本發(fā)明涉及海洋化工工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種海洋生物多糖鎳復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

金屬制劑由于其價(jià)格低廉、使用方法簡(jiǎn)單、不易產(chǎn)生抗藥性等諸多優(yōu)點(diǎn)而得到長(zhǎng)期廣泛應(yīng)用。其主要分為無(wú)機(jī)和有機(jī)兩種類(lèi)型。依靠釋放出金屬離子與病菌體內(nèi)蛋白質(zhì)中的-SH、-NH2、-COOH、-OH等基團(tuán)起作用，導(dǎo)致病菌死亡。但傳統(tǒng)金屬制劑使用不當(dāng)極易產(chǎn)生藥害等危害。因此，金屬離子的含量和釋放能力是決定金屬制劑殺菌防病效果的主要因素，同時(shí)也是決定其對(duì)作物安全性高低的重要因素。

殼聚糖是一種可再生、無(wú)毒、生物相容性和降解性良好的海洋氨基多糖。殼聚糖對(duì)多種植物病原真菌均有抑制作用，在農(nóng)業(yè)中可以作為土壤改良劑防治土傳病害，用作種衣劑防治種傳病害、果蔬保鮮控制采后病害等，將其開(kāi)發(fā)為新型海洋生物源農(nóng)藥，無(wú)疑具有廣闊的應(yīng)用前景。然而殼聚糖作為單一活性組分直接使用存在藥效較差、用量大、成本高等問(wèn)題，因而推廣困難。

煙酰胺類(lèi)席夫堿作為天然氨基酸的類(lèi)似物,其合成方法和生物活性受到科學(xué)家的廣泛關(guān)注，而其多變的結(jié)構(gòu)類(lèi)型又為不斷合成新化合物奠定了基礎(chǔ)，其鎳復(fù)合物也具有一些顯著的特性。研究發(fā)現(xiàn)其具有殺菌、催化等多種活性。我們采用活性亞結(jié)構(gòu)拼接原理，將煙酰胺類(lèi)席夫堿衍生物的生物活性基團(tuán)引入到天然產(chǎn)物殼聚糖骨架中，利用分子中的氨基絡(luò)合鎳離子，制備出抑菌和誘導(dǎo)抗病活性均提高的新型殼聚糖衍生物，為開(kāi)發(fā)新型生物農(nóng)藥的開(kāi)辟了新途徑。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種海洋生物多糖鎳復(fù)合物及其制備方法和應(yīng)用。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：一種海洋生物多糖鎳復(fù)合物，海洋生物多糖鎳復(fù)合物為O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿鎳復(fù)合物衍生物，其通式如式Ⅰ所示，

式Ⅰ中，X為吡啶基；n=4-4000。

所述式Ⅰ中，X為3-吡啶基或4-吡啶基。

一種海洋生物多糖鎳復(fù)合物的制備方法，包括以下步驟：

1）將煙酰胺類(lèi)化合物溶于溶劑A中，與乙酰丙酮在加熱回流下進(jìn)行反應(yīng)生成單季胺配體，其中煙酰胺類(lèi)化合物與溶劑A的配比為1:10-100 g/ml，煙酰胺類(lèi)化合物與乙酰丙酮的摩爾比為1:1-3；

2）將全脫乙酰殼聚糖溶于溶劑B中，與步驟1）所述的單季胺配體在酸催化劑催化下進(jìn)行反應(yīng)生成殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿衍生物，然后再與氯乙酸反應(yīng)生成O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿衍生物，其中全脫乙酰殼聚糖與溶劑B的配比為1:50-300g/ml；全脫乙酰殼聚糖與單季胺配體的質(zhì)量比為1:4-10；全脫乙酰殼聚糖與氯乙酸的質(zhì)量比為1:5-10；

3）將步驟2）所得O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿衍生物溶于水中，與四水乙酸鎳在加熱攪拌下反應(yīng)生成O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿鎳復(fù)合物衍生物，其中O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿衍生物與水的配比為1:100-300g/ml，O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿衍生物與四水乙酸鎳的質(zhì)量比為1:3-5。

所述步驟1）將煙酰胺類(lèi)化合物溶于溶劑A中，與乙酰丙酮在60-80℃回流反應(yīng)6-12h生成單季胺配體。

所述煙酰胺類(lèi)化合物為煙酰胺或異煙酰胺，所述溶劑A為甲醇和/或乙醇。

所述步驟2）將全脫乙酰殼聚糖溶于溶劑B中，與步驟1）所述的單季胺配體在60-80℃、酸催化劑催化下反應(yīng)12-18h，生成殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿衍生物，然后再與氯乙酸在60-80℃反應(yīng)6-12h，產(chǎn)物加入溶劑C沉淀，過(guò)濾，濾餅用溶劑C洗滌，在50-60℃下進(jìn)行干燥，即得O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿衍生物。

所述全脫乙酰殼聚糖分子量為130萬(wàn)，所述溶劑B為甲醇、乙醇、水中的一種或幾種，所述酸催化劑為甲酸、乙酸、丙酸中的一種或幾種。

所述步驟3）將步驟2）所得O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿衍生物溶于水中，與四水乙酸鎳在60-80℃攪拌下反應(yīng)6-12h，產(chǎn)物加入溶劑C沉淀，離心，沉淀加入溶劑C洗滌，在50-60℃下進(jìn)行干燥，即得O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿鎳復(fù)合物衍生物。

所述溶劑C為乙醇或丙酮。

一種海洋生物多糖鎳復(fù)合物的應(yīng)用，所述式Ⅰ所示O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿鎳復(fù)合物衍生物用于制備農(nóng)用殺菌劑中的應(yīng)用。

所述式Ⅰ所示O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿鎳復(fù)合物衍生物用于制備農(nóng)用殺植物病原真菌菌劑中的應(yīng)用。

本發(fā)明中煙酰胺與乙酰丙酮發(fā)生反應(yīng)生成單季胺配體，單季胺配體與全脫乙酰殼聚糖C₂位上的-NH₂發(fā)生反應(yīng)生成殼聚糖席夫堿，之后與氯乙酸發(fā)生反應(yīng)生成O-羧甲基殼聚糖衍生物，該殼聚糖衍生物上C₂位上的-N=、吡啶環(huán)所連-NH-與乙酸鎳的鎳離子配位生成O-羧甲基殼聚糖鎳復(fù)合物衍生物，所得的衍生物經(jīng)紅外光譜分析確定其結(jié)構(gòu)，殼聚糖與接入的基團(tuán)有效地結(jié)合生成O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿鎳復(fù)合物衍生物。

原理：殼聚糖結(jié)構(gòu)中含有-NH₂，可與單季胺配體發(fā)生席夫堿反應(yīng)在殼聚糖結(jié)構(gòu)中引入煙酰胺，再用殼聚糖與煙酰胺中的兩個(gè)N配位鎳離子，進(jìn)而與殼聚糖產(chǎn)生協(xié)同作用，顯著提高衍生物的生物活性。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

1、本發(fā)明殼聚糖結(jié)構(gòu)中引入煙酰胺基團(tuán)與鎳離子，三者產(chǎn)生協(xié)同增效作用，顯著提高了殼聚糖的抑菌活性。

2、本發(fā)明制備的O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿鎳復(fù)合物衍生物具有良好的溶解性，可溶于多種溶劑，在提高抑菌效果的同時(shí)還避免了重金屬離子在土壤中殘留，擴(kuò)大了其應(yīng)用領(lǐng)域，在農(nóng)藥領(lǐng)域有著潛在的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說(shuō)明

圖1為全脫乙酰殼聚糖的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：1588, 1069。

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1提供的衍生物1的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：3261,2942,1590, 1555,1411,1046。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例2提供的衍生物2的紅外光譜圖，其紅外特征吸收(cm^-1)：3272,2943,1591, 1556, 1414, 1049。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，并且本發(fā)明的保護(hù)范圍不僅局限于以下實(shí)施例。

實(shí)施例1：衍生物1的制備

將6.1g煙酰胺、5g乙酰丙酮加入到70mL無(wú)水乙醇中，回流反應(yīng)12h，將反應(yīng)產(chǎn)物旋蒸，冷乙醇洗滌，60℃干燥，即得單季胺配體。

將0.5g分子量為130萬(wàn)的全脫乙酰殼聚糖加入到25mL水中，然后在攪拌條件下滴加0.5mL乙酸，再加入20mL無(wú)水乙醇；將2g單季胺配體加入到50mL無(wú)水乙醇中，滴加到上述全脫乙酰殼聚糖溶液反應(yīng)體系中，回流反應(yīng)12小時(shí)；然后將2.5g氯乙酸加入到10mL無(wú)水乙醇中，滴加到上述反應(yīng)體系中，60℃反應(yīng)6h，冷卻至室溫，加入無(wú)水乙醇沉淀，沉淀抽濾，濾餅用無(wú)水乙醇洗滌，60℃下干燥，得淡黃色粉末，即為O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿衍生物。

取上述O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿衍生物0.5g溶于30mL水中，將1.5g四水乙酸鎳（Ni(OAc)₂·4H₂O）溶于50mL水中，60℃攪拌下將乙酸鎳水溶液滴加到O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿衍生物水溶液中，反應(yīng)6h，冷卻至室溫，加入無(wú)水乙醇沉淀，離心，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌，60℃干燥，得深綠色粉末，即為O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿鎳復(fù)合物衍生物1，結(jié)構(gòu)見(jiàn)通式I (X為3-吡啶基)。

紅外光譜表明：O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿鎳復(fù)合物衍生物1的紅外譜圖（圖2）與全脫乙酰殼聚糖的紅外譜圖（圖1）相比，位于1588cm^-1的NH的特征吸收峰減弱，表明NH₂已經(jīng)發(fā)生反應(yīng)；1590，1411cm^-1為C=N和C-N的特征吸收峰；1555cm^-1為吡啶環(huán)的特征吸收；證明衍生物1合成成功。

實(shí)施例2：衍生物2的制備

將6.1g異煙酰胺、5g乙酰丙酮加入到70mL無(wú)水乙醇中，回流反應(yīng)12h，將反應(yīng)產(chǎn)物旋蒸，冷乙醇洗滌，60℃干燥，即得單季胺配體。

將0.5g分子量為130萬(wàn)的全脫乙酰殼聚糖加入到25mL水中，然后在攪拌條件下滴加0.5mL乙酸，再加入20mL無(wú)水乙醇；將2g單季胺配體加入到50mL無(wú)水乙醇中，滴加到上述全脫乙酰殼聚糖溶液反應(yīng)體系中，回流反應(yīng)12小時(shí)；然后將2.5g氯乙酸加入到10mL無(wú)水乙醇中，滴加到上述反應(yīng)體系中，60℃反應(yīng)6h，冷卻至室溫，加入無(wú)水乙醇沉淀，沉淀抽濾，濾餅用無(wú)水乙醇洗滌，60℃下干燥，得淡黃色粉末，即為O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿衍生物。

取上述O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿衍生物0.5g溶于30mL水中，將1.5g四水乙酸鎳（Ni(OAc)₂·4H₂O）溶于50mL水中，60℃攪拌下將乙酸鎳水溶液滴加到O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿衍生物水溶液中，反應(yīng)6h，冷卻至室溫，加入無(wú)水乙醇沉淀，離心，沉淀用無(wú)水乙醇洗滌，60℃干燥，得深綠色粉末，即為O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿鎳復(fù)合物衍生物2，結(jié)構(gòu)見(jiàn)通式I (X為4-吡啶基)。

紅外光譜表明：O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿鎳復(fù)合物衍生物2的紅外譜圖（圖3）與全脫乙酰殼聚糖的紅外譜圖（圖1）相比，位于1588cm^-1的NH的特征吸收峰減弱，表明NH₂已經(jīng)發(fā)生反應(yīng)；1591，1414cm^-1為C=N和C-N的特征吸收峰；1556cm^-1為吡啶環(huán)的特征吸收；證明衍生物2合成成功。

實(shí)施例3：本發(fā)明O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿鎳復(fù)合物衍生物抑菌活性試驗(yàn)

采用生長(zhǎng)速率法測(cè)定樣品對(duì)灰葡萄孢病原菌的抑菌活性。測(cè)試在3個(gè)樣品濃度下即：100μg/mL，200μg/mL，400μg/mL對(duì)灰葡萄孢的抑制效果。

實(shí)驗(yàn)以相同濃度的好普寡糖藥劑(市售為2%的水劑)為陽(yáng)性對(duì)照，以蒸餾水為陰性對(duì)照。將含有樣品的培養(yǎng)基均勻倒入培養(yǎng)皿中，每個(gè)培養(yǎng)皿直徑為9cm，待完全凝固后，在每個(gè)培養(yǎng)皿中接種3塊直徑為5mm的菌餅。在27℃下培養(yǎng)72h后，測(cè)量菌落直徑，計(jì)算樣品的抑菌率。每次處理設(shè)置1個(gè)培養(yǎng)皿，每個(gè)培養(yǎng)皿接種3個(gè)菌落，對(duì)每個(gè)菌落測(cè)定最大直徑(D_max)和最小直徑(D_min)，取平均值為樣品抑菌圈直徑D_樣品，全部試驗(yàn)重復(fù)一次。根據(jù)下式計(jì)算抑菌率（參見(jiàn)表1）。

抑菌率(%)=(D_空白－D_樣品)/ (D_空白－5)×100

表1各樣品對(duì)灰葡萄孢的抑制活性

由上述表1中實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明O-羧甲基殼聚糖乙酰丙酮煙酰胺類(lèi)席夫堿鎳復(fù)合物衍生物對(duì)灰葡萄孢普遍具有良好的抑菌效果，顯著好于現(xiàn)在已有的好普寡糖產(chǎn)品。