本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體是涉及松墨天牛dynamin-1-like蛋白基因編碼全序列及其克隆方法。該基因編碼dynamin-1-like蛋白，該蛋白是研究線粒體分裂與囊泡運(yùn)輸?shù)闹匾牧希哂兄匾纳韺W(xué)及醫(yī)學(xué)意義。

技術(shù)背景

dynamin-1-like蛋白基因(DLP1)是Dynamin超基因家族成員之一，屬于GTP酶類，大部分是在真核生物中發(fā)現(xiàn)，但在酵母菌、秀麗隱桿線蟲(chóng)也發(fā)現(xiàn)了與之同源的蛋白。主要被定位在線粒體中，與細(xì)胞膜重構(gòu)有關(guān)，可能參與細(xì)胞內(nèi)吞作用的囊泡運(yùn)輸，也可能對(duì)線粒體形態(tài)穩(wěn)固及分裂后期有關(guān)，可能參與過(guò)氧化物酶體的分裂后期。研究表明人類的DLP1還是研究阿茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)、癲癇的重要材料，所以對(duì)DLP1的研究具有重要的生理學(xué)及醫(yī)學(xué)意義。

松墨天牛(Monochamus alternatus)屬于鞘翅目(Goleoptera)天牛科(Cerambycidae)墨天牛屬(Monochamus)。松墨天牛是一種主要危害馬尾松等針葉樹(shù)種木質(zhì)部與韌皮部的蟲(chóng)種，它是林業(yè)上重要的蛀干害蟲(chóng)，嚴(yán)重影響針葉樹(shù)種的正常生長(zhǎng)，同時(shí)其成蟲(chóng)也是松材線蟲(chóng)病(Pinewoodnematode)傳播的主要媒介。近幾十年來(lái)，該蟲(chóng)廣泛擴(kuò)散全國(guó)，速度很快，造成的經(jīng)濟(jì)損失也比較嚴(yán)重。鑒于松墨天牛DLP1基因目前無(wú)人研究，本發(fā)明填補(bǔ)了這一空白，對(duì)深入研究松墨天牛線粒體分裂、囊泡運(yùn)輸及預(yù)防松材線蟲(chóng)病的傳播奠定了基礎(chǔ)、甚至可以為人類一些重大疾病的預(yù)防和治療提供新思路，具有重要生理學(xué)及醫(yī)學(xué)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供松墨天牛DLP1基因編碼序列及其克隆方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案：

1、總RNA的提取

將外地采集的松墨天?；畛上x(chóng)經(jīng)清洗、消毒、麻醉、液氮冷凍后保存在無(wú)菌去酶的EP管中，并置于-70℃低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩２捎肊.Z.N.A.^TMTotal RNA Kit II總RNA提取試劑盒來(lái)提取松墨天牛的總RNA。

2、引物設(shè)計(jì)和3′RACE擴(kuò)增

在本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的cDNA文庫(kù)中，查找并獲得了松墨天牛DLP1基因編碼5′端序列， 本發(fā)明是在此基礎(chǔ)之上進(jìn)行3′RACE擴(kuò)增，目的在于獲得松墨天牛DLP1基因編碼全序列。

3′RACE擴(kuò)增的特異性引物為：

Ma-DLP1-3′-Outer：CAGCATTGTGGAAGTGAAG

Ma-DLP1-3′-Inner：CGCAGACTACCTACTACTAATG

3、目的基因克隆及測(cè)序

獲得的PCR產(chǎn)物通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，回收相應(yīng)目的DNA片段，同pMD20-T載體進(jìn)行連接，將連接后的產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到E.coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞之中，然后進(jìn)行AMP抗性藍(lán)白斑的篩選，挑取合適的陽(yáng)性菌落進(jìn)行質(zhì)粒提取。最后經(jīng)由菌落PCR鑒定后進(jìn)行測(cè)序。

4、序列拼接

將測(cè)序正確的序列與實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的松墨天牛cDNA文庫(kù)中的DLP1基因序列進(jìn)行不重復(fù)拼接，從而獲得松墨天牛DLP1基因編碼全長(zhǎng)序列。

松墨天牛DLP1基因編碼全長(zhǎng)序列，此序列如下：

此序列中劃線處標(biāo)示的atg為初始密碼子，劃線處標(biāo)示的taa為終止密碼子。

根據(jù)松墨天牛DLP1基因編碼全序列，得到其氨基酸序列。該序列如下：

本發(fā)明獲得了松墨天牛DLP1基因編碼全序列，補(bǔ)充了松墨天牛GTP酶類的基因。同時(shí)，人類的DLP1基因是研究阿茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)、癲癇的重要材料，獲得松墨天牛DLP1基因編碼全長(zhǎng)序列能為新型AD及癲癇疫苗的研發(fā)以及治療奠定一定的基礎(chǔ)。通過(guò)對(duì)松墨天牛成蟲(chóng)的預(yù)處理、總RNA的提取、3′RACE擴(kuò)增、目的基因片段的克隆及其序列的拼接，得到了松墨天牛DLP1基因編碼全長(zhǎng)序列，該編碼全長(zhǎng)序列2133bp，共編碼710個(gè)氨基酸。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例將本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。

1、松墨天?？俁NA提取

松墨天牛成蟲(chóng)采自廣州市從化馬尾松林。經(jīng)清洗、消毒、麻醉、液氮冷凍后保存在 無(wú)菌去酶的EP管中，并置于-70℃低溫冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

采用E.Z.N.A.^TMTotal RNA Kit II總RNA提取試劑盒進(jìn)行松墨天牛總RNA的提取，具體步驟如下：

1)將松墨天牛成蟲(chóng)進(jìn)行研磨粉碎處理后，稱取0.1g樣品在研缽(液氮預(yù)冷)中研磨成粉末狀，然后輕輕放入1.5mLRNase-free離心管中。待液氮蒸發(fā)完后迅速加入1mL RNA-Solv Reagent至離心管中，室溫靜置4min。

2)往離心管里加入200μL氯仿，上下劇烈顛倒震蕩20s后置于冰上孵化10min。

3)在4℃條件下，12000r/min離心15min，出現(xiàn)上層澄清水相。

4)上層澄清水相的80％轉(zhuǎn)移到新的收集管中，加入1/3的無(wú)水乙醇，渦旋15s。

5)將上述全部混合液轉(zhuǎn)移至2mL collecting tube(帶吸附柱)中，在室溫下10000r/min離心1min，然后棄廢液。

6)重復(fù)前述步驟：室溫條件下10000r/min離心1min，然后棄廢液。

7)將吸附柱再次放入新的2mL collection tube中，往里加入300μL RNA wash Buffer1，在室溫條件下10000r/min離心1min，然后棄廢液。

8)繼續(xù)往吸附柱里加入400μL RNA wash Buffer1，在室溫條件下10000r/min離心1min，然后棄廢液。

9)繼續(xù)往吸附柱里加入500μL RNA wash Buffer2，在室溫條件下10000r/min離心1min，然后棄廢液。

10)重復(fù)前述步驟：往吸附柱里加入500μL RNA wash Buffer2，在室溫條件下10000r/min離心1min，然后棄廢液。再次室溫條件下13000r/min，離心2min。

洗脫RNA，將吸附柱轉(zhuǎn)移到新的1.5μLRNase-free離心管中，往里加40μL DEPC。在室溫條件下13000r/min，離心2min，所得溶液即所需提取的總RNA。

注意事項(xiàng)：上述RNA實(shí)驗(yàn)所涉及的試劑，須進(jìn)行干熱滅菌(180℃，60min)處理，涉及到的一次性塑料容器、無(wú)菌水須進(jìn)行高溫高壓滅菌處理。有關(guān)RNA實(shí)驗(yàn)使用所涉及到的試劑盒及無(wú)菌水都應(yīng)該專用，須避免混用之后所引起的交叉污染。

2、cDNA 3′末端擴(kuò)增

參照3′Full RACE Core Set Ver.2.0kit試劑盒進(jìn)行，具體操作步驟如下：

1)反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

反應(yīng)體系如下：

PCR反應(yīng)程序條件：42℃下反應(yīng)60min，70℃下反應(yīng)15min。

2)巢式PCR擴(kuò)增

a)Outer PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系如下：

PCR反應(yīng)程序條件：94℃下預(yù)變性4min，94℃下變性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min，設(shè)置20個(gè)循環(huán)，然后72℃下延伸10min。

b)Inner PCR擴(kuò)增

反應(yīng)體系如下：

PCR反應(yīng)程序條件：94℃下預(yù)變性4min，94℃下變性30s，55℃下退火30s，72℃下延伸1min，設(shè)置30個(gè)循環(huán)，然后72℃延伸10min。獲得的PCR產(chǎn)物用2.0％瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其擴(kuò)增的效果。

3、目的基因克隆及測(cè)序

1)從瓊脂糖凝膠中回收DNA片段

a)柱平衡：先將吸附柱輕輕放進(jìn)收集管中，往吸附柱CB2上方中緩慢加入500μL的平衡液BL，在室溫條件下，12000r/min離心1min，然后棄掉收集管里的廢液，將吸附柱再次緩慢放回到收集管中。

b)將瓊脂糖凝膠上的目的DNA單一條帶切下(盡可能地切掉多余的部分)，放入到事先已稱好重量的干凈離心管中，并再次稱取其重量。

c)向上述放有膠塊的離心管中加入與膠塊等倍體積的溶液PC(如果膠塊重量為100mg，其等倍體積可看作是100μL，那么需要加入PC溶液的體積是100μL)，55℃金屬浴放置15min左右，在這期間須不間斷地上下緩慢翻轉(zhuǎn)離心管，直到離心管里的膠塊完全溶解。

d)將上述所得溶液緩慢加入到吸附柱CB2中(吸附柱預(yù)先放進(jìn)收集管中)，在室溫條件下，12000r/min離心1min，然后棄掉收集管里的廢液，將吸附柱再次緩慢放回到收集管中。

e)往吸附柱CB2里加入漂洗液PW(已加無(wú)水乙醇)600μL，靜置5min后進(jìn)行離心。在室溫條件下，12000r/min離心1min，然后棄掉收集管里的廢液，將吸附柱CB2再次緩慢放回到收集管中。

f)往吸附柱CB2里再次加入漂洗液PW(已加無(wú)水乙醇)600μL，在室溫條件下，12000r/min離心1min，然后棄掉收集管里的廢液。

g)將吸附柱CB2再次放回到收集管里，在室溫條件下，12000r/min離心2min，盡 可能地去掉漂洗液。然后將吸附柱放置在室溫條件5分鐘左右，直至徹底晾干。

h)將吸附柱CB2再一次放回到收集管里，往其吸附膜的中間處懸空滴入適量的洗脫緩沖溶液EB，置于室溫3min，12000r/min離心2min，所得溶液即為DNA溶液。

i)將上述DNA產(chǎn)物放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2)T載體連接

往PCR管中依次加入：pMD20-T載體1.0μL，前述目標(biāo)DNA產(chǎn)物3.0μL，去離子水1.0μL，Solution I溶液5.0μL，整個(gè)反應(yīng)體系體積為10.0μL。在4℃冰箱中放置過(guò)夜。

3)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞

a)取感受態(tài)細(xì)胞于冰水浴中融化，并分管為每管50μL。

b)每管加入4.5μL的連接產(chǎn)物，輕彈混均。置于冰水30min。

c)離心管置于42℃水浴里，熱激90s。

d)快速將離心管轉(zhuǎn)移到冰水浴中，冷卻細(xì)胞5min(此過(guò)程不要搖動(dòng)離心管)。

e)吸取900μL無(wú)菌LB培養(yǎng)基(不含抗生素)加入到離心管中，混勻。

f)在37℃條件下，150r/min搖床振蕩培養(yǎng)45min。

g)將離心管里的內(nèi)容物充分混勻，吸取100μL已轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞加到已配制好的平板培養(yǎng)基上，用彎頭玻璃棒(無(wú)菌)緩慢地將細(xì)胞均勻涂抹開(kāi)來(lái)，放于室溫直至培養(yǎng)基表面直至液體被完全吸收后，將培養(yǎng)基倒置，在37℃條件下，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12-15h。

4)陽(yáng)性重組子的鑒定及測(cè)序

a)在每個(gè)1.5mL的離心管中分別加入含氨芐的培養(yǎng)液600μL，每個(gè)平板都挑選出7個(gè)白色菌落與一個(gè)藍(lán)色菌落分別放入培養(yǎng)液中，37℃下，250r/min振蕩培養(yǎng)4h。取其菌液作為進(jìn)行菌落PCR鑒定的模板。

b)菌落PCR

反應(yīng)體系如下：

反應(yīng)程序條件為：94℃下3min；94℃下30s；55℃下30s，設(shè)置30個(gè)循環(huán)；72℃下1min；72℃下10min。反應(yīng)結(jié)束后吸取5μL的反應(yīng)產(chǎn)物，并經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。

c)將可能含有正確陽(yáng)性重組子的克隆菌液送到生工生物公司進(jìn)行測(cè)序。

4、將測(cè)序正確的序列與實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的松墨天牛cDNA文庫(kù)中的DLP1基因5′端序列進(jìn)行不重復(fù)拼接，去掉相互重疊的部分，從而獲得了松墨天牛DLP1基因編碼全長(zhǎng)序列。