本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，特別是一種利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法。
背景技術(shù)：
：限制性內(nèi)切酶是當(dāng)代基因工程研究不可缺少的重要工具，它們來源于不同的微生物，是細(xì)菌防御外來病毒入侵的武器。在20世紀(jì)60年代，科學(xué)家推測細(xì)菌中有限制-修飾系統(tǒng)（restriction-modificationsystem，R-Msystem），該系統(tǒng)包括兩類酶，即限制性內(nèi)切酶和DNA甲基化酶，前者負(fù)責(zé)降解進(jìn)入原核細(xì)胞的外源DNA，后者則對(duì)細(xì)胞自身的DNA進(jìn)行甲基化，從而保護(hù)細(xì)胞的DNA，使其不被細(xì)胞內(nèi)的限制性核酸內(nèi)切酶降解。現(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)限制性內(nèi)切酶的方法主要是將限制-修飾基因克隆入質(zhì)粒，靠質(zhì)粒的高拷貝數(shù)實(shí)現(xiàn)目的蛋白高表達(dá)，而且使用的是與限制性內(nèi)切酶對(duì)應(yīng)的特異性甲基化酶進(jìn)行制備，這種方法的提純程序繁瑣、限制性內(nèi)切酶得率低、生產(chǎn)成本高，獲得的甲基化保護(hù)菌株只能特異性保護(hù)宿主DNA免于某一種限制性內(nèi)切酶的切割，應(yīng)用范圍狹窄。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提出了一種利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法，可以應(yīng)用于多種限制性內(nèi)切酶的生產(chǎn)，降低了生產(chǎn)成本并且能夠獲得純度高、活力好的限制性內(nèi)切酶。本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的，一種利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法，其特點(diǎn)是：所述的甲基化酶是M.CviPI；所述的限制性內(nèi)切酶C選自：AatI，AscI，BanII，BglI，BmtI，BspQI，BsrDI，BssHII，BtsI，EagI，HindIII，KasI，MluI，NheI，NotI，NruI，NsiI，PstI，PvuII，SacI，SapI，SbfI，SfiI，SphI。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還可以通過以下的技術(shù)方案來進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。以上所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法，包括如下步驟：步驟（一）：將M.CviPI基因克隆至質(zhì)粒載體pACYC184上，得到M.CviPI組成型質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主菌，篩選獲得被甲基化保護(hù)的陽性重組菌株；步驟（二）：將所述限制性內(nèi)切酶C的基因克隆至質(zhì)粒載體pET-28b上，得到限制性內(nèi)切酶C重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化步驟（一）得到的已被甲基化保護(hù)的陽性重組菌，篩選穩(wěn)定、可誘導(dǎo)、高表達(dá)的限制性內(nèi)切酶C的重組表達(dá)菌株。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還可以通過以下的技術(shù)方案來進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。以上所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法中，所述的宿主菌為原核宿主細(xì)胞。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述的宿主菌為大腸桿菌。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題還可以通過以下的技術(shù)方案來進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)。以上所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法中，所述的步驟（一）和步驟（二）分別包括：步驟（一）：設(shè)計(jì)引物，根據(jù)設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增M.CviPI基因，M.CviPI的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、酶切后連接至質(zhì)粒載體pACYC184上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)測序獲得M.SssI的組成型質(zhì)粒pACYC184-M.CviPI，將pACYC184-M.CviPI轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于含氯霉素的LB平板上篩選克隆，獲得M.CviPI組成型表達(dá)菌株ER2566-M.CviPI；步驟（二）：（1）限制性內(nèi)切酶C重組表達(dá)菌株的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物，根據(jù)設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增限制性內(nèi)切酶C基因，限制性內(nèi)切酶C的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、酶切后連接至質(zhì)粒載體pET-28b上，限制性內(nèi)切酶C基因的插入部位處于T7啟動(dòng)子后，經(jīng)測序獲得限制性內(nèi)切酶C的重組質(zhì)粒pET-C，將pET-C轉(zhuǎn)化至ER2566-M.CviPI感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于含氯霉素及卡那霉素的LB平板上篩選克隆，獲得限制性內(nèi)切酶C的重組表達(dá)菌株ER2566-M.CviPI-C；（2）限制性內(nèi)切酶C的誘導(dǎo)表達(dá)將ER2566-M.CviPI-C涂布于含氯霉素及卡那霉素的LB平板上，培養(yǎng)并挑取單菌落接種于含氯霉素及卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，搖動(dòng)培養(yǎng)一段時(shí)間，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)限制性內(nèi)切酶C；（3）限制性內(nèi)切酶C的純化（a）取經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的ER2566-M.CviPI-C菌培養(yǎng)液，離心收集菌體；（b）菌體以Ni柱結(jié)合緩沖液重懸后破碎處理，離心取上清粗蛋白溶液過Ni親和層析純化柱，分步收集，將純度和濃度較高的收集樣混合、透析；（c）取步驟（b）中透析后的收集樣過陰離子交換層析柱，梯度洗脫，分步收集，將純度和濃度較高的收集樣混合、透析、貯存。本發(fā)明所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法中，進(jìn)一步優(yōu)選的技術(shù)方案或者技術(shù)特征是：1、在步驟（一）中，設(shè)計(jì)引物時(shí)，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫上小球藻病毒NYs-1型（ChlorellavirusNYs-1）的M.CviPI基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，在上游引物5’端引入大腸桿菌組成型表達(dá)啟動(dòng)子E.colipltlpromoter序列，在下游引物5’端引入大腸桿菌終止子E.colirrnBT1terminator的反向互補(bǔ)序列，在上、下游引物的5’端還分別引入HindIII酶切識(shí)別序列和保護(hù)堿基。2、在步驟（一）中，所述的氯霉素的濃度為17.5-70μg/mL。3、在步驟（二）中，構(gòu)建限制性內(nèi)切酶C重組表達(dá)菌株時(shí)，所述的氯霉素和卡那霉素的濃度分別為17.5-70μg/mL、37.5-150μg/mL。4、在步驟（二）中，誘導(dǎo)表達(dá)限制性內(nèi)切酶C時(shí)，將ER2566-M.CviPI-C接種于含17.5-70μg/mL氯霉素和37.5-150μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并挑取單菌落，再按2-5%的接種量接種于含17.5-70μg/mL氯霉素和37.5-150μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，于37℃搖動(dòng)培養(yǎng)，至菌密度達(dá)到3×108-4×108/mL時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.2-0.5mM，并在15-18℃以200-250rpm搖動(dòng)培養(yǎng)12-18h，誘導(dǎo)表達(dá)限制性內(nèi)切酶C。5、在步驟（二）中，純化限制性內(nèi)切酶C時(shí)：（a）取經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的ER2566-M.CviPI-C培養(yǎng)液，以4000g離心10min收集菌體；（b）菌體由Ni柱結(jié)合緩沖液重懸后用細(xì)胞高壓破碎儀破碎處理，43000g低溫離心30min棄去沉淀，得到上清粗蛋白溶液，上清粗蛋白溶液過Ni親和層析純化柱，分步收集，將純度和濃度較高的收集樣混合、透析；所述的Ni柱結(jié)合緩沖液的組成如下：10mMTris-HClpH7.4，250mMNaCl，5%甘油，5mM咪唑；其中，在Ni親和層析過程中使用的緩沖液及其組成分別為：平衡緩沖液：10mMTris-HClpH7.4，250mMNaCl，5%甘油，5mM咪唑；漂洗緩沖液：10mMTris-HClpH7.4，250mMNaCl，5%甘油，20mM咪唑；洗脫緩沖液：10mMTris-HClpH7.4，250mMNaCl，5%甘油，400mM咪唑；（c）在陰離子交換層析過程中使用的緩沖液和梯度洗脫液分別為：平衡緩沖液：10mMTris-HClpH7.4，250mMNaCl，5%甘油，1mMDTT，0.1mMEDTA；梯度洗脫液包括：10mMTris-HClpH7.4，250mMNaCl，5%甘油，1mMDTT，0.1mMEDTA；10mMTris-HClpH7.4，300mMNaCl，5%甘油，1mMDTT，0.1mMEDTA；10mMTris-HClpH7.4，500mMNaCl，5%甘油，1mMDTT，0.1mMEDTA；10mMTris-HClpH7.4，700mMNaCl，5%甘油，1mMDTT，0.1mMEDTA；10mMTris-HClpH7.4，1MNaCl，5%甘油，1mMDTT，0.1mMEDTA。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，重組工程菌的構(gòu)建過程中直接使用廣譜保護(hù)型甲基化酶M.CviPI，M.CviPI能夠識(shí)別并特異性甲基化修飾GpC序列，M.CviPI對(duì)宿主DNA進(jìn)行甲基化修飾可以保護(hù)宿主DNA免于宿主細(xì)胞內(nèi)酶切位點(diǎn)中含有GpC序列的限制性內(nèi)切酶的切割，因此，可以應(yīng)用于一系列酶切位點(diǎn)中含有GpC序列的限制性內(nèi)切酶的生產(chǎn)，避免了對(duì)單個(gè)限制性內(nèi)切酶進(jìn)行繁瑣的甲基化酶基因篩選，大大簡化了重組表達(dá)過程，應(yīng)用廣泛。在純化工藝中，由于載體pET-28b具有6×His純化標(biāo)簽編碼序列，最終表達(dá)的重組蛋白上含有6×His純化標(biāo)簽，采用鎳親和層析柱進(jìn)行蛋白純化，極大地簡化了目的蛋白的純化工作。本發(fā)明方法在保證酶活的基礎(chǔ)上提高了限制性內(nèi)切酶得率，降低了生產(chǎn)成本，為大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)限制性內(nèi)切酶提供了有益的理論及實(shí)踐依據(jù)。附圖說明圖1為本發(fā)明實(shí)施例12中M.CviPI組成型質(zhì)粒圖譜；圖2為本發(fā)明實(shí)施例12中PstI重組質(zhì)粒圖譜；圖3為本發(fā)明實(shí)施例12中PstI重組表達(dá)的檢測電泳圖；其中：1：蛋白粗酶液特異性酶切條帶；M：DNAMarker。圖4為本發(fā)明實(shí)施例12中PstI經(jīng)鎳親和柱純化后的電泳圖；其中：1：上樣流出液；2：5mM咪唑；3：20mM咪唑；4：40mM咪唑；M：蛋白Marker。圖5為本發(fā)明實(shí)施例12中PstI經(jīng)陰離子交換層析住純化后的電泳圖；其中：1：上樣流出液；2：250mMNaCl；3：300mMNaCl；4：500mMNaCl；M：蛋白Marker。圖6為本發(fā)明實(shí)施例12中PstI酶活力檢測電泳圖；其中：1：PstI原液稀釋1600倍；2：PstI原液稀釋3200倍；3：PstI原液稀釋6400倍；4：PstI原液稀釋12800倍；5：PstI原液稀釋25600倍；6：DNAMarker。圖7為本發(fā)明實(shí)施例12中PstI星號(hào)活性及非特異性DNA酶污染檢測電泳圖；其中：1-5為PstI酶切底物1h的電泳圖，6-10為PstI酶切底物16h的電泳圖；1、6：PstI原液稀釋1600倍；2、7：PstI原液稀釋3200倍；3、8：PstI原液稀釋6400倍；4、9：PstI原液稀釋12800倍；5、10：PstI原液稀釋25600倍；6、12：PstI原液稀釋3840倍；M：Marker。圖8為本發(fā)明實(shí)施例12中酶切-連接-再酶切檢測電泳圖；其中：1：PstI酶切Commonfragment；2：T4DNA連接酶連接酶切后片段；3：PstI再次酶切連接片段；M：DNAMarker。具體實(shí)施方式以下參照附圖，進(jìn)一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)其權(quán)利的限制。實(shí)施例1，一種利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法，所述的甲基化酶是M.CviPI，所述的限制性內(nèi)切酶（代號(hào)為C）選自：AatI，AscI，BanII，BglI，BmtI，BspQI，BsrDI，BssHII，BtsI，EagI，HindIII，KasI，MluI，NheI，NotI，NruI，NsiI，PstI，PvuII，SacI，SapI，SbfI，SfiI，SphI。實(shí)施例2，實(shí)施例1所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法，包括如下步驟：步驟（一）：將M.CviPI基因克隆至質(zhì)粒載體pACYC184上，得到M.CviPI組成型質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化宿主菌，篩選獲得被甲基化保護(hù)的陽性重組菌株；步驟（二）：將所述限制性內(nèi)切酶C的基因克隆至質(zhì)粒載體pET-28b上，得到限制性內(nèi)切酶C重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化步驟（一）得到的已被甲基化保護(hù)的陽性重組菌，篩選穩(wěn)定、可誘導(dǎo)、高表達(dá)的限制性內(nèi)切酶C的重組表達(dá)菌株。實(shí)施例3，實(shí)施例2所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法中，所述的宿主菌為原核宿主細(xì)胞。實(shí)施例4，實(shí)施例2或3所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法中，所述的宿主菌為大腸桿菌。實(shí)施例5，實(shí)施例2所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法中，步驟（一）和步驟（二）分別包括：步驟（一）：設(shè)計(jì)引物，根據(jù)設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增M.CviPI基因，M.CviPI的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、酶切后連接至質(zhì)粒載體pACYC184上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，經(jīng)測序獲得M.SssI的組成型質(zhì)粒pACYC184-M.CviPI，將pACYC184-M.CviPI轉(zhuǎn)化大腸桿菌ER2566感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于含氯霉素的LB平板上篩選克隆，獲得M.CviPI組成型表達(dá)菌株ER2566-M.CviPI；步驟（二）：（1）限制性內(nèi)切酶C重組表達(dá)菌株的構(gòu)建設(shè)計(jì)引物，根據(jù)設(shè)計(jì)的引物PCR擴(kuò)增限制性內(nèi)切酶C基因，限制性內(nèi)切酶C的PCR產(chǎn)物經(jīng)純化、酶切后連接至質(zhì)粒載體pET-28b上，限制性內(nèi)切酶C基因的插入部位處于T7啟動(dòng)子后，經(jīng)測序獲得限制性內(nèi)切酶C的重組質(zhì)粒pET-C，將pET-C轉(zhuǎn)化至ER2566-M.CviPI感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于含氯霉素及卡那霉素的LB平板上篩選克隆，獲得限制性內(nèi)切酶C的重組表達(dá)菌株ER2566-M.CviPI-C；（2）限制性內(nèi)切酶C的誘導(dǎo)表達(dá)將ER2566-M.CviPI-C涂布于含氯霉素及卡那霉素的LB平板上，培養(yǎng)并挑取單菌落接種于含氯霉素及卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，搖動(dòng)培養(yǎng)一段時(shí)間，加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)限制性內(nèi)切酶C；（3）限制性內(nèi)切酶C的純化（a）取經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的ER2566-M.CviPI-C菌培養(yǎng)液，離心收集菌體；（b）菌體以Ni柱結(jié)合緩沖液重懸后破碎處理，離心取上清粗蛋白溶液過Ni親和層析純化柱，分步收集，將純度和濃度較高的收集樣混合、透析；（c）取步驟（b）中透析后的收集樣過陰離子交換層析柱，梯度洗脫，分步收集，將純度和濃度較高的收集樣混合、透析、貯存。實(shí)施例6，實(shí)施例5所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法的步驟（一）中：設(shè)計(jì)引物時(shí)，根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫上小球藻病毒NYs-1型的M.CviPI基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，在上游引物5’端引入大腸桿菌組成型表達(dá)啟動(dòng)子E.colipltlpromoter序列，在下游引物5’端引入大腸桿菌終止子E.colirrnBT1terminator的反向互補(bǔ)序列，在上、下游引物的5’端還分別引入HindIII酶切識(shí)別序列和保護(hù)堿基。實(shí)施例7，實(shí)施例5或6所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法的步驟（一）中：所述的氯霉素的濃度為17.5μg/mL。實(shí)施例8，實(shí)施例5或6所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法的步驟（一）中：所述的氯霉素的濃度為35μg/mL。實(shí)施例9，實(shí)施例5或6所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法的步驟（一）中：所述的氯霉素的濃度為70μg/mL。實(shí)施例10，實(shí)施例5—9任何一項(xiàng)所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法的步驟（二）中，構(gòu)建限制性內(nèi)切酶C重組表達(dá)菌株時(shí)，所述的氯霉素和卡那霉素的濃度分別為17.5μg/mL、37.5μg/mL。實(shí)施例11，實(shí)施例5—9任何一項(xiàng)所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法的步驟（二）中，構(gòu)建限制性內(nèi)切酶C重組表達(dá)菌株時(shí)，所述的氯霉素和卡那霉素的濃度分別為70μg/mL、150μg/mL。實(shí)施例12，實(shí)施例5—9任何一項(xiàng)所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法的步驟（二）中，構(gòu)建限制性內(nèi)切酶C重組表達(dá)菌株時(shí)，所述的氯霉素和卡那霉素的濃度分別為35μg/mL、75μg/mL。實(shí)施例13，實(shí)施例5—12任何一項(xiàng)所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法的步驟（二）中，誘導(dǎo)表達(dá)限制性內(nèi)切酶C時(shí)，將ER2566-M.CviPI-C接種于含17.5μg/mL氯霉素和37.5μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并挑取單菌落，再按5%的接種量接種于含17.5μg/mL氯霉素和37.5μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，于37℃搖動(dòng)培養(yǎng)，至菌密度達(dá)到3×108/mL時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.2mM，并在15℃以200rpm搖動(dòng)培養(yǎng)12h，誘導(dǎo)表達(dá)限制性內(nèi)切酶C。實(shí)施例14，實(shí)施例5—12任何一項(xiàng)所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法的步驟（二）中，誘導(dǎo)表達(dá)限制性內(nèi)切酶C時(shí)，將ER2566-M.CviPI-C接種于含35μg/mL氯霉素和75μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并挑取單菌落，再按2%的接種量接種于含35μg/mL氯霉素和75μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，于37℃搖動(dòng)培養(yǎng)，至菌密度達(dá)到3.5×108/mL時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5mM，并在16℃以250rpm搖動(dòng)培養(yǎng)16h，誘導(dǎo)表達(dá)限制性內(nèi)切酶C。實(shí)施例15，實(shí)施例5—12任何一項(xiàng)所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法的步驟（二）中，誘導(dǎo)表達(dá)限制性內(nèi)切酶C時(shí)，將ER2566-M.CviPI-C接種于含70μg/mL氯霉素和150μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并挑取單菌落，再按3%的接種量接種于含70μg/mL氯霉素和150μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，于37℃搖動(dòng)培養(yǎng)，至菌密度達(dá)到4×108/mL時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.3mM，并在18℃以230rpm搖動(dòng)培養(yǎng)18h，誘導(dǎo)表達(dá)限制性內(nèi)切酶C。實(shí)施例16，實(shí)施例5—15任何一項(xiàng)所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法的步驟（二）中，純化限制性內(nèi)切酶C時(shí)：（a）取經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的ER2566-M.CviPI-C培養(yǎng)液，以4000g離心10min收集菌體；（b）菌體由Ni柱結(jié)合緩沖液重懸后用細(xì)胞高壓破碎儀破碎處理，43000g低溫離心30min棄去沉淀，得到上清粗蛋白溶液，上清粗蛋白溶液過Ni親和層析純化柱，分步收集，將純度和濃度較高的收集樣混合、透析；所述的Ni柱結(jié)合緩沖液的組成如下：10mMTris-HClpH7.4，250mMNaCl，5%甘油，5mM咪唑；其中，在Ni親和層析過程中使用的緩沖液及其組成分別為：平衡緩沖液：10mMTris-HClpH7.4，250mMNaCl，5%甘油，5mM咪唑；漂洗緩沖液：10mMTris-HClpH7.4，250mMNaCl，5%甘油，20mM咪唑；洗脫緩沖液：10mMTris-HClpH7.4，250mMNaCl，5%甘油，400mM咪唑；（c）在陰離子交換層析過程中使用的緩沖液和梯度洗脫液分別為：平衡緩沖液：10mMTris-HClpH7.4，250mMNaCl，5%甘油，1mMDTT，0.1mMEDTA；梯度洗脫液包括：10mMTris-HClpH7.4，250mMNaCl，5%甘油，1mMDTT，0.1mMEDTA；10mMTris-HClpH7.4，300mMNaCl，5%甘油，1mMDTT，0.1mMEDTA；10mMTris-HClpH7.4，500mMNaCl，5%甘油，1mMDTT，0.1mMEDTA；10mMTris-HClpH7.4，700mMNaCl，5%甘油，1mMDTT，0.1mMEDTA；10mMTris-HClpH7.4，1MNaCl，5%甘油，1mMDTT，0.1mMEDTA。實(shí)施例17，實(shí)驗(yàn)例，本實(shí)施例以限制性內(nèi)切酶PstI為例來描述本發(fā)明所述的利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法。1、材料1.1菌株與質(zhì)粒小球藻病毒NYs-1型（ChlorellavirusNYs-1）、普羅威登菌164（Providenciastuartii164）菌株和大腸桿菌ER2566：購自美國菌種保藏中心（ATCC）；pET-28b、pACYC184和pUC19購自武漢淼靈生物有限公司；λDNA和共同片段（Commonfragment）（大小為864bp的DNA片段，核苷酸序列見SEQIDNO.1)：由江蘇愚公生命科技有限公司提供；1.2儀器與試劑細(xì)胞高壓破碎儀：購自廣州聚能納米生物科技股份有限公司；蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn)和核酸分子量標(biāo)準(zhǔn)：購自金斯瑞生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、KOD高保真DNA聚合酶、T4DNA連接酶和1×CutOneBuffer（51mM乙酸鉀（PotassiumAcetate）、22mM三（羥甲基）氨基甲烷-乙酸（Tris-Acetate）、10mM鎂離子（Magnesium）、0.1mg/mLBSA、pH8.0@25°C）：由江蘇愚公生命科技有限公司提供；Ni親和層析純化柱（ToyopearlAF-Chelate-650M）和陰離子交換層析柱（ToyopearlGigaCapQ-650M）：購自日本TosohCorporation；B-PER細(xì)菌蛋白提試劑：購自賽默飛世爾科技公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純。2、M.CviPI組成型質(zhì)粒的構(gòu)建2.1M.CviPI目的基因的PCR擴(kuò)增根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫上菌株小球藻病毒NYs-1型的M.CviPI基因序列（GenBank：AAC64006）設(shè)計(jì)一對(duì)引物，在上游引物5’端引入大腸桿菌組成型表達(dá)啟動(dòng)子E.colipltlpromoter序列，在下游引物5’端引入大腸桿菌終止子E.colirrnBT1terminator的反向互補(bǔ)序列，在上、下游引物的5’端還分別引入HindIII酶切識(shí)別序列和保護(hù)堿基：M.CviPI-F：5’-CGATAAGCTTTAATCATCGGCTCGTATAATGTGTGGAATTGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGACCATGACCCTGAAAGCCCTGGA-3’（下劃線部分為HindIII識(shí)別序列）；M.CviPI-R：5’-ATTAAAGCTTGGCGGATTTGTCCTACTCAGGAGAGCGTTCACCGACAAACAACAGATAAAACGAAAGGCCCAGTCTTTCGACTGAGCCTTTCGTTTTATTTGATGCCTTTAATACTCCAGCAGATTGCCCA-3’（下劃線部分為HindIII識(shí)別序列）。人工合成M.CviPI基因序列，作為PCR模板，用上述引物PCR擴(kuò)增M.CviPI基因，PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用了KOD高保真DNA聚合酶。2.2構(gòu)建M.CviPI組成型表達(dá)質(zhì)粒M.CviPI的PCR產(chǎn)物純化后經(jīng)HindIII酶切，酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接至由HindIII酶切后的pACYC184載體上，連接產(chǎn)物通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化進(jìn)入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)以及堿裂解法抽提質(zhì)粒，測序得M.CviPI組成型表達(dá)質(zhì)粒pACYC184-M.CviPI（見附圖1）。3、M.CviPI組成型表達(dá)菌株的構(gòu)建將pACYC184-M.CviPI以化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化至大腸桿菌ER2566感受態(tài)細(xì)胞中，涂布于含35μg/mL氯霉素的LB平板上篩選克隆，獲得M.CviPI組成型表達(dá)菌株ER2566-M.CviPI。4、PstI重組表達(dá)菌株的構(gòu)建4.1PstI基因的PCR擴(kuò)增根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫上普羅威登菌164菌株的PstI基因序列（GenBank：P00640）設(shè)計(jì)一對(duì)引物，在上游引物的5’端引入BamHI酶切識(shí)別序列和保護(hù)堿基，在下游引物的5’端引入XhoI酶切識(shí)別序列和保護(hù)堿基，上游引物設(shè)計(jì)為PstI基因的表達(dá)框與載體上的N-端6×His純化標(biāo)簽的表達(dá)框一致：PstI-F：5’-CCGCGGATCCATGAAGGAACTGAAGCTGAA-3’（下劃線部分為BamHI識(shí)別序列）；PstI-R：5’-TATGCTCGAGTTAGCTCAGTTCCGGTTTTTTAT-3’（下劃線部分為XhoI識(shí)別序列）。將菌株普羅威登菌164平板培養(yǎng)菌落以去離子水重懸后，95℃溫育10min，作為PCR模板，用上述引物PCR擴(kuò)增PstI基因，PCR擴(kuò)增反應(yīng)使用了KOD高保真DNA聚合酶。4.2表達(dá)PstI的重組菌的構(gòu)建PstI的PCR產(chǎn)物純化后用BamHI和XhoI雙酶切，酶切產(chǎn)物用T4連接酶連接至由BamHI和XhoI雙酶切后的pET-28b載體上，PstI基因DNA的插入部位處于T7啟動(dòng)子后，經(jīng)測序獲得PstI重組質(zhì)粒pET-PstI（見附圖2）。通過化學(xué)轉(zhuǎn)化法將pET-PstI轉(zhuǎn)化至ER2566-M.CviPI感受態(tài)細(xì)胞后，涂布于含35μg/mL氯霉素和75μg/mL卡那霉素的LB平板上篩選克隆，獲得PstI的重組表達(dá)菌株ER2566-M.CviPI-PstI，ER2566-M.CviPI-PstI中含有pACYC184-M.CviPI和pET-PstI。5、PstI的誘導(dǎo)表達(dá)將ER2566-M.CviPI-PstI接種于含35μg/mL氯霉素和75μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)并挑取單菌落，再按2%的接種量接種于含35μg/mL氯霉素和75μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)液中，于37℃搖動(dòng)培養(yǎng)，至菌密度達(dá)到3.5×108/mL時(shí)，加入誘導(dǎo)劑IPTG至0.5mM終濃度，并在16℃下以250rpm搖動(dòng)培養(yǎng)16h，誘導(dǎo)表達(dá)PstI，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測過程如下：取1mL誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液，以4000g離心10min收集菌體，用B-PER細(xì)菌蛋白提取試劑對(duì)菌體總蛋白進(jìn)行提取，取1-3μL細(xì)菌蛋白粗提液，在1×CutOneBuffer緩沖條件下、10μL反應(yīng)體系中，與底物λDNA在37℃溫育15min，然后使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測λDNA被細(xì)菌蛋白粗提液消化的情況（見附圖3）。由結(jié)果可知，細(xì)菌蛋白粗提液具有限制酶PstI的活性，限制酶PstI的重組表達(dá)成功。6、PstI的純化取適量經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的ER2566-M.CviPI-PstI菌培養(yǎng)液，培養(yǎng)液以4000g離心10min收集菌體。菌體以Ni柱結(jié)合緩沖液（10mMTris-HClpH7.4，250mMNaCl，5%甘油，5mM咪唑）充分重懸后，以細(xì)胞高壓破碎儀破碎，再以43000g，4℃離心30min取含有限制酶PstI的上清可溶組分過Ni親和層析純化柱，分步收集，將單管收集的洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測（見附圖4）。其中，Ni親和層析過程中使用的緩沖液包括：平衡緩沖液（10mMTris-HClpH7.4@25℃，250mMNaCl，5%甘油，5mM咪唑）、漂洗緩沖液（10mMTris-HClpH7.4@25℃，250mMNaCl，5%甘油，20mM咪唑）和洗脫緩沖液（10mMTris-HClpH7.4@25℃，250mMNaCl，5%甘油，400mM咪唑）。結(jié)果表明，泳道4的蛋白量要普遍高于其他泳道，選取這幾管混合、透析，過陰離子交換層析柱進(jìn)行進(jìn)一步純化，梯度洗脫，分步收集，對(duì)不同濃度洗脫液洗脫到的樣液進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測（見附圖5）。其中，陰離子交換層析過程中使用的緩沖液包括：平衡緩沖液（10mMTris-HClpH7.4@25℃，250mMNaCl，5%甘油，1mMDTT，0.1MmEDTA）和梯度洗脫液（10mMTris-HClpH7.4@25℃，5%甘油，1mMDTT，0.1MmEDTA及NaCl，其中，NaCl的濃度自250mM→300mM→500mM→700mM→1M，呈梯度變化）。由結(jié)果可知，通過含250mMNaCl和300mMNaCl的洗脫液洗脫得到的樣液中蛋白含量和純度要高于其他濃度洗脫得到的樣液，將這兩種濃度的洗脫液洗脫下的樣液合并后，透析至貯存緩沖液（10mMTris-HClpH7.4@25℃，250mMNaCl，50%甘油，1mMDTT，0.1mMEDTA），并添加BSA至終濃度0.2mg/mL，保存于-20℃，得到PstI原液，同時(shí)，整個(gè)純化過程在4℃或冰浴上進(jìn)行。7、PstI的酶活性檢測限制性內(nèi)切酶PstI的酶活定義為：37℃下，在20μL反應(yīng)體系中，1μL酶能夠在15min內(nèi)完全消化1μgλDNA。對(duì)PstI原液進(jìn)行梯度稀釋后，在1×CutOneBuffer緩沖條件下、20μL反應(yīng)體系中，與底物λDNA在37℃溫育15min，然后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測λDNA的酶切情況（見附圖6）。由結(jié)果可知，根據(jù)本發(fā)明方法純化獲得的限制性內(nèi)切酶PstI具有良好的酶切活力，比活力為640000U/mg，產(chǎn)率為1360000U/L誘導(dǎo)菌液。8、限制性內(nèi)切酶PstI的質(zhì)量檢測8.1星號(hào)活性/非特異性DNA酶污染檢測對(duì)PstI原液進(jìn)行梯度稀釋后，在1×CutOneBuffer緩沖條件下、20μL反應(yīng)體系中，與λDNA在37℃溫育15min、60min及16h，然后以1%瓊脂糖凝膠電泳檢測λDNA的酶切情況（見附圖7）。結(jié)果顯示，超過量酶切、超長時(shí)間酶切均未觀察到底物λDNA產(chǎn)生非特異性降解條帶，說明測試的酶中不存在非特異性的DNA酶，表明根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例生產(chǎn)的酶合格。8.2酶切-連接-再酶切檢測20倍酶量的PstI在1×CutOneBuffer緩沖條件下、20μL反應(yīng)體系中，與底物Commonfragment（見SEQIDNO.1）在37℃溫育15min獲得酶切片段，將這些片段用T4DNA連接酶連接，所得連接產(chǎn)物超過95%可以被限制性內(nèi)切酶PstI再次切開，再酶切結(jié)果中無雜帶、無拖尾，表明本發(fā)明實(shí)施例所提純的PstI完全達(dá)到了限制性內(nèi)切酶的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)要求（見附圖8），8.3藍(lán)白斑篩選鑒定使用10倍酶量的PstI線性化pUC19載體后，連接并轉(zhuǎn)化該載體進(jìn)入表達(dá)LacZbetafragment的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，并涂X-Gal/IPTG/Amp平板，結(jié)果見表1。在藍(lán)白斑鑒定中，本發(fā)明實(shí)施例生產(chǎn)的限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的白斑（白色菌落）比例僅為0.1%，結(jié)果合格。表1.藍(lán)白斑篩選鑒定數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表編號(hào)酶量白斑數(shù)總斑數(shù)白斑比例藍(lán)斑背景18U289540.028%3288216U695380.063%1212SEQUENCELISTING<110>江蘇愚公生命科技有限公司<120>利用甲基化酶的保護(hù)高效重組表達(dá)限制性內(nèi)切酶的方法<130>1<160>1<170>PatentInversion3.5<210>1<211>894<212>DNA<213>人工序列<400>1ggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgtt60atcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccg120cagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcccaatacg180caaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcc240cgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtgagttagctcactcattaggc300accccaggctttacactttatgcttccggctcgtatgttgtgtggaattgtgagcggata360acaatttcacacaggaaacagctatgaccatgattacgccaagcttgcatgcgcggccgc420tgcaggctagcgtcgactctagagatatcccatggggatccccgggtacccatatggagc480tcctcgaggaattctcactggccgtcgttttacaacgtcgtgactgggaaaaccctggcg540ttacccaacttaatcgccttgcagcacatccccctttcgccagctggcgtaatagcgaag600aggcccgcaccgatcgcccttcccaacagttgcgcagcctgaatggcgaatggcgcctga660tgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatttggtgcactctca720gtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagccccgacacccgccaacacccgctg780acgcgccctgaccaggtcgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtga840ccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcg894當(dāng)前第1頁1 2 3