本發(fā)明屬于食品科學與工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用外源性糖改善米渣蛋白功能特性的方法及其產(chǎn)品。

背景技術(shù)：

以大米為原料發(fā)酵生產(chǎn)乳酸、淀粉糖、檸檬酸及生化藥品等的糖化工序會產(chǎn)生大量副產(chǎn)物一米渣。米渣中蛋白質(zhì)的質(zhì)量分數(shù)高達70％(干基)，相當于純大米中蛋白質(zhì)含量的5.8倍。大米蛋白具有良好的氨基酸組成配比，消化率極高，其品質(zhì)被公認為糧食種子蛋白質(zhì)中的最佳者，是一種優(yōu)良的植物蛋白。由于米渣蛋白的低過敏性，非常適用于嬰幼兒食品。此外大米蛋白還具有重要的保健功能。近年來的研究表明，大米蛋白對抗糖尿病、抗膽固醇和抗癌變等都有一定的作用。

由于經(jīng)歷了長時間的高溫液化和淀粉酶水解，米渣中大米蛋白不再是天然的大米蛋白。溶解度大大降低并失去與之相關(guān)的某些功能性質(zhì)，限制了其在食品中的應(yīng)用。此外，在實際生產(chǎn)中，不同食品體系對蛋白質(zhì)功能特性的要求往往不同，如液態(tài)乳制品對蛋白乳化性能要求較高；肉制品對蛋白凝膠性能要求較高；而速溶豆奶粉則對分散性和溶解性能要求更高。因此為了擴大米渣的應(yīng)用范圍，獲取專用性極強的大米蛋白，必須要對米渣蛋白進行改性。

蛋白質(zhì)的接枝改性就是通過化學或生物技術(shù)對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行修飾，在側(cè)鏈上的活性基團(如-NH₂，-OH等)導入一種或多種基團。常用的修飾技術(shù)包括對氨基酸殘基的?；?、去酰胺、磷酸化、糖基化(利用美拉德反應(yīng))、烷基化、水解以及氧化等。

利用美拉德反應(yīng)對蛋白質(zhì)進行糖基化改性是一種簡單快速的方法。糖基化蛋白質(zhì)不僅在乳化性能方面得到改善，在溶解性、熱穩(wěn)定性、pH以及鹽離子穩(wěn)定性等功能特性方面都有不同程度的提高，對外界環(huán)境的變化具有較大的抵抗能力。其手段大致為：首先將蛋白質(zhì)和糖按照一定的比例溶解于選定pH值的緩沖溶液中，分散均勻后進行冷凍干燥，在50-60℃和相對濕度(用飽和KBr維持在79％的相對濕度)下進行的非酶糖基化反應(yīng)，通過降低溫度來抑制反應(yīng)的進行。

中國專利201410266430.8《一種米渣蛋白的糖基化改性方法》提供了一種米渣蛋白的糖基化改性方法，該方法在堿性條件下的溶液環(huán)境中進行美拉德反應(yīng)，旨在得到具有優(yōu)良抗氧化活性的糖基化改性后的米渣蛋白。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明提供了一種利用外源性糖改善米渣蛋白功能特性的方法及其產(chǎn)品。該方法采用美拉德反應(yīng)將物質(zhì)糖類接入米渣蛋白，提高米渣蛋白分子的乳化特性，起泡特性，pH和鹽離子穩(wěn)定性。

本發(fā)明所提供的技術(shù)方案如下：

一種利用外源性糖改善米渣蛋白功能特性的方法，包括以下步驟：

1)將米渣蛋白與糖的混合物溶解于蒸餾水中，并攪拌均勻，得到米渣蛋白與糖的混合分散液，調(diào)節(jié)混合分散液的pH至7.0，并對混合分散液冷凍干燥，得到粉末；

2)將步驟1)得到的粉末置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進行反應(yīng)，得到外源性糖的糖基化米渣蛋白。

優(yōu)選的，步驟1)中：米渣蛋白與糖的質(zhì)量比為1:1～1.5。

優(yōu)選的，步驟1)中：通過攪拌進行米渣蛋白與糖的分散，分散時間為6～12h。

優(yōu)選的，步驟1)中：混合分散液中米渣蛋白與糖的總的質(zhì)量百分數(shù)為5～10％。

具體的，步驟2)中：恒溫恒濕培養(yǎng)箱的溫度為55～65℃、相對濕度為78～80％、培養(yǎng)時間為8～16h。

具體的，步驟2)中：在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中進行美拉德反應(yīng)。

具體的，步驟1)中：選用的糖為葡萄糖。

本發(fā)明還提供了根據(jù)上述利用外源性糖改善米渣蛋白功能特性的方法制備得到的外源性糖的糖基化米渣蛋白。

本發(fā)明所提供的糖基化蛋白質(zhì)不僅在乳化性能方面得到改善，在溶解性、熱穩(wěn)定性、pH以及鹽離子穩(wěn)定性等功能特性方面都有不同程度的提高，對外界環(huán)境的變化具有較大的抵抗能力。本發(fā)明利用美拉德反應(yīng)對蛋白質(zhì)進行糖基化改性，提供了是一種簡單快速的方法。該方法工藝簡單、無環(huán)境污染、適合工業(yè)化生產(chǎn)的優(yōu)勢。得到的渣蛋白可作為液態(tài)乳制品、肉制品或速溶制品等的原料或添加劑，專用性極強。

附圖說明

圖1是外源性糖與米渣蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的乳化性與乳化穩(wěn)定性。

圖2是外源性糖與米渣蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的起泡性和起泡穩(wěn)定性。

圖3是外源性糖與米渣蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的分散液溶解性對照圖。

圖4為米渣蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖譜。

圖5為不同pH下米渣蛋白、酶法米渣蛋白改性產(chǎn)物及米渣蛋白-糖復合物的溶解性圖。

圖6為米渣蛋白、酶法米渣蛋白改性產(chǎn)物及米渣蛋白糖復合物的紅外譜圖。

圖7為放大倍數(shù)為2000倍的米渣蛋白和外源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物的掃描電鏡圖。

圖8為放大倍數(shù)為1000倍的米渣蛋白和外源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物的掃描電鏡圖。

圖9為放大倍數(shù)為500倍的米渣蛋白和外源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物的掃描電鏡圖。

具體實施方式

以下對本發(fā)明的原理和特征進行描述，所舉實施例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

實施例1

分別稱取堿法提取的米渣蛋白固體粉末10g與葡萄糖10g混合，加入300mL蒸餾水，攪拌6h形成均勻分散液。調(diào)節(jié)體系pH至7.0，將該分散液冷凍干燥。將冷凍干燥后的粉末平鋪在玻璃或塑料培養(yǎng)皿上，迅速置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱溫度為60℃，相對濕度為79％，反應(yīng)12h。本實施例改性米渣蛋白比未改性米渣蛋白相比，乳化性提高了66％，在等電點附近的溶解性提高50％，pH、鹽離子以及熱穩(wěn)定性明顯改善。

實施例2

分別稱取堿法提取的米渣蛋白固體粉末10g與葡萄糖15g混合，加入225mL蒸餾水，攪拌9h形成均勻分散液。調(diào)節(jié)體系pH至7.0，將該分散液冷凍干燥。將冷凍干燥后的粉末平鋪在玻璃或塑料培養(yǎng)皿上，迅速置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱溫度為65℃，相對濕度為80％，反應(yīng)10h。本實施例改性米渣蛋白比未改性米渣蛋白相比，乳化性提高了63％，在等電點附近的溶解性提高55％，pH、鹽離子以及熱穩(wěn)定性明顯改善。

實施例3

分別稱取堿法提取的米渣蛋白固體粉末10g與葡萄糖12g混合，加入250mL蒸餾水，攪拌12h形成均勻分散液。調(diào)節(jié)體系pH至7.0，將該分散液冷凍干燥。將冷凍干燥后的粉末平鋪在玻璃或塑料培養(yǎng)皿上，迅速置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，調(diào)節(jié)培養(yǎng)箱溫度為55℃，相對濕度為78％，反應(yīng)15h。本實施例改性米渣蛋白比未改性米渣蛋白相比，乳化性提高了65％，在等電點附近的溶解性提高52％，pH、鹽離子以及熱穩(wěn)定性明顯改善。

效果例

材料與試劑

米渣(蛋白質(zhì)70.0％；碳水化合物20.0％；水分9.7％；脂肪3.5％；)堿提米渣蛋白

儀器與設(shè)備

PHS-2C型精密酸度計 上海雷磁儀器廠

LXJ-II型離心分離機 上海醫(yī)用分析儀器廠

LG-3型冷凍干燥機寧波市生化儀器廠

81-2型恒溫磁力攪拌器 上海司樂儀器廠

WZZ-2B自動旋光儀 上海精密科學儀器有限公司

DM-WP120磨漿機 廣東恒聯(lián)食品機械有限公司

試驗方法

乳化性的測定

稱取一定量的蛋白產(chǎn)品溶于50mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值到一定值，加入50mL大豆色拉油，在高速組織搗碎機中均質(zhì)(10000～12000r/min)2min，再離心(1500r/min)5min。按下式計算乳化能力：

乳化穩(wěn)定性的測定

將上述離心管置于80℃水浴中，加熱30min后，冷卻至室溫，再離心(1500r/min)5min，測出此時的乳化層高度，則乳化穩(wěn)定性為：

起泡性和泡沫穩(wěn)定性的測定

將一定量的蛋白產(chǎn)品溶解到100mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH值到一定值，在DS-1高速組織搗碎機中均質(zhì)(10000～12000r/min)2min，記下均質(zhì)停止時泡沫體積，則起泡性為：

均質(zhì)停止30mim后，記下此時泡沫體積，則泡沫穩(wěn)定性為：

美拉德法改性米渣蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性

將采用堿法提取出來的米渣蛋白經(jīng)過美拉德反應(yīng)后，分別測定了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的乳化性和乳化穩(wěn)定性，如圖1所示，0min是指高速分散處理后立即測量的值，10min是指高速分散后放置10min測量的值。從圖1的上半部分可以看出，隨著美拉德反應(yīng)時間的增加，其乳化性呈現(xiàn)出不斷上升的趨勢；圖1的下半部分表明，隨著美拉德反應(yīng)時間的增加，其乳化穩(wěn)定性呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，且在反應(yīng)12小時以后其乳化穩(wěn)定性迅速下降。這說明采用美拉德法對堿法米渣蛋白質(zhì)進行美拉德反應(yīng)法改性后其乳化性和乳化穩(wěn)定性得到了改善。且在反應(yīng)12小時后乳化穩(wěn)定性最佳。

堿法提取出的米渣蛋白質(zhì)中不含糖類物質(zhì)，因此需要額外添加葡萄糖作為羰基供體與蛋白質(zhì)氨基發(fā)生反應(yīng)

美拉德法改性米渣蛋白的起泡性和起泡穩(wěn)定性

將采用堿法提取出來的米渣蛋白經(jīng)過美拉德反應(yīng)后，分別測定了美拉德反應(yīng)產(chǎn)物起泡性和起泡穩(wěn)定性，如圖2所示。從圖2可以看出，隨著美拉德反應(yīng)時間的增加，其起泡性和起泡穩(wěn)定性下降了。這表明蛋白的表明張力顯著減小，蛋白在在油-水界面時對水層吸附力更加顯著?？勺鳛槿轱嬃系臓I養(yǎng)添加劑而不引起較多的起泡。

美拉德法改性米渣蛋白分散液的穩(wěn)定性

對于堿法提取的米渣蛋白，蛋白在美拉德反應(yīng)之后穩(wěn)定性提高。米渣蛋白的等電點(pI)在5.0左右，此時蛋白由于正負電荷相等，靜電荷為零，蛋白由于靜電斥力減弱導致蛋白發(fā)生聚集，分散系變渾濁，而美拉德反應(yīng)之后的堿法米渣蛋白分散系在pH 5.0時比未改性的米渣蛋白澄清(圖3)。這是因為：(1)外源糖分子的接入，使得蛋白表面糖分子更多。(2)當?shù)鞍踪|(zhì)肽鏈上共價接入糖鏈后，多羥基的親水特性顯著提高了蛋白質(zhì)分子的溶解性能，并且多糖鏈引入的空間位阻效應(yīng)也減弱了肽鏈對熱的吸收從而降低蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的破壞。

圖3中：堿法提取米渣蛋白后，蛋白與葡萄糖比1:1；進行美拉德反應(yīng)A:0h；B:6h；C:12h；D:18h產(chǎn)物(反應(yīng)條件：pH 7.0，溫度60℃、濕度79％)(蛋白濃度為5mg/mL)分散液溶解性結(jié)果樣品分別調(diào)pH至3.0,5.0,7.0；每張圖片從左至右的NaCl濃度為0、10、20、30mmol/L。

為了研究清楚到底是蛋白質(zhì)的表面引入糖基的靜電作用還是其位阻作用導致美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的溶解性及熱穩(wěn)定性增強，我們對其表面電勢進行了研究，結(jié)果顯示：在pH值小于等電點時，米渣蛋白的電位要高于糖基化后產(chǎn)物的電位，在pH值大于等電點時，米渣蛋白的電位高于改性后米渣蛋白-葡萄糖的電位，其結(jié)果表明糖分子接入米渣蛋白后，賴氨酸含量減少，導致正電荷減少，相對負電荷增加。從而說明溶液熱穩(wěn)定性的增加不是因為靜電作用力增強來維持體系的穩(wěn)定，而是蛋白質(zhì)表面多糖的位阻效應(yīng)對蛋白的聚集有阻礙作用。同時，米渣蛋白在美拉德反應(yīng)改性后，等電點有所減小。這是因為當還原糖分子的還原末端接入米渣蛋白的游離氨基位點時，減少了米渣蛋白所帶的正電荷，相對增加了米渣蛋白所帶的負電荷，從而導致其等電點向酸性方向偏移。

美拉德法改性米渣蛋白質(zhì)的電泳特性

圖4為米渣蛋白美拉德反應(yīng)產(chǎn)物電泳圖譜；

a：蛋白標準品

1：米渣蛋白空白；

2：淀粉酶處理后0h產(chǎn)物；

3：淀粉酶處理后6h產(chǎn)物；

4：淀粉酶處理后12h產(chǎn)物；

5：淀粉酶處理后18h產(chǎn)物；

6：堿法提取米渣蛋白后，蛋白與葡萄糖比1:1；進行美拉德反應(yīng)6h產(chǎn)物；

7：堿法提取米渣蛋白后，蛋白與葡萄糖比1:1；進行美拉德反應(yīng)12h產(chǎn)物；

8：堿法提取米渣蛋白后蛋白與葡萄糖比1:1；進行美拉德反應(yīng)18h產(chǎn)物；(反應(yīng)條件：pH7.溫度60℃、濕度79％)。

電泳圖譜是分析蛋白質(zhì)組成成分的重要手段，常使用考馬斯亮藍染色來分析糖基化產(chǎn)物中糖鏈接入后蛋白質(zhì)分子量的變化。電泳結(jié)果如圖4所示，條帶1代表蛋白標準品特征條帶，分子量分布范圍為14.4～116ku。

主要原料與試劑

花生油山東魯花集團有限公司

十二烷基磺酸鈉(SDS) 美國Sigma公司

溴化鉀，凱氏定氮試劑，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉等均為分析純。

主要儀器與設(shè)備

pH計FE20 梅特勒—托利多儀器(上海)有限公司

85-2數(shù)顯恒溫磁力攪拌器江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司

k9840自動凱式定氮儀濟南海能儀器股份有限公司

離心機長沙平凡儀器儀表有限公司

XHF-D高速分散器寧波新芝科技股份有限公司

UV-5500PC紫外可見分光光度計上海元析儀器有限公司

DSC-Q10型差示掃描量熱儀美國TA公司

S-3000N掃描電子顯微鏡日本HITACHI公司

NEXUS 670傅立葉紅外光譜儀美國尼高力儀器公司

蛋白水解液氨基酸分析系統(tǒng)日本日立公司

J-810圓二色光譜儀日本Jasco公司

溶解性測定

稱取一定量的待測樣品溶于去離子水中，濃度為1mg/mL，用1M HCl或1M NaOH調(diào)節(jié)溶液的pH值(2、4、6、8、10、12)，在磁力攪拌器上常溫攪拌10min，然后4000r/min高速離心10min，取上清液，采用凱式定氮法測定蛋白質(zhì)含量。

測定米渣蛋白、外源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物、內(nèi)源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物在pH＝2、4、6、8、10、12下的溶解性，結(jié)果見圖5。

從圖5可看出，對應(yīng)pH下，與米渣蛋白相比，外源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物、內(nèi)源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物的溶解性都有較大提升，特別是從pH 6開始，提升非常明顯。三者的溶解性均在pH4時最低，此時比較接近米渣蛋白的等電點。外源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物、內(nèi)源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物在較寬的pH范圍內(nèi)都具有較好的溶解性。外源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物從pH＝8開始變化的趨勢更加明顯，說明它能夠保持較好溶解性的pH范圍比米渣蛋白麥芽糊精復合物更窄，而內(nèi)源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物的溶解性表現(xiàn)的更為穩(wěn)定。

對米渣蛋白、內(nèi)源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物及外源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物進行傅里葉紅外光譜分析，結(jié)果見圖6。

當?shù)鞍踪|(zhì)和糖分子以共價鍵結(jié)合后，在紅外圖譜上的典型特征是在3700～3200cm^-1范圍內(nèi)和1260～1000cm^-1范圍內(nèi)吸收增強，這分別是羥基和碳氧鍵的伸縮振動引起的。

從圖6可看出，3700～3200cm^-1范圍內(nèi)的吸收強度，內(nèi)源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物＞外源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物＞米渣蛋白，說明米渣蛋白通過與糖類發(fā)生美拉德反應(yīng)增加了羥基數(shù)量。

在1260～1000cm^-1范圍內(nèi)的吸收強度，內(nèi)源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物＞外源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物＞米渣蛋白，說明米渣蛋白通過與糖類發(fā)生美拉德反應(yīng)引入了更多碳氧鍵。

酰胺I帶(-NH彎曲振動，1700～1600cm^-1)和酰胺III帶(C-N伸縮振動和N-H彎曲振動，1300～1450cm^-1)的吸收強度，內(nèi)源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物＞外源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物＞米渣蛋白，說明米渣蛋白通過與葡萄糖、麥芽糊精發(fā)生美拉德反應(yīng)，其中的-NH₂基團發(fā)生了反應(yīng)。

掃描電子顯微鏡(SEM)分析

對米渣蛋白和外源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物進行掃描電子顯微鏡分析，結(jié)果見圖7、圖8、圖9。

在圖7、圖8、圖9中，每張圖中左右部分依次是米渣蛋白和外源性糖類-米渣蛋白美拉德法改性產(chǎn)物。

從放大倍數(shù)2000的掃描電鏡圖中可看出：米渣蛋白呈螺旋結(jié)構(gòu)有序地纏繞在一起，結(jié)構(gòu)較稀松；米渣蛋白與外源性葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后出現(xiàn)了許多圓形的顆粒，米渣蛋白以膠狀的形態(tài)與圓形顆粒混合在一起。

從放大倍數(shù)1000的掃描電鏡圖中可看出：米渣蛋白結(jié)構(gòu)有序且稀松；米渣蛋白與外葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后出現(xiàn)了許多圓形的顆粒，米渣蛋白以膠狀的形態(tài)與圓形顆粒粘合在一起。

從放大倍數(shù)500的掃描電鏡圖中可看出：米渣蛋白以圓條狀有序纏繞在一起；米渣蛋白與外源性葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后米渣蛋白失去了圓條狀形態(tài)，而是以膠狀形態(tài)粘合在一起。

綜上所述可以得出結(jié)論，米渣蛋白與外源性葡萄糖發(fā)生美拉德反應(yīng)后出現(xiàn)了許多圓形的顆粒，米渣蛋白喪失了原有形態(tài)，而是以膠狀的形態(tài)與圓形顆粒粘合在一起。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。