專利名稱：一種產(chǎn)堿性蛋白酶基因工程菌及其應用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種產(chǎn)堿性蛋白酶基因工程菌及其應用，屬于遺傳工程酶工程技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
蛋白酶是指能催化肽鏈中肽鍵水解的一類酶，廣泛存在于動物內(nèi)臟、植物莖葉果實和微生物中。根據(jù)不同分類依據(jù)，可以將蛋白酶分為不同的類群。蛋白酶是工業(yè)酶中用的最多的一種酶，約占酶總量60%，其中堿性蛋白酶就占25%。堿性蛋白酶廣泛應用于洗滌劑、制革業(yè)、食品工業(yè)中。1989 ^ Tatsumi (H. Tatsumi, Y. Ogawa, S. Murakami, et al. A Full Length cDNA Clone for the Alkaline Protease from Aspergillus oryzae : Structural Analysis and Expression in Saccharomyces cerevisiae. Molecular & General Genetics. 1989,219:33-38)等人克隆了堿性蛋白酶的全基因序列，該基因序列含有 1212bp，編碼404個氨基酸，其中包括一個信號肽、一個前導肽和一個成熟蛋白質(zhì)；在畢赤酵母O0ZcAia /^1Stori1S)中克隆表達。2008年郭繼平(郭繼平.米曲霉堿性蛋白酶的異源表達和定向進化以及遺傳改造[博士學位論文]，哈爾濱工業(yè)大學，哈爾濱工業(yè)大學圖書館， 2008年)等人利用畢赤酵母對米曲霉蛋白酶基因進行了高效表達，酶活力達到llU/mg，遠高于前人采其它表達系統(tǒng)中的表達量，并研究了不同信號肽對米曲霉堿性蛋白酶在畢赤酵母 iPichia pas tor is)中的表達效果。我國對蛋白酶的研究主要側(cè)重于發(fā)酵優(yōu)化，即從自然界篩選菌株進而進行發(fā)酵優(yōu)化，采用畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵，以此來提高堿性蛋白酶酶活。但是，幾乎沒有關(guān)于重組大腸桿菌米曲霉堿性蛋白酶基因工程菌的研究報道。利用具有明顯優(yōu)勢的大腸桿菌表達系統(tǒng)構(gòu)建表達米曲霉堿性蛋白酶的工程菌菌株，通過廉價的方法表達和生產(chǎn)來自米曲霉的堿性蛋白酶是急待解決的問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種產(chǎn)堿性蛋白酶基因工程菌。所述基因工程菌攜帶有堿性蛋白酶基因序列。所述基因工程菌為大腸桿菌(五coh· BL21 (DE3)-pET-alp)。所述堿性蛋白酶基因序列如SEQID NO: 1所示。所述堿性蛋白酶基因來源為米曲霉(Aspergillus oryzae)，對應GenBank :X17561的第53至1264位堿基的基因片段。將限制性內(nèi)切酶Mfe I稱BamHl識別序列分別加在其5'-端及3'-端，形成的序列為SEQ ID N0: 1。本發(fā)明所要解決的另一個技術(shù)問題是提供一種利用所述工程菌生產(chǎn)堿性蛋白酶的方法。為解決上述技術(shù)問題，所采用的技術(shù)方案為，首先制備基因工程菌種子培養(yǎng)液，然后對種子進行發(fā)酵擴大培養(yǎng)，最后誘導產(chǎn)酶。
所述誘導條件為當菌體培養(yǎng)至OD6tltl為0. 8時，加入IPTG后迅速轉(zhuǎn)至25°C的搖床，繼續(xù)誘導7-9h。所述IPTG濃度為1 mM。所述種子培養(yǎng)條件為
從甘油管中接入250mL三角瓶，裝液量50mL，回旋式搖床轉(zhuǎn)速200 rpm,培養(yǎng)溫度為 37°C，培養(yǎng) 8 h。所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為
發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按洲(ν/ν)的接種量接種至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中進行培養(yǎng)，開始培養(yǎng)溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速200 rpm，當菌體培養(yǎng)至 OD600為0.8時停止。應用基因工程菌生產(chǎn)堿性蛋白酶所需培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.0，卡那霉素50 μ g/
mL ；
發(fā)酵培養(yǎng)基甘油4g/L，酵母膏M g/L，蛋白胨12 g/L，氯化鈉10g/L，磷酸二氫鉀 2. 32g/L，磷酸氫二鉀 16. 43g/L，pH 7.0,50 yg/mL 卡那霉素。種子培養(yǎng)從甘油管中接入250mL三角瓶，裝液量50mL，回旋式搖床轉(zhuǎn)速200 rpm, 培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)8 h；
發(fā)酵培養(yǎng)將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按洲(ν/ν)的接種量接種至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中進行培養(yǎng)，開始培養(yǎng)溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速200 rpm，當菌體培養(yǎng)至 OD600為0. 8時，加入IPTG后迅速轉(zhuǎn)至25°C的搖床，繼續(xù)誘導7_恥。本發(fā)明通過分子生物學的手段，構(gòu)建了一株高產(chǎn)堿性蛋白酶的基因工程菌 (E. coli BL21(DE;3)-pET-alp)，應用該菌種表達生產(chǎn)堿性蛋白酶，測定粗酶活，酶活力達到 37U/mg。具有生產(chǎn)工藝簡單的等優(yōu)點；本發(fā)明為米曲霉堿性蛋白酶的研究、開發(fā)、生產(chǎn)工作奠定了基礎(chǔ)，并進一步證實了大腸桿菌基因工程菌構(gòu)建的廣泛可行性。


圖1表達載體pET-alp驗證
1 質(zhì)粒PCR驗證2 質(zhì)粒PCR驗證 3 =MARKER 4 質(zhì)粒雙酶切驗證5 質(zhì)粒雙酶切
驗證
圖2基因工程菌BL21(DE3)-pET-alp全細胞堿性蛋白酶表達量與時間關(guān)系 1 誘導表達Ih 2 誘導表達池 3 誘導表達: 4誘導表達4h 5 誘
導表達證 6:誘導表達Mi 7:誘導表達8:誘導表達他 9:空白對照 10 :Marker
圖3基因工程菌BL21 (DE3)-pET-alp全細胞堿性蛋白酶表達量與時間關(guān)系 1:誘導表達2:誘導表達IOh3:誘導表達Ilh 4誘導表達12h 5
誘導表達13h 6:誘導表達14h 7:誘導表達15h 8:誘導表達 IMi 9 空白對照 10 Marker。
具體實施例方式以下通過實施例來進一步闡明本發(fā)明，下列實施例用于說明目的而非用于限制本發(fā)明范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，基本上都按照常見的分子克隆手冊所述的條件進行操作。實施例1 米曲霉堿性蛋白酶基因的獲取
堿性蛋白酶基因，序列為來源為A orj^ae JfSGenBank :X17561的第53至1264位堿基的基因片段。將限制性內(nèi)切酶Mfe I和識別序列分別加在其5'-端及3'-端， 形成的序列為SEQ ID NO: 1。實施例2 含米曲霉堿性蛋白酶基因表達載體的構(gòu)建
分別對含alp基因的PCR產(chǎn)物和表達載體pET-28a (+)進行Nde I和BamHl雙酶切，酶切體系如下質(zhì)粒 16 ？ L ； 10 X buffer 2 ？ L -,Nde I 1 ？ L -,BamHl 1 ？ L。將上述組分輕輕混勻，于37 °C酶切2 h后，瓊脂糖凝膠電泳并對目標片段進行膠回收。將回收片段進行連接，連接反應體系(10 PL):目的基因aT/7 2 μ L ；載體DNA 2 μ L ;10ΧΤ4 連接酶 Buffer 1 μ L ;T4 DNA 連接酶 1 μ L ;ddH20 4 μ L0 于 16°C水浴過夜。實施例3 米曲霉堿性蛋白酶基因工程菌的構(gòu)建
連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌BL21 (DE3)。轉(zhuǎn)化方法如下
(1)無菌狀態(tài)下取感受態(tài)細胞200μ L置于無菌的微量離心管中；
(2)每管加入1-2μ L重組質(zhì)粒，輕輕渦旋以混合內(nèi)容物，在冰上放置30 min；
(3)42°C熱休克90 s,不要搖動離心管；
(4)快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴中，使細胞冷卻1-2min；
(5)每管加入無抗生素的普通LB培養(yǎng)液800uL；
(6)用無菌鋪菌器將200μ L菌液鋪于含Kan的瓊脂平板，然后倒置培養(yǎng)過夜，挑選陽性菌落。實施例4 重組菌株的篩選 1、酶切驗證
卡那霉素平板上挑選8個單菌落分別接入含10 mL LB液體培養(yǎng)基(50yg/mL Kan)中， 搖瓶培養(yǎng)過夜，提取轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒。用Nde I和BernHl雙酶切重組質(zhì)粒(10 μ L體系)質(zhì)粒 7 μ L ； 10Xbuffer 1 μ L ； Nde I 1 μ L ； BamHl 1 μ L。37°C酶切 2h，凝膠電泳分析(圖 1)。2、陽性重組質(zhì)粒PCR驗證(25 μ L體系)
體系質(zhì)粒 0.1 μ L ； 10Xbuffer 2. 5 μ L ；引物(20 mmol/L)各 0. 5 μ L ；dNTP (各 2.5 mmol/L) 1 μ L ；Ti^DNA 聚合酶 0.4 μ L ；ddH20 22 μ L。PCR 條件預變性 94 "C _4min ；變性 94 "C min ；退火 55 "C -1 min ；延伸 720C -Imin, 35 個循環(huán)，最后延伸 72°C -10 min。凝膠電泳驗證(圖1)。3、基因的誘導表達
接種重組大腸桿菌BL21(DE3)-pET-alp單菌落于種子培養(yǎng)基(含卡那霉素50 μ g/ mL),以大腸桿菌BL21(DE3)-pET a(+)為對照，37°C培養(yǎng)8h，取500 μ L菌液接種于50 mL含有50 yg/mL卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)至OD達到0.8時加入1 mM IPTG誘導培養(yǎng)7-9 h，12000 rpm離心10 min收集細胞，Tris-HCl重懸破壁，離心上清液即為粗酶用于測定酶活力。
實施例5 發(fā)酵生產(chǎn)堿性蛋白酶
將甘油保存的基因工程菌接入種子培養(yǎng)基，使用250mL三角瓶，裝液量50mL，回旋式搖床轉(zhuǎn)速200 rpm，培養(yǎng)溫度為37°C，培養(yǎng)8 h ；將培養(yǎng)好的種子培養(yǎng)液按洲(ν/ν)的接種量接種至裝有50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中進行培養(yǎng)，開始培養(yǎng)溫度為37°C，搖床轉(zhuǎn)速200 rpm,當菌體培養(yǎng)至0D_為0. 8時，加入IPTG后迅速轉(zhuǎn)至25°C的搖床，繼續(xù)誘導 7_9h，粗酶液測定酶活力為37U/mg。其中最佳IPTG濃度為ImM。圖2及圖3為全細胞堿性蛋白酶表達量與時間關(guān)系(圖2，圖3)。應用基因工程菌生產(chǎn)堿性蛋白酶所需培養(yǎng)基
種子培養(yǎng)基酵母粉5 g/L，蛋白胨10 g/L，氯化鈉10 g/L，pH 7.0，卡那霉素50 μ g/
mL ；
發(fā)酵培養(yǎng)基甘油4g/L，酵母膏M g/L，蛋白胨12 g/L，氯化鈉10g/L，磷酸二氫鉀 2. 32g/L，磷酸氫二鉀 16. 43g/L，pH 7.0,50 yg/mL 卡那霉素。
雖然本發(fā)明已以較佳實施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護范圍應該以權(quán)利要求書所界定的為準。序列表 <110>江南大學
<120> 一種產(chǎn)堿性蛋白酶基因工程菌及其應用 <160> 1
<170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 1224 <212> DNA
<213>^Aspergillus oryzae )
<400> 1
catatgatgcagtccatcaagcgtaccttgctcctcctcggagctatccttcccgcggtc60ctcggtgcccctgtgcaggaaacccgccgggccgctgagaagcttcctggaaagtacatt120gtcacattcaagcccggcattgacgaggcaaagattcaggagcataccacctgggctacc180aacattcaccagcgcagtctggagcgtcgtggcgccactggcggtgatcttcctgtcggt240attgagcgcaactacaagatcaacaagttcgccgcctatgcaggctctttcgacgatgct300accattgaggagattcgcaagaacgaagatgttgcctacgtcgaggaggaccagatctac360tacctcgatggcctgactacccagaagagtgccccctggggtctgggcagcatttcccac420aagggccagcagagcaccgactacatctacgacactagtgccggcgagggcacctatgcc480tacgtggtggatagcggtgtcaatgtcgaccatgaggagttcgagggccgcgccagcaag540gcctacaacgctgccggtggtcagcatgtggacagcattggccatggcacccacgtttcc600ggcaccattgctggcaagacttatggtatcgccaagaaggccagcatcctttcggtcaaa660gttttccagggtgaatcgagcagcacttccgtcattcttgacggcttcaactgggctgcc720aacgacattgttagcaagaagcgtaccagcaaggctgcaatcaacatgagcttgggcggt780ggctactctaaggctttcaacgatgcggtcgagaacgcattcgagcagggtgttctctcg840gttgtcgctgccggtaacgagaactctgatgccggccaaaccagccctgcctctgcccct900gatgccatcaCtgttgCCgCtatccagaagagcaacaaccgcgccagtttctccaacttt960ggcaaggtcgttgacgtcttcgctcccggtcaagatatcctttctgcctggattggctct1020tcctctgccaccaacaccatctctggtacctccatggctactccccacattgtcggcctg1080tccctctacctcgctgcccttgagaacctcgatggccccgctgccgtgaccaagcgcatc1140aaggagttggccaccaaggacgtcgtcaaggatgttaagggcagccctaacctgcttgcc1200tacaacggtaacgcttaaggatcc122權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)堿性蛋白酶基因工程菌，攜帶有堿性蛋白酶基因。
2.權(quán)利要求1所述的基因工程菌，其特征在于所述基因工程菌為大腸桿菌(E.coli BL21 (DE3)-pET-alp)。
3.權(quán)利要求1或2所述的基因工程菌，其特征在于所述堿性蛋白酶基因序列如SEQID NO. 1所示。
4.權(quán)利要求1所述基因工程菌的應用，其特征在于包括如下步驟(1)制備種子培養(yǎng)液；(2)對種子發(fā)酵培養(yǎng)；(3)誘導產(chǎn)酶。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于所述誘導條件為當菌體培養(yǎng)至0D_為 0. 8時，加入IPTG后迅速轉(zhuǎn)至25°C的搖床，繼續(xù)誘導7-9h。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于所述IPTG使用濃度為1mM。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種產(chǎn)堿性蛋白酶基因工程菌及其應用，屬于遺傳工程領(lǐng)域。本發(fā)明首先克隆米曲霉堿性蛋白酶的基因序列(alp)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-alp，最后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，得到表達米曲霉堿性蛋白酶的基因工程菌BL21(DE3)-pET-alp，應用該菌種生產(chǎn)堿性蛋白酶活性可達37U/mg，具有顯著的進步。本發(fā)明簡單實用，有廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/19GK102174453SQ201010568519
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月1日 優(yōu)先權(quán)日2010年12月1日
發(fā)明者堵國成, 張傳志, 王天文, 陳堅 申請人:江南大學