本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞系的建立及鑒定方法。
背景技術(shù)：
：魚(yú)類(lèi)巨噬細(xì)胞的形態(tài)和功能與哺乳動(dòng)物的類(lèi)似，在識(shí)別、吞噬病原微生物、處理和呈遞抗原、激活淋巴細(xì)胞啟動(dòng)特異性免疫應(yīng)答以及分泌免疫因子等方面發(fā)揮重要作用。魚(yú)類(lèi)巨噬細(xì)胞的活性與功能是反映和評(píng)價(jià)魚(yú)類(lèi)集體免疫水平的重要指標(biāo)，對(duì)其活性與功能進(jìn)行測(cè)定已成為魚(yú)類(lèi)免疫學(xué)、免疫毒理學(xué)、免疫藥物篩選等研究的重要內(nèi)容。自成功從金魚(yú)前腎中分離并鑒定巨噬細(xì)胞系以來(lái)，相繼有多種魚(yú)的巨噬細(xì)胞系得以建立，并廣泛進(jìn)行了體外免疫功能指標(biāo)如吞噬活性、趨化性、產(chǎn)生活性氧及一氧化碳等研究，但大部分研究對(duì)象主要為鱸魚(yú)、鯛魚(yú)、鯰魚(yú)和鯉魚(yú)等魚(yú)類(lèi)。羅非魚(yú)是世界水產(chǎn)業(yè)重點(diǎn)培養(yǎng)淡水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)，在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中占重要地位，但目前對(duì)羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞免疫活性的相關(guān)研究較少，雖然有學(xué)者已經(jīng)成功從羅非魚(yú)頭腎和腹腔中分離巨噬細(xì)胞，但未能獲得具有單一克隆特性的能穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞系，使得相關(guān)免疫學(xué)研究停滯不前。然而，中國(guó)是羅非魚(yú)養(yǎng)殖的主要國(guó)家，近幾年羅非魚(yú)鏈球菌病卻嚴(yán)重危害著我國(guó)羅非魚(yú)養(yǎng)殖及相關(guān)產(chǎn)業(yè)，每年造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)億美元。病害的暴發(fā)與隨之而來(lái)的產(chǎn)品安全問(wèn)題已成為制約我國(guó)羅非魚(yú)產(chǎn)業(yè)發(fā)展的瓶頸。目前的藥物只能在發(fā)病早期控制病情，但耐藥和抗藥性卻不斷產(chǎn)生和積累，急需有效的疫苗防制措施。目前的研究表明羅非魚(yú)鏈球菌HSP70-肽疫苗在實(shí)驗(yàn)室獲得了較高的免疫保護(hù)率(約78.0％)，而這有賴(lài)于羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞與HSP70的相互作用，但目前尚未能闡述獲得高保護(hù)率的重要機(jī)制，這就需要首先獲得單一克隆特性的能穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞系?；诖?，本發(fā)明在分離純化羅非魚(yú)腹腔巨噬細(xì)胞的基礎(chǔ)上，利用EBV病毒感染巨噬細(xì)胞，通過(guò)篩選單克隆細(xì)胞的方法，經(jīng)傳代穩(wěn)定性、體外增殖、端粒酶活性、核型及特異性基因檢測(cè)等實(shí)驗(yàn)鑒定，獲得了能連續(xù)傳代且功能確切的永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞系。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為獲得單一克隆特性的能穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞系及為羅非魚(yú)養(yǎng)殖提供一種穩(wěn)定有效的疫苗，提供一種永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞系的建立方法和鑒定方法。為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的所使用的技術(shù)方案為：一種永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞系的建立方法，具體步驟如下：1)挑選體重為100g±5g健康尼羅羅非魚(yú)，于28-30℃水溫條件下在充氣水族箱中飼養(yǎng)，正常喂食7天后，對(duì)每尾羅非魚(yú)腹腔注射250μL角鯊烯，每隔2天注射相同劑量角鯊烯，連續(xù)注射3次，并于分離細(xì)胞前一天停止喂食；2)在注射角鯊烯第7天后，使用100mg/L的MS-222麻醉試驗(yàn)魚(yú)，75％酒精消毒體表；再用預(yù)冷的PBS沖洗腹腔，收集沖洗液于45ml離心管中，300g、4℃離心10min；吸去上清，細(xì)胞沉淀用HBSS重懸，300g、4℃離心10min洗滌1次；細(xì)胞重懸于2mlHBSS，加入9ml滅菌三蒸水作用20s破裂紅細(xì)胞，立即加入1ml10×HBSS；300g、4℃離心10min，HBSS洗滌2次，最后用L-15培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行稀釋后臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算活細(xì)胞數(shù)，瑞氏染色觀察細(xì)胞狀態(tài)；然后分別用含100IU/ml氨芐青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素、10％FBS的L-15培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度約為1×106個(gè)/ml，于12孔板中28℃培養(yǎng)24h后吸去懸浮細(xì)胞，加入新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；在不同培養(yǎng)時(shí)間，吸去培養(yǎng)上清，加入瑞氏染色液染色5-10min，PBS洗滌2次，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；3)將細(xì)胞消化后鋪至96孔板中，每孔100uL已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育30min后，向每孔加入10μLMTT溶液；將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度，得羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞；4)將B985細(xì)胞置于L15培養(yǎng)基+10％胎牛血清+1％雙抗于28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)；B958細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)至10-15ml后，停止加培養(yǎng)液至培養(yǎng)液完全變黃，得EB病毒，備用；5)收集步驟4)培養(yǎng)液，4℃、4000r/min離心30min：轉(zhuǎn)移上清至另一無(wú)菌離心管；4℃、12000r/min離心120min，棄上清，加入5mL新鮮培養(yǎng)液反復(fù)吹打重懸，4℃、3000r/min離心20min，將上清用0.22μm一次性過(guò)濾器過(guò)濾得到EBV濃縮液，以1mL/管無(wú)菌分裝后于-70℃保存；6)羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)至60％面積后，用步驟5)EBV濃縮液感染，感染3次，每次間隔2d，每次感染前將細(xì)胞置于4℃1.5-3h，向每皿加入1×108個(gè)EBV，28℃孵育10h后，換新鮮培養(yǎng)液；7)感染3次后的羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞亞克隆至96孔板，挑取單克隆細(xì)胞至24孔板中于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，選取狀態(tài)好的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)至10cm皿并于液氮容器中凍存，得EBV病毒羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞；8)將EBV病毒羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞從液氮容器中取出，立即將細(xì)胞凍存管直接浸入37℃水浴中，在1-2分鐘內(nèi)搖動(dòng)細(xì)胞凍存管至凍存的細(xì)胞完全融化，再放入水平低速離心機(jī)，600rpm/min離心5分鐘后，用75％酒精消毒細(xì)胞凍存管后，小心打開(kāi)蓋子，棄掉凍存液后使用1mL完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞重懸液接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，28℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)24小時(shí)后，更換一次10％FBS-L15完全培養(yǎng)液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞匯合度達(dá)90％時(shí)按每孔2ml接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)；9)將步驟8)細(xì)胞用胰酶或EDTA消化，傳代至3-4代后，繼續(xù)傳代培養(yǎng)，每3天進(jìn)行一次傳代，連續(xù)傳代培養(yǎng)30代，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，得永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞；10)將永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞消化后鋪至96孔板中，每孔100uL細(xì)胞懸液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育30min，向每孔加入10μLMTT溶液，將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1、3、5、7、9和11天，用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度，得永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞系。優(yōu)選的，所述步驟4)的雙抗由100U/mL青霉素和100U/mL鏈霉素組成。優(yōu)選的，所述的步驟4)停止加培養(yǎng)液時(shí)間為5-8天。優(yōu)選的，將以上建立的永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞系經(jīng)過(guò)端粒酶活性、核型和特異性基因檢測(cè)。優(yōu)選的，所述的端粒酶活性檢測(cè)使用的引物為：Forwardprimer序列:5’-ATTCCTTCGGACAGCGTAA-3’Reversedprimer序列:5’-GAGGACTTACTCTTACACTTCGCTCACC-3’。一種如以上所述的永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞系的應(yīng)用。本發(fā)明有益效果為：通過(guò)本發(fā)明方法建立的永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞系可連續(xù)傳代，迄今已傳代30代，且細(xì)胞能維持良好生長(zhǎng)狀態(tài)，可以對(duì)其進(jìn)行冷凍保存，能提供大量的來(lái)源細(xì)胞。所建立的巨噬細(xì)胞系為開(kāi)展病原特性及其致病機(jī)理研究、疫苗研制以及功能基因研究等相關(guān)領(lǐng)域的理論與應(yīng)用研究提供了便利。附圖說(shuō)明圖1是腹腔羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞分離培養(yǎng)的顯微鏡照片結(jié)果，其中A為培養(yǎng)24小時(shí)分離的腹腔羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞，m和g分別代表巨噬細(xì)胞和粒細(xì)胞。B、C、D分別代表巨噬細(xì)胞培養(yǎng)24、48和72小時(shí)的細(xì)胞形態(tài)。E和F分別是吉姆薩和瑞氏染色后的巨噬細(xì)胞形態(tài)。圖2是羅非魚(yú)腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)不同時(shí)間的增殖曲線圖。圖3是永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞不同傳代穩(wěn)定性顯微鏡照片，其中P3、P5、P10、P20和P30分別代表第3、5、10、20和30代。圖4和圖5是EBV病毒感染羅非魚(yú)腹腔巨噬細(xì)胞的PCR結(jié)果，EBV及其LAMP1基因均有陽(yáng)性擴(kuò)增。圖6是EBV病毒感染永生化羅非魚(yú)腹腔巨噬細(xì)胞SB雜交結(jié)果，樣品2和6為陽(yáng)性，其余為陰性。圖7是EBV病毒感染永生化羅非魚(yú)腹腔巨噬細(xì)胞NB雜交結(jié)果，樣品2和6為陽(yáng)性，其余為陰性。圖8是永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞染色體數(shù)目分布圖。圖9是永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞的分子鑒定結(jié)果，其中M:標(biāo)準(zhǔn)分子量；1為陰性對(duì)照；2為永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞。具體實(shí)施方式以下通過(guò)具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明和描述。1.1羅非魚(yú)的飼養(yǎng)挑選體重為(100土5)g健康尼羅羅非魚(yú)，于28-30℃水溫條件下在充氣水族箱中飼養(yǎng)，正常喂食7天后，對(duì)每尾羅非魚(yú)腹腔注射250μL角鯊烯，每隔2天注射相同劑量角鯊烯，連續(xù)注射3次，并于分離細(xì)胞前一天停止喂食。1.2腹腔巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)及體外增殖實(shí)驗(yàn)在注射角鯊烯后第7天，使用100mg/L的MS-222麻醉試驗(yàn)魚(yú)，75％酒精消毒體表。用預(yù)冷的PBS沖洗腹腔，收集沖洗液于45ml離心管中，300g、4℃離心10min。吸去上清，細(xì)胞沉淀用HBSS重懸，300g、4℃離心10min洗滌1次。細(xì)胞重懸于2mlHBSS，加入9ml滅菌三蒸水作用20s破裂紅細(xì)胞，立即加入1ml10×HBSS。300g、4℃離心10min，HBSS洗滌2次，最后用L-15培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，進(jìn)行適當(dāng)稀釋后臺(tái)盼藍(lán)染色，計(jì)算活細(xì)胞數(shù)，瑞氏染色觀察細(xì)胞狀態(tài)。然后分別用含100IU/ml氨芐青霉素、100μg/ml硫酸鏈霉素、10％FBS的L-15培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞密度約為1×106個(gè)/ml，于12孔板中28℃培養(yǎng)24h后吸去懸浮細(xì)胞，加入新培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。在培養(yǎng)24、48和72小時(shí)后，吸去培養(yǎng)上清，加入瑞氏染色液染色5-10min，PBS洗滌2次，于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，如圖1所示，細(xì)胞呈多形性，且經(jīng)瑞氏和吉姆薩染色后呈典型的單核-巨噬細(xì)胞形態(tài)特征，表明所分離培養(yǎng)的細(xì)胞為單核/巨噬細(xì)胞。利用的MTT方法對(duì)所分離培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行體外增殖測(cè)試，具體方法為：(1)將細(xì)胞消化后鋪至96孔板中，每孔100uL已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞懸液，約5000細(xì)胞。(2)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育30min。(3)向每孔加入10μLMTT溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響O.D值的讀數(shù))。(5)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1-4小時(shí)。(6)用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。如圖2所示，羅非魚(yú)腹腔巨噬細(xì)胞體外培養(yǎng)至96小時(shí)過(guò)程中均呈指數(shù)增殖狀態(tài)，至48小時(shí)后呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)趨勢(shì)，隨著時(shí)間的推移，其增長(zhǎng)速度逐漸放緩。1.3EBV病毒分離及永生化巨噬細(xì)胞系的建立1.3.1B958細(xì)胞培養(yǎng)L15培養(yǎng)基+10％胎牛血清+1％雙抗(100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素)培養(yǎng)，置于28℃培養(yǎng)箱。B958細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)至10-15ml后，停止加培養(yǎng)液(即饑餓1周左右)至培養(yǎng)液完全變黃，準(zhǔn)備抽提EB病毒。1.3.2病毒抽提收集培養(yǎng)液，4℃、4000r/min離心30min：轉(zhuǎn)移上清至另一無(wú)菌離心管。4℃、12000r/min離心120min，棄上清，加入5mL新鮮培養(yǎng)液反復(fù)吹打重懸，4℃、3000r/min離心20min，將上清用0.22μm一次性過(guò)濾器過(guò)濾得到EBV的濃縮液，以1mL/管無(wú)菌分裝后于-70℃保存。1.3.3感染羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞生長(zhǎng)至60％面積后開(kāi)始感染。感染3次，每次間隔2d.每次感染前將細(xì)胞置于4℃約1.5-3h，向每皿加入1×108個(gè)EBV，28℃孵育10h，然后換新鮮培養(yǎng)液。1.3.4羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞亞克隆及擴(kuò)大培養(yǎng)感染3次后的羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞亞克隆至96孔板，挑取單克隆細(xì)胞至24孔板中于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，選取狀態(tài)好的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)至10cm皿并于液氮容器中凍存。1.3.5永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞的培養(yǎng)、傳代穩(wěn)定性試驗(yàn)及增殖測(cè)試血清：胎牛血清培養(yǎng)基：L15(GIBCO)培養(yǎng)條件：10％FBS-L151％雙抗(100U/mL青霉素、100U/mL鏈霉素)28℃1、從液氮容器中取出細(xì)胞凍存管后，立即將細(xì)胞凍存管直接浸入37℃水浴中，在1-2分鐘內(nèi)搖動(dòng)細(xì)胞凍存管至凍存的細(xì)胞完全融化。2、將融化完全的細(xì)胞放入水平低速離心機(jī)，600rpm/min離心5分鐘。3、用75％酒精消毒細(xì)胞凍存管后，小心打開(kāi)蓋子，棄掉凍存液后使用1mL完全培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，將細(xì)胞重懸液接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，28℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。4、24小時(shí)后，更換一次10％FBS-L15完全培養(yǎng)液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。5、待細(xì)胞匯合度達(dá)90％時(shí)按每孔2ml接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中傳代培養(yǎng)。6、細(xì)胞用胰酶或EDTA消化，一般1傳3或4即可。7、將永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞按照以上條件培養(yǎng)，每3天進(jìn)行一次傳代，連續(xù)傳代培養(yǎng)30代，在顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化。將永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞可在體外穩(wěn)定傳代至少30代(每代培養(yǎng)3天)，從中選取永生化巨噬細(xì)胞的2和6號(hào)樣品進(jìn)行試驗(yàn)，非永生化巨噬細(xì)胞作為對(duì)照。如圖3所示，從第五代開(kāi)始，永生化2號(hào)和6號(hào)出現(xiàn)細(xì)胞集落，至第30代可見(jiàn)明顯細(xì)胞集落，而非永生化巨噬細(xì)胞從第5代開(kāi)始細(xì)胞集落消失。8、利用的MTT方法對(duì)所獲得的永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞進(jìn)行體外增殖測(cè)試：(1)將細(xì)胞消化后鋪至96孔板中，每孔100uL已轉(zhuǎn)染的細(xì)胞懸液，約5000細(xì)胞。(2)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱孵育30min。(3)向每孔加入10μLMTT溶液(注意不要在孔中生成氣泡，它們會(huì)影響O.D值的讀數(shù))。(5)將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育1、3、5、7、9和11天。(6)用酶標(biāo)儀測(cè)定在450nm處的吸光度。1.4永生化巨噬細(xì)胞EBV感染鑒定1.4.1RNA提取將穩(wěn)定傳代(15代)的巨噬細(xì)胞收集至EP管中，加入1mLPBS重懸細(xì)胞，1000rpm/min，離心5min，收集細(xì)胞，棄上清；EP管中加入1mLTrizolReagent(LifeTechnologies)，裂解細(xì)胞；按照Trizol提取RNA說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取。1.4.2反轉(zhuǎn)錄使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMII1stStrandcDNASynthesisKit,TakaRa)對(duì)RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，實(shí)驗(yàn)操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行.按下表向反應(yīng)管中加入各組分：短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。擴(kuò)增程序?yàn)椋?6℃30min，42℃30min，85℃5min。反應(yīng)結(jié)束后放置-20℃冰箱保存。1.4.3RT-PCR擴(kuò)增目的條帶以上述反轉(zhuǎn)錄cDNA為模板，進(jìn)行目的片段的擴(kuò)增：按下表向反應(yīng)管中加入各組分：短暫離心，使管壁上的溶液收集到管底。擴(kuò)增程序?yàn)椋悍磻?yīng)結(jié)束后瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)目的條帶，如圖4所示，EBV感染羅非魚(yú)腹腔巨噬細(xì)胞成陽(yáng)性擴(kuò)增。所用引物名稱(chēng)及引物序列如下：1.5EBV病毒Lmp1基因整合和表達(dá)鑒定1.5.1Southernbloting(SB)1.5.1.1引物設(shè)計(jì)根據(jù)基因信息設(shè)計(jì)并合成探針引物，具體引物序列如下表所示：1.5.1.2PCR擴(kuò)增探針1.5.1.2.1核酸提取羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞基因組DNA提取使用Qiagen公司的QIAampDNAminiKit的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，RNA提取按照Lifetechnologies公司Trizol試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。1.5.1.2.2核酸提取反應(yīng)體系如下表所示：成分體積(μl)10×TaqEnzymebuffer5dNTP(10mM)1Primer-F(10μM)2Primer-R(10μM)2TemplateDNA1TaqEnzyme0.5Rnase-Freewater38.5共50擴(kuò)增條件：94℃3min預(yù)變性；94℃10S、55℃30S、72℃30S共30個(gè)循環(huán)；最后72℃終延伸10min。反應(yīng)完畢后，用1％瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果，紫外燈下切取目的片段，用DNA凝膠回收試劑盒回收目的片段，步驟按回收試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。如圖5所示，EBV病毒Lmp1基因呈陽(yáng)性擴(kuò)增。1.5.1.2.3SB實(shí)驗(yàn)步驟1.5.1.2.3.1根據(jù)需要尋找合適的酶切位點(diǎn)對(duì)DNA進(jìn)行酶切選擇內(nèi)切酶EcoRI作為酶切位點(diǎn)酶切體系如下：1.5.1.2.3.2酶切后處理37℃酶切過(guò)夜后，將酶切產(chǎn)物用0.6倍體積冷凍異丙醇沉淀一小時(shí)，離心去上清，溶于40ulTE，0.9％的瓊脂糖凝膠電泳，40v過(guò)夜。電泳結(jié)束后，將凝膠依次用如下試劑處理進(jìn)行堿變性，室溫下輕輕搖動(dòng)確保溶液覆蓋凝膠0.25MHCl15min蒸餾水搖洗5min；變性液40min蒸餾水搖洗5min；中和液15min。轉(zhuǎn)膜16小時(shí)以上。1.5.1.2.3.3雜交NC膜浸入2×SSC中5min，在雜交瓶中加入雜交液。放入42℃雜交爐中，使雜交體系升到42℃。取經(jīng)超聲粉碎的DNA，100℃加熱變性5min，迅速加到雜交瓶中，使其濃度達(dá)到100μg/ml。繼續(xù)雜交4hr。倒出預(yù)雜交的雜交液，換入等量新的已升溫至42℃的雜交液，同樣加入變性的DNA。將探針100℃加熱5min，使其變性，迅速加到雜交瓶中。42℃雜交過(guò)夜。取出NC膜，在2×SSC溶液中漂洗5min，然后按照下列條件洗膜：2×SSC/0.1％SDS，42℃，10min；1×SSC/0.1％SDS，42℃，10min；0.5×SSC/0.1％SDS，42℃，10min；0.2×SSC/0.1％SDS，56℃，10min；0.1×SSC/0.1％SDS，56℃，10min。在洗膜的過(guò)程中，不斷振搖，不斷用放射性檢測(cè)儀探測(cè)膜上的放射強(qiáng)度。實(shí)踐證明，當(dāng)放射強(qiáng)度指示數(shù)值較環(huán)境背景高1-2倍時(shí)終止洗膜。將洗完的膜浸入2×SSC中2min，取出膜，用濾紙吸干膜表面的水份，并用保鮮膜包裹，將膜正面向上，放入暗盒中(加雙側(cè)增感屏)，在暗室的紅光下，每一片都用透明膠帶固定，合上暗盒，置-70℃低溫冰箱中曝光3天時(shí)間，從中選取1-6號(hào)樣品進(jìn)行試驗(yàn)如圖6所示，樣品2和6為陽(yáng)性，其余為陰性。1.5.2NB實(shí)驗(yàn)方法和步驟1.5.2.1提取RNA將穩(wěn)定傳代(15代)的巨噬細(xì)胞收集至EP管中，加入1mLPBS重懸細(xì)胞，1000rpm/min，離心5min，收集細(xì)胞，棄上清；EP管中加入1mLTrizolReagent(LifeTechnologies)，裂解細(xì)胞；按照Trizol提取RNA說(shuō)明書(shū)進(jìn)行RNA提取。1.5.2.2試劑準(zhǔn)備(a)1.2％瓊脂糖甲醛變性膠的配制：(b)上樣前RNA樣品的處理:Samplebuffermix體積:25.5μl10×MOPS5μl37％甲醇8μl去離子甲酰胺12.5μl將Samplebuffermix與RNA樣品等體積混勻，65℃，變性5min，置于冰上5min，加入上樣緩沖液，混勻后即可上樣。1.5.2.3RNA電泳：所用緩沖液為1×MOPS，120V約3h。1.5.2.4轉(zhuǎn)膜：上行毛細(xì)管轉(zhuǎn)移法。1.5.2.5染色1.5.2.6探針標(biāo)記:(Amersham公司隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒，RediprimeTMIIRandomPrimerLabellingSystem)。見(jiàn)說(shuō)明。探針序列221bp，針對(duì)Lamp基因：GAGGGAGTCATCGTGGTGGTGTTCATCACTGTGTCGTTGTCCATGGTAATACATCCAGATTAAAATCGCCAGAAACAGGAGGAGCCAAAGGAGATCAACCAATAGAGTCCACCAGTTTTGTTGTAGATAGAGAGCAATAATGAGCAGGATGAGGTCTAGGAAGAAGGCTAGGAAGAAGGCCAAAAGCTGCCAGATGGTGGCACCAAGTCGCCAGAGCATCTActin探針序列為：aagagaggtatcctgaccctcaaataccccattgagcacggtattgtgaccaactgggatgacatggagaagatctggcatcacaccttctacaatgagctccgtgttgcccctgaggagcaccctgtcgtgctcactgaggctcccctgaatcccaaagccaacagagagaagatgacacagatcatgttcgagacct1.5.2.7雜交雜交緩沖液的配制(a)預(yù)雜交：將雜交緩沖液倒入雜交管中65℃預(yù)熱15min后放入交聯(lián)固定的膜65℃預(yù)雜1～2h；(b)雜交：將標(biāo)記好的探針?lè)湃腚s交管中，65℃雜交過(guò)夜；(c)洗膜：用洗膜緩沖液2×SSC/0.2％SDS，在65℃/15min條件下洗膜2～3次；(d)壓片：將洗好的膜從雜交管中拿出，轉(zhuǎn)移至兩層塑膜中，檢測(cè)雜交信號(hào)強(qiáng)弱，將膜放入磷屏中，根據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱壓數(shù)小時(shí)或過(guò)夜；(e)檢測(cè)雜交信號(hào)：掃描磷屏。從中選取1-6號(hào)樣品進(jìn)行試驗(yàn)如圖7所示，永生化樣品2號(hào)和6號(hào)為陽(yáng)性，其余為陰性。1.6TRAP法(Telomeraserepeatamplificationprotocol)檢測(cè)端粒酶活性1)細(xì)胞培養(yǎng)將永生化的巨噬細(xì)胞鋪至六孔板中(以未染毒的細(xì)胞作為對(duì)照)，待細(xì)胞長(zhǎng)至密度約80％時(shí)收集細(xì)胞，離心后用PBS洗細(xì)胞一次；2)RNA提取細(xì)胞用細(xì)胞裂解液裂解，利用TRIZOL進(jìn)行RNA提??；3)PCR反應(yīng)體系：無(wú)菌水將體積補(bǔ)齊至10微升，混合均勻后，30℃反應(yīng)30min，94℃滅活10min；4)RealTime-PCR體系：端粒酶引物：Forwardprimer序列:5’-ATTCCTTCGGACAGCGTAA-3’Reversedprimer序列:5’-GAGGACTTACTCTTACACTTCGCTCACC-3’5)步反應(yīng)體系：混勻以后，94℃10min；94℃30s、60℃90s40個(gè)循環(huán)進(jìn)行RealTime-PCR，60℃90s收集信號(hào)。6)端粒酶活性檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的染毒克隆細(xì)胞株端粒酶活性均發(fā)生不同程度增加，表明EBV感染導(dǎo)致端粒酶活性增加，永生化細(xì)胞成功構(gòu)建。1.7永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞的核型分析1.7.1材料已獲得的永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞1.7.2方法有絲分裂中期染色體制備：無(wú)菌條件下取永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞，加入含20％胎牛血清和PHA(phytohemagglutinin，植物血球凝結(jié)素)的培養(yǎng)液，28℃培養(yǎng)4d，加秋水仙素堿至終濃度0.08ug/ml，繼續(xù)培養(yǎng)2h。用75mmol/LKCI低滲處理細(xì)胞30min，然后固定液(甲醇：冰醋酸-3：1)漂洗4次，制成染色體中期分裂相的玻片。染色體玻片用Giemsa染色0.5h。然后在顯微鏡下觀察和照相，選取1分散良好染色體清晰的中期分裂相進(jìn)行計(jì)數(shù)，再分別選擇20個(gè)染色體形態(tài)最清晰的中期分裂相拍照、放大并剪下每個(gè)染色體，然后進(jìn)行染色體測(cè)量，分類(lèi)及核型分析。1.7.3結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞染色體數(shù)目為44的占58.6％，表明該細(xì)胞染色體數(shù)目應(yīng)為44.核型分析后發(fā)現(xiàn)其核型公式如圖8所示。1.8永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞的致癌性評(píng)估1).取四株永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞，培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期；2).將細(xì)胞消化后離心收集細(xì)胞，PBS洗細(xì)胞一次；3).將細(xì)胞用100微升PBS重懸后注射裸鼠背部皮下，每株細(xì)胞注射5只裸鼠(1*106個(gè)細(xì)胞)，并設(shè)立空白對(duì)照；4).注射后3-4周觀察成瘤情況。結(jié)果表明，對(duì)所選擇的6號(hào)克隆細(xì)胞進(jìn)行裸鼠致癌性評(píng)估后發(fā)現(xiàn)，這株永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞不具有致癌性。1.9永生化羅非魚(yú)巨噬細(xì)胞的分子鑒定RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、RT-PCR、電泳等試驗(yàn)方法見(jiàn)1.4部分。所使用的羅非魚(yú)18S特異性引物如下：引物名稱(chēng)序列(5’--3’)Tila18S-1FCGCCGAGAAGACGATCAAACTila18S-1RTTCATTGATGCACGAGCCGAProduct624bp如圖9所示，用羅非魚(yú)特異性18S擴(kuò)增引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增后獲得特異性目的條帶，表明所鑒定的細(xì)胞來(lái)自于羅非魚(yú)機(jī)體。將此PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明所獲得的序列為羅非魚(yú)18S序列，表明所獲得的永生化細(xì)胞是羅非魚(yú)據(jù)巨噬細(xì)胞細(xì)胞。18S測(cè)序結(jié)果：CAAGTANGTACAGTCGTACAAGGTTTCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACTGGCTACACCGAGCGGCCCGCCTGCGGCGCACCCGGTGTTCTCCCTCTTTGCCGCCGAGGGTCTCCCGCCACCGTCACCGGTGCGGGTCTCCCGAGGTTGTCGGCTCGCGCGTCCCCCACCGGAGCTCGAGCCTTAGTCTGGGCCTGGTCACCGGCCGGACGACCCGACGGCCCCGCCCCGCCTCTACGCCAAAGCGAGCCCGCTGCCCCGACCGGCTCCTCCGAGGGCCGACGGAGGAGAGTCGGGACTGCGGCTCGTTGGAGGCGGGCGCCGGGGTCCCCGTCCGGCAACCACCGGTCCCGGCCCGCCACGAGAACCTCAACCGAAAGCGCGGGCTGGCGGTTTCGCCCTGACCGCTGCCCGCGCGCCTCCGGGTACCCAACTCTCCTCCCTCCTGCGGAGGGAGCACGGGGGGTTCAATGTCTCCTCTCCCCTGCCCCGGCGGAGGAAGGAGCGCCCGGGGGTTTTTTCCCTTCCTTTAAACCCCTTATCCCGTCTACGAATGTGGCAACCCACGGTAAAACAAAAAAACAATACGACTCTTAGCGGTGGATCACTCGGCTGGGG。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3