本發(fā)明涉及生物蛋白質(zhì)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其涉及一種梅花鹿角盤膠原水解肽的制備方法。
背景技術(shù)：
：鹿角盤指的是雄性鹿在鋸茸后殘留在角柄上的骨化物，到了第二年新茸長(zhǎng)出前自動(dòng)脫落的盤狀物質(zhì)，也命名為“鹿花盤”、“鹿角帽”，主要含有多種必需氨基酸及多種礦物質(zhì)元素。鹿角盤呈盔狀或扁盔狀，直徑2-5cm，高2-4.5cm，表面為灰黃色或灰褐色，呈蜂窩狀，底面較平并富有一定光澤，上部呈現(xiàn)出不規(guī)則的半球形形狀，質(zhì)地較為堅(jiān)硬，顏色呈灰白色。近些年來(lái)，對(duì)于鹿角盤的成分主要從以下幾個(gè)部分進(jìn)行研究，主要是氨基酸、無(wú)機(jī)元素、蛋白多肽類物質(zhì)等等，同時(shí)也有少量報(bào)道稱鹿角盤中含有甾體類、多糖類等物質(zhì)。張鶴比較了鹿骨與鹿角盤酶法提取物的蛋白含量，并通過(guò)探索酶與底物比例及酶解時(shí)間等因素優(yōu)化了鹿角盤的酶解工藝，優(yōu)化后工藝鹿角盤蛋白的收率高達(dá)22.31％。于文影通過(guò)正交分析等手段探索了梅花鹿角盤的最佳酶解用酶及酶解條件。賴海濤等人為使廢棄物得到利用，利用酶解的辦法提取烤鰻下腳料中存留的蛋白質(zhì)，并通過(guò)正交試驗(yàn)確定了枯草桿菌蛋白酶、木瓜蛋白酶及胃蛋白酶的最佳酶解工藝，確定最佳水解酶為木瓜蛋白酶。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了得到相對(duì)分子質(zhì)量較小的小分子混合多肽，本發(fā)明提供一種梅花鹿角盤膠原水解肽的制備方法。一種梅花鹿角盤膠原水解肽的制備方法，按照下述步驟進(jìn)行：A、稱取梅花鹿角盤粉末置于燒杯中，加入蒸餾水，在沸水浴中加熱，加熱過(guò)程中用玻璃棒不斷攪拌，且不斷用蒸餾水補(bǔ)充使提取勻漿體積維持恒定，4-6h后離心，取上清液4℃冰箱保存，沉淀置于燒杯中加入蒸餾水繼續(xù)水浴提取，共提取4-5次，合并每次提取的上清液，合并時(shí)水浴加熱5min并不斷攪拌，即為梅花鹿角盤明膠提取液；B、取梅花鹿角盤明膠提取液，按酶與梅花鹿角盤粉末1∶1250的比例加入適量的胰蛋白酶解液，37℃水浴條件下酶解50-70min，期間不斷用玻璃棒輕輕攪拌，酶解后的明膠提取液馬上于100℃沸水浴中煮沸3-8min使胰蛋白酶失活，沸水浴后的酶解液離心，取上清，即獲得梅花鹿角盤膠原水解肽；C、將梅花鹿角盤膠原水解肽液置于大培養(yǎng)皿內(nèi)，真空冷凍干燥機(jī)凍干，得梅花鹿角盤膠原水解肽凍干品，裝于自封袋后于-20℃冰箱保存待用。優(yōu)選的，所述的步驟A中，沸水浴后離心，離心條件為7000rpm，25℃，20min。優(yōu)選的，所述的步驟B中，沸水浴后的酶解液離心，離心條件為8000rpm，25℃，10min。本發(fā)明所提供的梅花鹿角盤膠原水解肽的制備方法，先將梅花鹿角盤粉末在費(fèi)用中加熱然后離心，重復(fù)多次提取，然后用胰蛋白酶解液進(jìn)行酶解，煮沸使胰蛋白酶失活后，離心即可得到膠原水解肽，通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)的制備方法的改進(jìn)，使最終的酶解混合物中小分子混合多肽的相對(duì)分子質(zhì)量多集中在5kDa以下。本發(fā)明可為鹿角盤產(chǎn)品的深度開發(fā)提供可供參考的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，更為促進(jìn)吉林省鹿產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有積極的作用。附圖說(shuō)明圖1為實(shí)施例1中蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。圖2為實(shí)施例1中鹿角盤明膠的SDS-PAGE電泳結(jié)果圖。圖3為實(shí)施例1中膠原水解肽的質(zhì)譜分析圖。具體實(shí)施方式實(shí)施例1一種梅花鹿角盤膠原水解肽的制備方法，按照下述步驟進(jìn)行：A、稱取100g梅花鹿角盤粉末置于2000mL燒杯中，加入1000mL蒸餾水，在沸水浴中加熱，加熱過(guò)程中用玻璃棒不斷攪拌，且不斷用蒸餾水補(bǔ)充使提取勻漿體積維持恒定，加熱5h后離心(7000rpm，25℃，20min)，取上清液4℃冰箱保存，沉淀置于燒杯中加入1000mL蒸餾水繼續(xù)水浴提取，共提取4次，合并4次上清液(合并時(shí)水浴加熱5min并不斷攪拌)，即為梅花鹿角盤明膠提取液；B、取梅花鹿角盤明膠提取液100mL，按酶與底物1∶1250的比例加入適量的胰蛋白酶解液(底物指梅花鹿角盤粉末)，37℃水浴條件下酶解1h(期間不斷用玻璃棒輕輕攪拌使酶與底物充分接觸)，酶解后的明膠提取液馬上于100℃沸水浴中煮沸5min(使胰蛋白酶失活)，沸水浴后的酶解液離心(離心條件為8000rpm，25℃，10min)，取上清，即獲得梅花鹿角盤膠原水解肽；C、將梅花鹿角盤膠原水解肽液置于大培養(yǎng)皿內(nèi)，真空冷凍干燥機(jī)凍干，得梅花鹿角盤膠原肽凍干品，裝于自封袋后于-20℃冰箱保存待用。實(shí)施例2明膠蛋白提取率的測(cè)定(BCA法)取梅花鹿角盤明膠提取液20μL并用蒸餾水稀釋至400μL(避免明膠提取液濃度大超出BCA法測(cè)定范圍，故將原液稀釋20倍)，作為待測(cè)樣。BCA具體方法如下：根據(jù)實(shí)驗(yàn)用量，將溶液A與溶液B按體積比50∶1混合均勻，即為BCA工作液。完全融化牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品(BSA含量為5mg/mL)，取10μL用蒸餾水稀釋至100μL(終濃度0.5mg/mL)，按0、1、2、4、8、12、16、20μL分別加到96孔板中并用蒸餾水補(bǔ)齊至20μL。向各加樣孔中加入200μL工作液，60℃烘箱放置半小時(shí)，待冷卻至室溫后，用酶標(biāo)儀在562nm處測(cè)定吸光值。以蛋白含量為橫坐標(biāo)，吸光值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，按公式1計(jì)算除鹽品中蛋白含量。計(jì)算方法如下：樣品蛋白含量(％)＝查的樣品蛋白含量×稀釋倍數(shù)×100/樣品質(zhì)量(公式1)表1蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線制作孔號(hào)12345678標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液(μL)01248121620蒸餾水(μL)2019181612840BCA工作液(μL)200200200200200200200200測(cè)試得到如下結(jié)果：牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線系數(shù)為0.994，酶標(biāo)儀在562nm處測(cè)定的吸光值如表2所示。將待測(cè)品吸光值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)查得相應(yīng)蛋白含量，根據(jù)公式1計(jì)算得制備的梅花鹿角盤明膠蛋白的提取率為21.23％。表2樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液光度值實(shí)施例3明膠蛋白的電泳檢測(cè)(Tricine-SDS-PAGE法)(1)垂直凝膠模具的固定：電泳所用玻璃板夾層寬度為1.0mm，用清水清洗玻璃板并用蒸餾水及去離子水潤(rùn)洗，將玻璃板固定于電泳槽中，坐于制膠夾上。(2)凝膠的配制：16％分離膠的配制(4.5mL)：稱取尿素1.60g置于干凈小燒杯中，加1.874mL去離子水溶解，待尿素完全溶解后，向燒杯中依次加入1.333mL凝膠緩沖液、1.293mL膠貯備液II、20μL10％過(guò)硫酸銨和2.0μLTEMED。用移液槍輕輕吹打使分離膠混合均勻后，灌膠至適當(dāng)高度，并用移液槍吸取1mL異丙醇灌入(壓膠并消除氣泡)，室溫下凝固1h。5％濃縮膠的配制(2.5mL)：向干凈的小燒杯中依次加入1.420mL去離子水、0.830mL凝膠緩沖液、0.250mL膠貯備液I、25μL10％過(guò)硫酸銨和2.5μLTEMED，移液槍反復(fù)吹打使?jié)饪s膠液混合均勻，待用。用濾紙除去分離膠上層的異丙醇后，灌入濃縮膠并插入制膠梳子，室溫下凝固40min。待濃縮膠凝固后，輕輕拔掉制膠梳子，將電泳槽取下并放入電泳槽中，向電泳槽內(nèi)槽注入負(fù)極緩沖液，電泳槽外槽注入正極緩沖液。(3)樣品處理和電泳：取梅花鹿角盤明膠提取液20μL并用蒸餾水稀釋至400μL，作為電泳樣品。樣品同電泳Marker共同沸水浴處理5min后，上樣(蛋白Marker10μL，樣品25μL)。電泳起始電壓為80V，當(dāng)溴酚藍(lán)指示線遷移至濃縮膠與分離膠分界線時(shí)將電壓調(diào)至120V，待溴酚藍(lán)指示線遷移至距離分離膠底0.5cm處時(shí)，關(guān)閉電泳儀，停止電泳。(4)染色和脫色：將膠片轉(zhuǎn)移至干凈大培養(yǎng)皿中，于搖床上用染色液(考馬斯亮藍(lán)R-250)染色5h，倒去染色液并用蒸餾水清洗膠片后，脫色液脫色至背景干凈為止。膠片于紫外成像儀中拍照并保存。測(cè)試結(jié)果如下：如圖2所示，電泳顯示熱提取的梅花鹿角盤明膠蛋白的相對(duì)分子質(zhì)量集中在200.0kDa至14.3kDa之間，且分布十分密集(說(shuō)明明膠中的蛋白質(zhì)種類較多、含量較高)。實(shí)施例4膠原水解肽的質(zhì)譜檢測(cè)由于酶解不會(huì)使原有的大量蛋白消失而只會(huì)使蛋白變成更多的多肽，結(jié)合圖2梅花鹿角盤明膠蛋白的電泳結(jié)果，我們分析酶解后的梅花鹿角盤膠原水解肽通過(guò)SDS-PAGE電泳檢測(cè)不能完全顯示出來(lái)，尤其是低分子量的肽。因此，采用質(zhì)譜檢測(cè)梅花鹿角盤膠原水解肽。梅花鹿角盤膠原肽的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果如圖3所示，與我們的分析相符，證明了梅花鹿角盤膠原肽的相對(duì)分子質(zhì)量集中在5kDa以下?？咕阅軐?duì)比測(cè)試：本發(fā)明采用紙片擴(kuò)散法對(duì)本發(fā)明制備的膠原水解肽和張鶴在《梅花鹿膠原蛋白制備及治療骨質(zhì)疏松癥作用研究》中公開的膠原水解肽的抑菌活性進(jìn)行初步探討，試驗(yàn)評(píng)定結(jié)果通過(guò)測(cè)量各抑菌劑產(chǎn)生的抑菌環(huán)直徑來(lái)進(jìn)行，可初步判斷各制備品抑菌能力的強(qiáng)弱。具體步驟如下：將小培養(yǎng)皿、鑷子、去離子水、圓形濾紙片、移液槍等抑菌試驗(yàn)所用物品放入超凈工作臺(tái)中，開啟紫外滅菌30min。紫外照射后，點(diǎn)燃酒精燈并用酒精棉反復(fù)擦拭臺(tái)面及試驗(yàn)所用器具。取四個(gè)干凈小培養(yǎng)皿置于酒精燈附近，分別標(biāo)記為陽(yáng)性對(duì)照組、陰性對(duì)照組(陰性對(duì)照組為去離子水)、A組和B組，并向各組培養(yǎng)皿中放入圓形濾紙片若干。按照分組，用移液槍取對(duì)應(yīng)的抑菌劑浸潤(rùn)到對(duì)應(yīng)的濾紙片上，平均每個(gè)濾紙片浸潤(rùn)10μL對(duì)應(yīng)的抑菌劑，待濾紙片干燥后才可進(jìn)行貼片。在等待濾紙片干燥的過(guò)程中，融化固體培養(yǎng)基并分裝于若干干凈小培養(yǎng)皿中(每個(gè)小培養(yǎng)皿中20mL培養(yǎng)基)。待固體培養(yǎng)基充分凝固且溫度接近于室溫后，取活化后的菌液200μL均勻涂布于固體培養(yǎng)基中，待涂布均勻后貼片。貼片后的各固體培養(yǎng)基用封口膜封住周邊且做好標(biāo)記，倒置培養(yǎng)。白色念珠菌需在30℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)18～20h，其余革蘭氏陰性菌及革蘭氏陽(yáng)性菌均在37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)16～18h。倒置培養(yǎng)完畢后，用游標(biāo)卡尺測(cè)量各抑菌劑的抑菌環(huán)直徑并記錄，并拍照保存。抑菌試驗(yàn)的具體分組如下：A組：取本發(fā)明制備的膠原水解肽凍干品10mg，用1mL去離子水充分溶解并分裝后，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。B組：取張鶴實(shí)驗(yàn)方法制備的膠原水解肽凍干品10mg，用1mL去離子水充分溶解并分裝后，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。AMP陽(yáng)性對(duì)照組：取氨芐青霉素10mg，用1mL去離子水充分溶解并分裝后，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆?。陰性?duì)照組：去離子水。表1：各菌抑菌環(huán)直徑測(cè)試數(shù)據(jù)。由以上測(cè)試數(shù)據(jù)可以知道，本發(fā)明制備的膠原水解肽和張鶴報(bào)道的膠原水解肽的抑菌活性要好，尤其是革蘭氏陽(yáng)性菌的抑菌效果要好很多。綜上所述：本發(fā)明利用胰蛋白酶為水解酶，采用熱提法及多次浸提等手段是為了增加梅花鹿角盤的蛋白提取率，經(jīng)BCA法測(cè)定蛋白提取率高達(dá)21.23％。說(shuō)明鹿角盤中總蛋白的含量較高。酶解時(shí)不同的酶用量會(huì)產(chǎn)生不同的酶解產(chǎn)物，酶用量越多，酶解混合物中氨基酸及短肽的相對(duì)豐度也就越大，因此根據(jù)需要控制酶用量是十分關(guān)鍵的。本發(fā)明根據(jù)前期工作基礎(chǔ)，將酶與底物比例選為1∶1250，最后通過(guò)質(zhì)譜方法檢測(cè)確定酶解混合物中小分子混合多肽的相對(duì)分子質(zhì)量多集中在5kDa以下，符合預(yù)期目標(biāo)。近年來(lái)，酶解技術(shù)由于其反應(yīng)條件溫和、易控制、操作簡(jiǎn)單、后續(xù)步驟少等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于小分子蛋白質(zhì)、多肽混合物的制備。胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶等是酶解技術(shù)中經(jīng)常用到的酶。本發(fā)明通過(guò)酶解技術(shù)獲得的膠原水解肽與
背景技術(shù)：
中的研究結(jié)果相一致，但所得膠原水解肽的相對(duì)分子質(zhì)量顯著低于張鶴等人報(bào)道，其原因可能是本實(shí)驗(yàn)中使用的酶與底物的比例不同所致。以上所述，僅為本發(fā)明較佳的具體實(shí)施方式，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員在本發(fā)明揭露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3