/CD值最大，即為本發(fā)明所要獲得的解磷菌PC05。

表1解磷菌在平板上的解磷能力

實(shí)施例2

對(duì)實(shí)施例1中分離篩選得到的解磷菌PC05進(jìn)行形態(tài)觀察和分子鑒定。解磷菌PC05的生長(zhǎng)生理形態(tài)為菌落表面光滑，半透明，邊緣整齊，圓形凸形，培養(yǎng)初期溶磷圈不明顯，3～4d后溶磷圈較顯著；利用引物27F和1492R對(duì)菌株P(guān)C05進(jìn)行擴(kuò)增和正向測(cè)序，得到序列長(zhǎng)度為1445bp，通過BLAST(局部序列比對(duì)基本檢索工具)，將序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中序列進(jìn)行對(duì)比，其與NR_112560.1相似性超過99％，鑒定其為Inquilinus ginsengisoli。

1、解磷菌PC05溶磷能力檢測(cè)：

對(duì)實(shí)施例1中分離篩選得到的解磷菌PC05進(jìn)行溶磷能力檢測(cè)。

制備無機(jī)磷液體培養(yǎng)基：由下述成分組成：葡萄糖10g、(NH₄)₂SO₄ 0.5g、MgSO₄·H₂O 0.3g、NaCl 0.3g、KCl 0.3g、FeSO₄·7H₂O 0.03g、MnSO₄·H₂O 0.03g、Ca₃(PO₄)₂ 5g、蒸餾水1000g；將Ca₃(PO₄)₂與其余成分分開滅菌后混合，調(diào)節(jié)pH為7.0～7.2。

取1mL己活化的實(shí)施例1中篩選出的6株菌株解磷菌PC01、PC02、PC03、PC04、PC05、PC06的菌懸液，分別加入含有100mL無機(jī)磷液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，于30℃下180r/min振蕩培養(yǎng)7天，每株菌株重復(fù)3瓶。在接種后每天取培養(yǎng)液，5000r/min離心10min后，取上清液，用鉬銻抗比色法測(cè)定上清液中可溶性磷的含量，同時(shí)設(shè)置空白組，其中無機(jī)磷液體培養(yǎng)基中Ca₃(PO₄)₂的濃度為5g·L^-1。各菌株最大溶磷量如圖1所示，由圖可知，解磷菌PC01、PC02、PC03、PC04、PC05、PC06六株菌株中，解磷菌PC05解磷效果最好，最高溶磷量是532.33mg/L，解磷率為44.89％。

2、解磷菌PC05促進(jìn)油菜幼苗生長(zhǎng)試驗(yàn)：

取兩組實(shí)施例1中的解磷菌進(jìn)行盆栽試驗(yàn)：解磷菌PC01組(盆栽中接種PC01菌液100mL)、解磷菌PC05組(盆栽中接種PC05菌液100mL)、解磷菌PC01+PC05混合組(盆栽中接種PC01和PC05菌液各50mL)、CK組(空白對(duì)照組，不接種任何菌種)。每組重復(fù)4個(gè)重復(fù)盆栽，每盆播種12粒經(jīng)萌發(fā)處理后的油菜種子，且每盆按0.15g/kg的氮和0.2g/kg的鉀的施用量施加氮肥鉀肥，然后將盆栽置于20℃下培養(yǎng)，待出苗后分期進(jìn)行間苗，最后定苗，每盆保留3株，定期給每盆盆栽澆等量去離子水，連續(xù)培養(yǎng)120天。

植株生長(zhǎng)狀況如圖2和圖3所示，由圖可知，接種解磷菌PC05后整株植物高度、植株根長(zhǎng)、根數(shù)量、含氮量、含磷量以及含鉀量均明顯高于空白組；

油菜生長(zhǎng)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果如表2所示，由表可知，接種解磷菌PC05后植株株高增加68.23％，根長(zhǎng)增加79.34％，鮮重提高140.41％，干重提高171.88％，含氮量增加215.98％，含磷量增加203.88％，含鉀量增加209.44％。

表2不同菌株對(duì)油菜生長(zhǎng)指標(biāo)的影響

(注明：表2中注：表格中數(shù)據(jù)表示為4個(gè)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，數(shù)據(jù)后的字母不同表示數(shù)據(jù)間差異性顯著。)

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明的技術(shù)范圍做出任何限制，故凡是依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何細(xì)微修改、等同變化與修飾，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案范圍內(nèi)。