專利名稱：亞鐵離子診斷/測定試劑盒及亞鐵離子的濃度測定方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種亞鐵離子診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測 定亞鐵離子濃度的方法，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。
背景技術：
鐵和總鐵結合力在人體代謝過程中極為重要。鐵是人體正常生理過
程中不可缺少的物質。人體含鐵約3 5g，其中70%存在于紅細胞血紅 蛋白中；25%分布在單核巨噬細胞系統(tǒng)(即網狀內皮系統(tǒng)，肝、脾、 骨髓中鐵蛋白和含鐵血黃素)；4. 9％分布于肌紅蛋白、細胞色素、含 鐵的酶；0. 1 %為循環(huán)血漿中的鐵。
人體內的鐵來源于食物，主要在十二指腸和小腸上部被吸收。體內 鐵以鐵蛋白和含鐵血黃素形成貯存在骨髓、脾和肝臟內。有少量鐵與 血漿轉鐵蛋白結合，通過血漿輸送至各組織，被利用或被貯存。
血清鐵的測定主要是用分光光度法，其次是原子吸收法。后者由于 靈敏度不高及基底的干擾，比分光光度法可靠性差。分光光度法應用 一類含-N-C-C:N-結構的生色原，與亞鐵形成五元環(huán)，產生紫紅色。 較早使用的有聯(lián)吡啶和紅移菲羅啉；近來多推薦靈敏度較高的亞鐵嗪。 此外，尚有應用鉻天青S與高鐵的反應。

發(fā)明內容
本發(fā)明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(Enzymatic
Colorimetric Method)技術，連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶) 在340nm波長處吸光度的變化，得以測定亞鐵離子濃度的方法，同時， 本發(fā)明還將給出用以實現(xiàn)該方法的亞鐵離子診斷/測定試劑盒，采用該 試劑不僅可以在紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行亞 鐵離子濃度測定，而且測定速度快、準確度高，因而可以得到切實的 推廣應用。
本發(fā)明亞鐵離子濃度測定方法原理如下
煙酸+輔酶+水煙酸脫氫酶/F^ 6-羥基煙酸+還原型輔酶 這種方法應用需要亞鐵離子激活的煙酸脫氫酶(nicotinate dehydrogenase; nicotinic acid hydroxylase; EC 1.17.1.5)酶促反應速率 比色法。煙酸脫氫酶酶解煙酸并同時將輔酶(在340nm處沒有吸收峰) 還原成為還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)，從而得以測定還原型 輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光度上升的 速度，可以測算亞鐵離子的濃度大小。
實驗表明，從測定結果的準確性和配制成本的經濟性兩方面綜合考 慮，無論是單劑、雙劑還是三劑，如下成分關系的本發(fā)明亞鐵離子診 斷/測定試劑盒較為理想
緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
煙酸 20 mmol/L
煙酸脫氫酶 12000 U/L
本發(fā)明的亞鐵離子診斷/測定試劑盒可以是單劑，包括
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、煙酸、煙酸脫氫酶。
試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成 液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、煙酸。
試劑2
緩沖液、穩(wěn)定劑、煙酸脫氫酶。
輔酶、煙酸、煙酸脫氫酶在試劑1或試劑2中的位置可以不限。試 劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑l
緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶。
試劑2
緩沖液、煙酸。
試劑3
緩沖液、穩(wěn)定劑、煙酸脫氫酶。
輔酶、煙酸、煙酸脫氫酶在試劑l、試劑2或試劑3中的位置可以 不限。試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配 制成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定亞鐵離子濃度的方法，其
輔酶可以是NADP+ 、 NAD+或thio- NAD+中的 一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發(fā)明作進一步的說明。
實施例一
本實施例的亞鐵離子診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3 mmol/L
煙酸 20 mmol/L
煙酸脫氫酶 12000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進行冷凍干燥，制成干粉試劑； 使用前，加入純凈水，復溶后使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37。C,反應時間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測亞鐵離 子樣品與試劑的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，延 遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出亞鐵離 子的濃度大小。
實施例二
本實施例的亞鐵離子診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液100 mmol/L 穩(wěn)定劑50 mmol/L
輔酶3 mmol/L
煙酸 30 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液100mmol/L
穩(wěn)定劑50 mmol/L
煙酸脫氫酶10000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37。C,反應時間10分鐘，起始 吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測亞鐵離 子樣品與試劑1、試劑2的體積比例為2/20/5,反應方向為正反應(上 升反應)，延遲時間大約l分鐘左右，檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出亞鐵離 子的濃度大小。
實施例三
本實施例的亞鐵離子診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1
(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液
100mmol/L
穩(wěn)定劑
50 mmol/L
輔酶 3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩沖液 100mmol/L
煙酸 12 mmol/L
試劑3
(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50 mmol/L
煙酸脫氫酶 24000 U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定亞鐵離子濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37°C， 反應時間10分鐘，起始吸光度《0.1，測試主波長340nm，測試副波 長405nm，被測亞鐵離子樣品與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為 4/40/5/5，反應方向為正反應(上升反應)，延遲時間大約l分鐘左右， 檢測時間2分鐘左右。
加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應，最終將反應物置于生化 分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出亞鐵離 子的濃度大小。
申請人經過實驗驗證，采用以上發(fā)明內容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，釆用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分 析儀器得出所需的測定結果，并且靈敏度高、精確度好，便于推廣應用。
權利要求
1.一種酶比色法的亞鐵離子的濃度測定方法，其方法原理如下煙酸+輔酶+水 煙酸脫氫酶/Fe2+ 6-羥基煙酶+還原型輔酶將最終反應物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出亞鐵離子的濃度大小測定結果。
2. —種亞鐵離子診斷/測定試劑盒，主要成分包括緩沖液 20~~500 mmol/L穩(wěn)定劑50 mmol/L輔酶1-6 mmol/L煙酸1-50 mmol/L煙酸脫氫酶1000-80000 U/L其特征在于試劑盒可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用； 也可以配制成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述亞鐵離子診斷/測定試劑盒，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、煙酸、煙酸脫氫酶組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述亞鐵離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、煙酸、煙酸脫氫酶組成雙劑試劑；試劑 1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、煙酸組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、煙酸脫氫酶組成。輔酶、煙酸、煙酸脫氫酶在試劑1或試劑 2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述亞鐵離子診斷/測定試劑盒，其特征在于由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、煙酸、煙酸脫氫酶組成多劑試劑；試劑 1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶組成；試劑2，由緩沖液、煙酸組成； 試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、煙酸脫氫酶組成。輔酶、煙酸、煙酸 脫氫酶在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。 6.根據權利要求2所述亞鐵離子診斷/測定試劑盒，其特征在于還 包括穩(wěn)定劑1—4000mmol/L或0.1%-100%體積比。所述穩(wěn)定劑為 硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethyleneglycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用酶比色法技術的亞鐵離子診斷/測定試劑盒，同時本發(fā)明還涉及測定亞鐵離子濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學/食品/環(huán)境檢驗測定技術領域。本發(fā)明的試劑盒主要成分包括緩沖液、輔酶、煙酸、煙酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應，再將反應物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出亞鐵離子的濃度大小。采用本發(fā)明完全可以通過紫外/可見光分析儀器得出所需的測定結果。
文檔編號G01N33/90GK101173951SQ20061009730
公開日2008年5月7日 申請日期2006年10月30日 優(yōu)先權日2006年10月30日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司