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過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重組大腸桿菌的構(gòu)建方法和純化方法與流程

文檔序號:12056449閱讀:來源:國知局

技術(shù)特征:

1.一種過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因,其特征在于:所述基因來自于嗜酸乳桿菌ATCC 4356編碼尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的基因,其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示。

2.權(quán)利要求1所述的過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法,其特征在于具體步驟如下:

(1)過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的擴(kuò)增與克隆

以嗜酸乳桿菌ATCC 4356基因組DNA為模板,設(shè)計PCR引物,擴(kuò)增尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因LBA0625;PCR產(chǎn)物與克隆載體Blunt Zero以7:1的摩爾比混合,于25℃反應(yīng)5min后,立即置于冰上,然后將連接產(chǎn)物Blunt-LBA0625轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中復(fù)制;

(2)重組表達(dá)載體pET-LBA0625的構(gòu)建

用質(zhì)粒小量提取試劑盒分別提取克隆質(zhì)粒Blunt-LBA0625和表達(dá)載體pET-28a,均用XhoⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切后,進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳,然后切膠回收;將克隆質(zhì)粒Blunt-LBA0625膠回收產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-28a膠回收產(chǎn)物以摩爾比7:1在T4連接酶的作用下,于22℃反應(yīng)30min構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-LBA0625;然后將連接產(chǎn)物pET-LBA0625轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中復(fù)制;

(3)重組大腸桿菌PLY127-2的構(gòu)建

提取pET-LBA0625過表達(dá)質(zhì)粒,熱激轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)中,涂布卡那霉素抗性平板,再在37℃培養(yǎng)12h,篩選轉(zhuǎn)化子;轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR進(jìn)行驗證,從而獲得過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重組大腸桿菌PLY127-2。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法,其特征在于PCR引物的序列如下所示:LBA0625上游擴(kuò)增引物:GGATCCATGAAAGTAAGAAAAGCTATTATTCCTGC;LBA0625下游擴(kuò)增引物:CTCGAGTTATTTATTTTTTCGCTTATCTTCAGCTT。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法,其特征在于PCR擴(kuò)增程序如下:(1)94℃ 4min;(2)98℃ 10sec, 55℃ 5sec,72℃ 1min;重復(fù)30個循環(huán);(3)72℃ 5min;PCR反應(yīng)體系如下所示:5×PrimeSTAR Buffer 10 μL,dNTP Mixture 4 μL,20mM 正向引物1 μL,20mM 反向引物1 μL,模板DNA 2 μL,PrimeSTAR HS DNA 聚合酶 0.5 μL,用蒸餾水補(bǔ)足至 50μL。

5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法,其特征在于:所述表達(dá)載體pET-28a的啟動子為T7,將目的基因片段插入到pET-28a啟動子T7下游多克隆位點。

6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法,其特征在于所述的熱激轉(zhuǎn)化具體步驟如下:向50μL感受態(tài)大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞中加入重組表達(dá)質(zhì)粒pET-LBA0625,輕輕混勻,冰浴30min后,42℃水浴熱激45s,然后快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中2min;向離心管中加入500μL LB培養(yǎng)基,混勻后至于37℃,200rpm復(fù)蘇1h,吸取100μL已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布卡納霉素抗性LB平板。

7.權(quán)利要求2-6任一項所述的過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重組大腸桿菌的純化方法,其特征在于具體步驟如下:

(1)表達(dá)外源蛋白并提取

將構(gòu)建的過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重組大腸桿菌PLY127-2接種于LB肉湯中,于37℃,200r/min過夜活化,制備種子培養(yǎng)液,將種子培養(yǎng)液以體積比8%的接種量接種于LB肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.5時,加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至終濃度為0.4mM,30℃誘導(dǎo)6h后,于5500rpm離心10min,棄上清;將沉淀菌體用生理鹽水洗3次后,然后加入PBS緩沖液重懸菌體,超聲破碎提取蛋白,于10,000×g離心20min后,取其上清,即得到誘導(dǎo)的蛋白上樣液;

(2)蛋白純化

將his-NTA柱子用結(jié)合緩沖液平衡,流速控制在0.5mL/min,然后上樣誘導(dǎo)的蛋白上樣液,并繼續(xù)用結(jié)合緩沖液清洗至平衡狀態(tài),再用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白,流速控制為1mL/min,用離心管收集洗脫液,取最高峰所對應(yīng)的管液進(jìn)行SDS-PAGE電泳純化回收。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重組大腸桿菌的蛋白純化方法,其特征在于所述的結(jié)合緩沖液的配方如下:10mM咪唑、20mM Tris、0.5M NaCl,pH=8.0;所述的洗脫緩沖液的配方如下:250mM咪唑、20mM Tris、0.5M NaCl,pH=8.0。

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