本發(fā)明屬于生物工程及微生物發(fā)酵
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是涉及過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重組大腸桿菌的構(gòu)建方法和純化方法。
背景技術(shù)：
：尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucosepyrophosphorylase，UGPase）廣泛分布于動物、植物、微生物中，許多物種和組織無論是在轉(zhuǎn)錄水平還是蛋白水平上，都有檢測到UGPase的存在，這正是由于UGPase在糖代謝中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。它處于糖代謝的交叉位點，在糖與糖之間的動態(tài)轉(zhuǎn)化過程中扮演著重要角色。利用基因工程技術(shù)，將外源基因?qū)氪竽c桿菌進(jìn)行過表達(dá)，通過簡單快速的親和層析，直接獲得純度較高的目的蛋白。親和層析具有結(jié)合特異性高、純化條件溫和、純化步驟簡單等優(yōu)點，為蛋白質(zhì)的有效純化提供了一條解決途徑。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重組大腸桿菌及尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的純化方法。本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：1、一種過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625），所述基因來自于嗜酸乳桿菌（lactobacillusacidophilus）ATCC4356編碼尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UGPase）的基因，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo：1所示。2、過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625）的重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，具體步驟如下：（1）過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625）的擴(kuò)增與克隆以嗜酸乳桿菌ATCC4356基因組DNA為模板，設(shè)計PCR引物，擴(kuò)增尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因LBA0625；PCR產(chǎn)物與克隆載體BluntZero以7:1的摩爾比混合，于25℃反應(yīng)5min后，立即置于冰上，然后將連接產(chǎn)物Blunt-LBA0625轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中復(fù)制；（2）重組表達(dá)載體pET-LBA0625的構(gòu)建用質(zhì)粒小量提取試劑盒分別提取克隆質(zhì)粒Blunt-LBA0625和表達(dá)載體pET-28a，均用XhoⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后切膠回收；將克隆質(zhì)粒Blunt-LBA0625膠回收產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-28a膠回收產(chǎn)物以摩爾比7:1在T4連接酶的作用下，于22℃反應(yīng)30min構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-LBA0625；然后將連接產(chǎn)物pET-LBA0625轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中復(fù)制；（3）重組大腸桿菌PLY127-2的構(gòu)建提取pET-LBA0625過表達(dá)質(zhì)粒，熱激轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）中，涂布卡那霉素抗性平板，再在37℃培養(yǎng)12h，篩選轉(zhuǎn)化子；轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR進(jìn)行驗證，從而獲得過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重組大腸桿菌PLY127-2。PCR引物的序列如下所示：LBA0625上游擴(kuò)增引物：GGATCCATGAAAGTAAGAAAAGCTATTATTCCTGC；LBA0625下游擴(kuò)增引物：CTCGAGTTATTTATTTTTTCGCTTATCTTCAGCTT。PCR擴(kuò)增程序如下：（1）94℃4min；（2）98℃10sec，55℃5sec，72℃1min；重復(fù)30個循環(huán)；（3）72℃5min；PCR反應(yīng)體系如下所示：5×PrimeSTARBuffer10μL，dNTPMixture4μL，20mM正向引物1μL，20mM反向引物1μL，模板DNA2μL，PrimeSTARHSDNA聚合酶0.5μL，用蒸餾水補(bǔ)足至50μL。所述表達(dá)載體pET-28a的啟動子為T7，將目的基因片段插入到pET-28a啟動子T7下游多克隆位點。所述的熱激轉(zhuǎn)化具體步驟如下：向50μL感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞中加入重組表達(dá)質(zhì)粒pET-LBA0625，輕輕混勻，冰浴30min后，42℃水浴熱激45s，然后快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中2min；向離心管中加入500μLLB培養(yǎng)基，混勻后至于37℃，200rpm復(fù)蘇1h，吸取100μL已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布卡納霉素抗性LB平板。3、上述過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重組大腸桿菌的純化方法，其特征在于具體步驟如下：（1）表達(dá)外源蛋白并提取將構(gòu)建的過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重組大腸桿菌PLY127-2接種于LB肉湯中，于37℃，200r/min過夜活化，制備種子培養(yǎng)液，將種子培養(yǎng)液以體積比8%的接種量接種于LB肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600=0.5時，加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.4mM，30℃誘導(dǎo)6h后，于5500rpm離心10min，棄上清；將沉淀菌體用生理鹽水洗3次后，然后加入PBS緩沖液重懸菌體，超聲破碎提取蛋白，于10，000×g離心20min后，取其上清，即得到誘導(dǎo)的蛋白上樣液；（2）蛋白純化將his-NTA柱子用結(jié)合緩沖液平衡，流速控制在0.5mL/min，然后上樣誘導(dǎo)的蛋白上樣液，并繼續(xù)用結(jié)合緩沖液清洗至平衡狀態(tài)，再用洗脫緩沖液洗脫目的蛋白，流速控制為1mL/min，用離心管收集洗脫液，取最高峰所對應(yīng)的管液進(jìn)行SDS-PAGE電泳純化回收。所述的結(jié)合緩沖液的配方如下：10mM咪唑、20mMTris、0.5MNaCl，pH=8.0；所述的洗脫緩沖液的配方如下：250mM咪唑、20mMTris、0.5MNaCl，pH=8.0。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的優(yōu)點在于：本發(fā)明首次公開了一株能過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（UDP-glucosepyrophosphorylase，UGPase）基因的重組大腸桿菌PLY127-2及其構(gòu)建方法，并建立了純化UGPase的方法。通過克隆嗜酸乳桿菌ATCC4356（lactobacillusacidophilusATCC4356）的UGPase基因（LBA0625）片段連接到pET-28a表達(dá)載體上，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21（DE3）中，通過紅霉素抗性篩選并鑒定獲得帶有目的基因的重組菌，即過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因（LBA0625）的重組大腸桿菌PLY127-2。其外源蛋白得到了高效表達(dá)，對重組大腸桿菌進(jìn)行誘導(dǎo)后，其UGPase酶活為456.14IU/L，是對照組的2.34倍，并利用Ni-NTA瓊脂糖親和層析成功純化出UGPase，獲得的UGPase的活性回收率為53.55%，蛋白純化倍數(shù)為12.96倍。首次構(gòu)建了一株能過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因的重組大腸桿菌PLY127-2，并成功純化出UGPase，為高效表達(dá)外源蛋白和蛋白純化奠定研究基礎(chǔ)和技術(shù)支持。附圖說明圖1為過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（LBA0625）基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；Lane1、2為目的基因LBA0625PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物；圖2為表達(dá)載體體pET-28a經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；Lane1、2為pET-28a經(jīng)雙酶切后的驗證結(jié)果圖；圖3為克隆質(zhì)粒Blunt-LBA0625經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果；Lane1、2為Blunt-LBA0625經(jīng)雙酶切后的驗證結(jié)果圖；圖4為pET-LBA0625重組質(zhì)粒圖譜構(gòu)建流程；圖5為重組大腸桿菌PLY127-2全蛋白圖，Lane1為對照組蛋白，Lane2為誘導(dǎo)后的蛋白；圖6為重組大腸桿菌PLY127-2誘導(dǎo)前后UGPase的酶活測定結(jié)果；圖7為通過Ni-NTA瓊脂糖親和層析純化后的蛋白電泳圖，Lane1-8為收集不同EP管的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE。具體實施方式以下結(jié)合附圖實施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。實施例1重組表達(dá)載體pET-LBA0625的構(gòu)建1、設(shè)計PCR引物用于擴(kuò)增過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（LBA0625）基因片段，PCR引物的序列如下所示：LBA0625上游擴(kuò)增引物：GGATCCATGAAAGTAAGAAAAGCTATTATTCCTGC；LBA0625下游擴(kuò)增引物：CTCGAGTTATTTATTTTTTCGCTTATCTTCAGCTT（下劃線部分為酶切位點）。2、以嗜酸乳桿菌(lactobacillusacidophilus)ATCC4356(該嗜酸乳桿菌已保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏中心登記入冊編號為1.1878，該菌種購買自中國普通微生物菌種保藏管理中心)基因組DNA為模板，進(jìn)行如下PCR程序：其中步驟(2)-(4)重復(fù)30個循環(huán)。PCR反應(yīng)體系如下表所示：表2試劑用量/μL5×PrimeSTARBuffer10dNTPMixture4正向引物1反向引物1模板DNA2PrimeSTARHSDNA聚合酶0.5ddH2O31.5Total50圖1為目的基因PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，其中Lane1、2為基因LBA0625PCR擴(kuò)增后產(chǎn)物，由圖1的電泳條帶位置可以看出產(chǎn)物分子量與該基因長度基本一致。3、重組表達(dá)載體pET-LBA0625的構(gòu)建克隆載體BluntZero（1μL）與PCR產(chǎn)物以1:7的摩爾比混合后，于25℃反應(yīng)5min后，立即置于冰上。然后將連接產(chǎn)物Blunt-LBA0625轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。用質(zhì)粒小量提取試劑盒分別提取克隆質(zhì)粒Blunt-LBA0625和表達(dá)載體pET-28a，均用XhoⅠ和BamHⅠ進(jìn)行雙酶切后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后切膠回收；將克隆質(zhì)粒Blunt-LBA0625膠回收產(chǎn)物和表達(dá)載體pET-28a膠回收產(chǎn)物以摩爾比7:1在T4連接酶的作用下22℃反應(yīng)30min構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-LBA0625，然后將連接產(chǎn)物pET-LBA0625轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中復(fù)制；圖2為表達(dá)載體pET-28a經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，由圖2說明載體酶切完全。圖3為克隆質(zhì)粒Blunt-LBA0625經(jīng)XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切后瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果，由圖3說明質(zhì)粒酶切完全，并且PCR產(chǎn)物與克隆載體BluntZero連接正確。實施例2大腸桿菌基因工程菌PLY127-2的構(gòu)建將實施例1制備得到的pET-LBA0625重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)提取后，熱激轉(zhuǎn)化導(dǎo)入至感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）中，涂布卡那霉素抗性平板，再在37℃培養(yǎng)12h，篩選轉(zhuǎn)化子，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR驗證，從而獲得過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因LBA0625的重組大腸桿菌PLY127-2。其中熱激轉(zhuǎn)化具體步驟如下：向50μL感受態(tài)大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞中加入重組表達(dá)質(zhì)粒pET-LBA0625，輕輕混勻，冰浴30min后，42℃水浴熱激45s，然后快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中2min；向離心管中加入500μLLB培養(yǎng)基，混勻后至于37℃，200rpm復(fù)蘇1h，吸取100μL已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布卡納霉素抗性LB平板。實施例3表達(dá)外源蛋白將實施例2構(gòu)建的重組大腸桿菌PLY127-2接種于LB肉湯中，于37℃，200r/min過夜活化，制備種子培養(yǎng)液，將種子培養(yǎng)液以8％(v/v)的接種量接種于LB肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600≈0.5時，取10mL菌液用于提取對照組蛋白。向剩下培養(yǎng)基中加入誘導(dǎo)劑異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度為0.4mM，30℃誘導(dǎo)6h后，于5500rpm離心10min，棄上清。菌體用生理鹽水洗3次后，然后加入PBS緩沖液重懸菌體，超聲破碎提取蛋白，于10,000×g離心20min后，取其上清，將對照組與實驗組蛋白濃度調(diào)一致后，然后通過SDS-PAGE進(jìn)行分析（如圖5所示）。圖5為重組大腸桿菌PLY127-2全蛋白圖，Lane1為對照組蛋白，Lane1為誘導(dǎo)后的蛋白；對比Lane1、Lane2，可以看出外源蛋白得到了高效表達(dá)。實施例4重組大腸桿菌的UGPase酶活測定用實施例3制備好的蛋白，用UGPase試劑盒檢測酶活(如圖6所示)，對照組為沒有進(jìn)行誘導(dǎo)的重組大腸桿菌的蛋白，處理組為誘導(dǎo)后重組大腸桿菌的蛋白。由圖6可知，誘導(dǎo)后（處理組）的酶活為456.14IU/L，是對照組（194.71IU/L）的2.34倍。實施例5蛋白純化裝填0.28×10cmhis-NTA柱子，用結(jié)合緩沖液平衡（10mM咪唑、20mMTris、0.5MNaCl，pH=8.0），流速控制在0.5mL/min，然后上樣10mL誘導(dǎo)的蛋白，并繼續(xù)用上述結(jié)合緩沖液清洗至平衡狀態(tài)，再用洗脫緩沖液（250mM咪唑、20mMTris、0.5MNaCl，pH=8.0）洗脫目的蛋白，流速控制為1mL/min，用10mLEP管收集洗脫液，取最高峰所對應(yīng)的管液（從最高峰出現(xiàn)到最高峰結(jié)束）進(jìn)行SDS-PAGE檢測(如圖7所示)。取1mL純化后的蛋白，測定其濃度及酶活，利用本發(fā)明方法獲得的UGPase的活性回收率為53.55%，蛋白純化倍數(shù)為12.96倍（如表1所示）。表1樣品蛋白含量/mg酶活/U比活力（U/mg）回收率純化倍數(shù)原樣4.622.84.96100%1洗脫峰0.1912.2164.2653.55%12.96圖7為通過Ni-NTA瓊脂糖親和層析純化后的蛋白電泳圖，Lane1-8為收集不同EP管的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE。由圖7可知，蛋白純化濃度高，純度高，是純化帶有his標(biāo)簽蛋白的有效方法。當(dāng)然，上述說明并非對本發(fā)明的限制，本發(fā)明也并不限于上述舉例。本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的實質(zhì)范圍內(nèi)做出的變化、改型、添加或替換，也應(yīng)屬于本發(fā)明保護(hù)范圍。序列表<110>寧波大學(xué)<120>過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因及其重組大腸桿菌的構(gòu)建方法和純化方法<130><160>3<170>PatentInversion3.3<210>1<211>903<212>DNA<213>人工序列<220><223>過表達(dá)尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶基因<400>1ATGAAAGTAAGAAAAGCTATTATTCCTGCAGCTGGGTTAGGTACTAGATTCTTACCTGCAACTAAAGCTTTGCCAAAAGAAATGTTACCAATTGTTGATAAGCCAACAATTCAATTTATTGTTGAAGAAGCTAAAAAATCTGGAATTGAAGATATCCTGATTATTATTGGTAAAAATAAGCGCCCAATTGAAGACCATTTTGATGCAAATCCTGAACTAGAACAGGATTTGAAGGAAAAAGGGAAAGATGAACTTCTTGAATTAACTCAGGGAATTACTAATTTGGGTGTTAACTTATATTACACTAGACAACCTCATCCAGCAGGCCTTGGAGATGCAATTTATCGTGCCCGTAGTTTTGTTGGAGATGAACCTTTTGTAGTTATGCTTGGTGATGATTTGATGGACGACAAAGTTCCATTAACTAAGCAATTAATTGATCGATACAACAAGACTCATGCCTCAACTATTGCTGTTATGCCAGTACCACATGAAGAAGTATCAAAATATGGTGTTATCGAACCAGAAAATGAAATTTTACCTGGTTTAATTAACGTTAAGTCATTTGTCGAAAAACCAGATGTTGACAAGGCACCAAGTGACTATGCAATTATTGGCCGCTATTTGTTAATGCCTGAAATTTTTGAAATTTTAGCAAATCAAAAACCAGGTCGTGGTGGAGAAATCCAATTAACTGATGCCATTGATACAATGAATAAGACTCAACGTGTATTTGCCCATGTCTTTAAGGGTGAACGTCATGATGTTGGTAACAAAGAAGGATATCTTGAAACTTCAATTGAATATGGTTTAAAGCATCCAGAAATTAAAGATCAATTGCGTGAATATATTCAACGCTTAGGCAAAAAATTTGAAGCTGAAGATAAGCGAAAAAATAAATAA903<210>2<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>LBA0625上游擴(kuò)增引物<400>2GGATCCATGAAAGTAAGAAAAGCTATTATTCCTGC35<210>3<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>LBA0625下游擴(kuò)增引物<400>3CTCGAGTTATTTATTTTTTCGCTTATCTTCAGCTT35當(dāng)前第1頁1 2 3