專利名稱：：用于改善傷口愈合過程的牛骨橋蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明關(guān)注的是包含牛骨橋蛋白的傷口愈合用軟骨、液體、硬青和其他裝置的制劑，用于改善每物種型的傷口的傷口愈合過程，其中傷口包括難以愈合的傷口，例如發(fā)炎的或受感染的傷口，特別是糖尿病患者的傷口。
背景技術(shù)：
：已知與開放性創(chuàng)傷伴發(fā)的、存在于淋巴液中的巨噬細胞、多形核白細胞、T-細胞和其他細胞分泌骨橋蛋白。在小鼠中，已經(jīng)顯示早在創(chuàng)傷后6小時就會向上調(diào)節(jié)骨橋蛋白表達。對缺乏功能性骨橋蛋白基因的小鼠(基因敲除小鼠)中傷口愈合的分析表明了被減弱的傷口愈合能力。這些傷口顯示了清創(chuàng)術(shù)水平顯著降低，基質(zhì)組織破壞和膠原微纖維形成改變，導(dǎo)致與具有功能性骨橋蛋白基因的小鼠的傷口相比，膠原原纖維的直徑較小。殼聚糖在獸醫(yī)學(xué)中用作傷口愈合加速劑。確切的作用機制是未知的。盡管如此，殼聚糖已經(jīng)顯示出可以增強某些與傷口愈合有關(guān)的免疫細胞的炎癥作用，并誘導(dǎo)那些細胞對骨橋蛋白的表達。這些發(fā)現(xiàn)促使我們研究向不同的傷口模型施用包含從牛奶中純化的骨橋蛋白的局部用制劑的效果。發(fā)明簡述出人意料地，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)牛骨橋蛋白可以用于改善傷口愈合過程，不論該傷口是未感染的、感染的或發(fā)炎的還是糖尿病患者的，對于所有的物種都不會發(fā)生任何變態(tài)反應(yīng)。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種傷口愈合的局部用制劑，包含牛骨橋蛋白和輔助劑。牛骨橋蛋白是來自牛奶的骨橋蛋白，可以購自AriaFoodsIngredients,Denmark,或可以使酸乳清通過強堿性陰離子樹脂以進行色鐠例如來自Amersham,UK的QSepharose來獲得。用1MNaCl從柱上洗脫骨橋蛋白。然后將洗脫液超濾，最后干燥，例如使用凍干法。輔助劑是局部用制劑的常規(guī)輔助劑，例如用于軟骨的載體藥青。該制劑可以是例如軟膏、液體、粉末或石更膏。輔助劑選自常用于這類局部用制劑的那些。一個例子是用于軟膏的羧甲基纖維素。本發(fā)明的軟青優(yōu)選具有的骨橋蛋白水平是0.01%到10%。小于0.01%在大多數(shù)情況下都不能產(chǎn)生期望的效果，而大于io%則會過剩。優(yōu)選的水平是0.1%-5%,0.1-2%,0.1到1.5或者0.5%到1%。該量可取決于所要治療的傷口的類型。本發(fā)明也涉及牛骨橋蛋白在制備用于改善傷口愈合，包括發(fā)炎的傷口和糖尿病患者的傷口愈合的局部用藥物中的應(yīng)用。因此，該制劑可以用于一種改善傷口愈合的方法，該方法包括給有此需要的患者施用有效量的牛骨橋蛋白?；颊呖梢允侨嘶騽游?。在不同的小鼠傷口模型中研究了牛骨橋蛋白的效果，即傷口愈合能力被減弱的糖尿病小鼠模型，感染的受損模型和健康的野生型模型。據(jù)發(fā)現(xiàn)，在所有模型中傷口愈合的時間都顯著縮短了1-3天。但是，需要的牛骨橋蛋白劑量因所使用的模型不同而各不相同。野生小鼠模型需要的劑量最低，感染的小鼠模型劑量最高。向軟骨制劑中加入不同量的牛骨橋蛋白，根據(jù)模型為達到最佳性能，范圍為O.1-1.5%。令人驚奇地，我們因此可以聲明，牛骨橋蛋白能夠用于傷口愈合的改善，對于所有物種都不會發(fā)生變態(tài)反應(yīng)。藥學(xué)結(jié)果已經(jīng)使用不同水平的骨橋蛋白進行了三種實驗性測試研究。將牛骨橋蛋白摻入到基本上由羧甲基纖維素組成的標準凝膠中。在下列試驗中寫作f.ex.的數(shù)字如"0，27"(用丹麥文是正確的)應(yīng)當(dāng)更正為f.ex."0.27"(用英文是正確的)。I.在傷口愈合受損的模型中加速傷口愈合介紹目的該研究的目的是測試在II型糖尿病小鼠的傷口愈合減弱的模型中，骨橋蛋白對于傷口愈合的藥理學(xué)功效。概要將32只db/db小鼠(BKS.Cg-m+/+Leprdb)分成4組，每組8只。這些小鼠發(fā)生了2型糖尿病，結(jié)果傷口愈合減弱。血糖在15-20mM之間。另外將8只C57BLKS/j品系的野生型小鼠用作正常傷口愈合的對照。在第0日將所有小鼠麻醉，剃毛并用8mra的打孔活組織檢查工具在它們的背部制作一個8mm的傷口。從第0-15日，用局部應(yīng)用于傷口區(qū)域的栽體藥骨或0.1%，1%或10%骨橋蛋白藥膏治療所有動物。從第1-15日，對所有動物的傷口外觀評分，并記錄傷口直徑。在笫l，4，10和15日，記錄小鼠的重量。在整個實驗期間，如果需要，用Rimaldyl治療動物疼痛。結(jié)果表明，骨橋蛋白治療無疑比完全不治療要好。在加速糖尿病小鼠傷口愈合中，1.0°/。的骨橋蛋白劑量優(yōu)于其他的骨橋蛋白劑量。0.1%的骨橋蛋白劑量也相當(dāng)成功地加速了傷口愈合。論證已知II型糖尿病db/db小鼠的傷口愈合受損，因而顯然是傷口愈合模型的品系。性質(zhì)除非另有說明，該研究是根據(jù)PipelineBiotechA/S，StandardOperatingProcedures(SOP，s)進行的。研究時間表動物抵達21.10.2004開始治療07.12.2004活著的動物操作完成22.12.2004試驗系統(tǒng)物種，品系和供應(yīng)者該研究是在來自M&B-Taconic的32只DB小鼠(BKS.Cg-m+/+Leprdb)和8只C57BLKS/j(認為是野生型)中進行的。小鼠的年齡在抵達后為10-12周，但是由于長時間等待試驗品發(fā)貨而在開始試驗前達到了17-19周。環(huán)境將小鼠單個關(guān)在標準的2型Macrolon籠中。襯墊是濾紙。在層流單元中每周更換一次襯墊。溫度為20°C-24°C，并通過實驗室中的環(huán)境通風(fēng)系統(tǒng)控制溫度。光骨橋蛋白，局部施用，0.1°/。，1%和10%栽體藥骨驗驗體試試歉周期是12-小時黑暗和12-小時光亮(在06.00時開燈)。飲食和水飲食是HarlanTeklad2016飲食。水是經(jīng)UV-滅菌的，在適應(yīng)環(huán)境和實驗期間必要時再裝滿水瓶。隨意給予飲食和水。動物健康和福利動物具有FELASASPF-狀態(tài)，設(shè)計居住和變化系統(tǒng)以保證在研究期間保持SPF-狀態(tài)。由獸醫(yī)監(jiān)督下的受過培訓(xùn)的人員操作動物。至于動物福利，則進4亍每日記錄和決定。實驗前程序適應(yīng)環(huán)境和健康程序由于等待試驗品發(fā)貨的時間，使動物適應(yīng)環(huán)境長達47天。實驗程序<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>在傷口操作前l(fā)小時通過施用5mg/kgs.c.Rimaldyl麻醉所有小鼠，在實驗期間如果需要每天進行l(wèi)次。引入傷口在Rimadryl給藥后1小時后和在芬太尼/多美康麻醉后約15分鐘，在每只小鼠上引入傷口。通過下列操作在每只小鼠的背部皮膚上引入傷口1.在小鼠的背部剃出2x3cm的區(qū)域。2.使用8腿的打孔活組織檢查工具在所剃出區(qū)域的中心區(qū)域上制作出圓形切口。3.將皮膚塊抬起一點，小心地從小鼠上切離。4.將小鼠放回籠中。治療從第0日(剛產(chǎn)生傷口后)到第14日(結(jié)束前的日子)，向所有動物的傷口上施用載體(載體藥膏)或骨橋蛋白藥青(0，05mL)。在剛評分和測量后進行施用。觀察和測量由于傷口需要愈合，在第1日不進行測量。但是從第1-15日對傷口進行評分和測量?？v向(根據(jù)從頭到尾這條線)測量傷口的直徑，并每日記錄。對傷口的外觀進行評分，并每日記錄。在第1，4，IO和15日記錄體重。傷口的評分根據(jù)下列系統(tǒng)對傷口進行評分0:完全愈合1:仍然檢測到小傷口.2:沒有結(jié)疤，但仍然有傷口3:沒有原來的疤，但有新疤(舊應(yīng)衰退，但新痣產(chǎn)生)4:原來的疤仍然在傷口上。結(jié)束在實驗結(jié)束時使小鼠安樂死。在無菌條件下切開傷口。如果需要，將傷口和傷口周圍約0，5cm的區(qū)域置于福爾馬林緩沖液(Lilly，s液)中以進一步研究。將樣品寄給發(fā)起人保留傷口樣品，直至發(fā)起人的進一步通知。研究概述<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>這些結(jié)果在下面所示的圖中說明:<image>imageseeoriginaldocumentpage11</image>評分0:完全愈合1:仍然檢測到小傷口.2:沒有結(jié)疤，但仍然有傷口3:沒有原來的疤，但有新疤(舊疤衰退，但新疤產(chǎn)生)4:原來的疤仍然在傷口上。下面顯示的是對于傷口評分的Mann-Whitney配對的秩和檢驗(Wilcoxon雙樣品檢驗)的結(jié)果。將對照和試驗組的結(jié)果與第2組進行比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>這些結(jié)果通過下面所示的圖說明:下面顯示的是根據(jù)傷口直徑的配對F-和Studentt-檢驗的結(jié)果。將對照和試驗組的結(jié)果與笫2組進行比較。平均傷口直徑載體載體DB骨橋蛋白0.1%v..DB骨橋蛋白1°/。骨橋蛋白10%10評分曰1520,1oo,oo,o,o,o,oo,<u,o,9,8,7,6,5,4,3,2,1,o.<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>n.s.:非顯著的傷口直徑的AUC(曲線下面積)統(tǒng)計分析結(jié)果如下(將對照和試驗組的結(jié)果與第2組進行比較。)第1組<0.01第3組<0.01第4組<0.01第5組<0.01結(jié)論:第1組WT第3組DB第4組DB第5組DB載體直徑一般顯著大于第2組骨橋蛋白0.1%直徑一般顯著小于第2組骨橋蛋白1%直徑一般顯著小于第2組骨橋蛋白10%直徑一般顯著大于第2組傷口面積:下面顯示的是4艮據(jù)傷口面積的配對F-和Studentt-檢驗的結(jié)果,將對照和試驗組的結(jié)果與笫2組進行比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>n.s.:非顯著的傷口面積的AUC(曲線下面積)統(tǒng)計分析結(jié)果如下(將對照和試驗組的結(jié)果與第2組進行比較。)第1組<0.05笫3組非顯著的。第4組非顯著的。第5組非顯著的。第1組WT;載體面積一般顯著大于第2組,第3組DB;骨橋蛋白0.1%在第8,11，12和13日的面積顯著小于第2組第4組DB;骨橋蛋白1%在第910，11，12和13日的面積顯著小于第2組第5組DB;骨橋蛋白10%在第3，4，5，6和7日的面積顯著大于第2組相對于第1日的傷口面積下面顯示的是相對于第1日的根據(jù)傷口面積的配對F-和Studentt-檢驗的結(jié)果。將對照和試驗組的結(jié)果與第2組進行比較。<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>相對傷口面積的AUC(曲線下面積)統(tǒng)計分析結(jié)果如下(將對照和試驗組的結(jié)果與第2組進行比較。)。第l組非顯著的。第3組非顯著的。第4組非顯著的.第5組非顯著的。結(jié)論:第1組WT;載體第8，9，11和12日的傷口面積顯著大于第2組(DB，載體)。第3組DB;骨橋蛋白0.1%與第2組沒有顯著偏差。笫4組DB;骨橋蛋白1%第2，9,10，11和12日的傷口面積顯著大于第2組(DB,載體)第5組DB;骨橋蛋白10%第7日的傷口面積顯著大于第2組。結(jié)論在糖尿病小鼠中，骨橋蛋白1.0%藥骨在加速傷口愈合中是最成功的。在傷口評分和傷口大小方面都觀察到了明確的積極效果。在用0.1%骨橋蛋白治療的動物中也觀察到了對傷口大小的積極效果。檔案在研究結(jié)束后五(5)年的時間里將最終報告以及所有的原始數(shù)據(jù)和結(jié)果都保存在PipelineBiotechA/S的檔案室中。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>表l;傷口評分(續(xù))<table>complextableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>評分:0:完魏合1:仍然檢測到小傷口。2:沒有結(jié)疤，但仍然有傷口3:沒有原來的疤，但有新疤(舊疤衰退，但新疤產(chǎn)生)4:原來的疤仍然在傷口上，表l;傷口評分(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>o，o評分0:完全愈合1:仍然檢測到小傷口。2:沒有結(jié)疤，但仍然有傷口3:沒有原來的疤，但有新疤(舊疤衰退，但新疤產(chǎn)生)4:原來的疤仍然在傷口上。表l;傷口評分(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table>表2;傷口測量(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>表2;傷口測量(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>所有傷口都是根據(jù)從頭到尾這條線測量的所有傷口都是從傷口的邊緣(在傷口表面和正常皮膚之間)測量的。<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage31</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>表3;傷口面積(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>所有傷口都是根據(jù)從頭到尾這條線測量的。所有傷口都是從傷口的邊緣(在傷口表面和正常皮膚之間)測量的。表3;傷口面積(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>所有傷口都是根據(jù)從頭到尾這條線測量的。所有傷口都是從傷口的邊緣(在傷口表面和正常皮膚之間)測量的。表3;傷口面積(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table>所有傷口都是根據(jù)從頭到尾這條線測量的。所有傷口都是從傷口的邊緣(在傷口表面和正常皮膚之間)測量的,<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage38</column></row><table>表4;相對于<table>tableseeoriginaldocumentpage39</column></row><table>所有傷口都是根據(jù)從頭到尾這條線測量的。所有傷口都是從傷口的邊緣(在傷口表面和正常皮膚之間)測量的。表4;相對于第1日的傷口面積(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage40</column></row><table>所有傷口都是根據(jù)從頭到尾這條線測量的。所有傷口都是從傷口的邊緣(在傷口表面和正常皮趺之間)測量的。表5;動物重量<table>tableseeoriginaldocumentpage41</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage42</column></row><table>II.在傷口感染模型中的加速的傷口愈合介紹目的該研究的目的是測試在小鼠的傷口感染模型中，，骨橋蛋白對于傷口愈合的藥理學(xué)功效。該部分的報告呈現(xiàn)的僅是受感染的小鼠的數(shù)據(jù)和結(jié)果。概要在第1日將4組的8只C57BL/6J小鼠麻醉，剃毛，并用8mm的打孔活組織檢查工具在它們的背部制作一個8nun的傷口。然后用50pl包含lx105CFU金黃色葡萄球菌的PBS感染動物的傷口。然后用"Compeel"泡罩模覆蓋所有受感染的傷口。該?？梢源蜷_以進行治療。在第1曰開始治療。如下治療各組每日重復(fù)治療，共15日。同時，在第1日到第15日對傷口進行評分和測量。如傷口評分降低和傷口愈合加速所反映的，用1.5%骨橋蛋白的藥膏治療受感染傷口對于傷口愈合具有明確的積極效果。用0.1和1.0%骨橋蛋白的藥骨沒有觀測到效果。論證在醫(yī)院中手術(shù)、燒傷等等后受感染的傷口是很常見的。當(dāng)處理免疫缺失的患者時，這與具有有效的治療選擇尤為相關(guān)。+感染；載體藥骨。+感染；0.5%OPN藥骨。+感染；1.0%0PN藥青。+感染；1.5%0PN藥骨。4567第第第第試驗品說明，鑒定和貯藏試驗品骨橋蛋白，局部施用，0.5%，1.0%和1.5%載體載體藥骨制劑Pipeline制備的藥青中的骨橋蛋白的原液和給藥溶液。在研究開始時制備原液。將給藥溶液貯藏在冰箱中。組成分析未進行濃縮和貯藏，穩(wěn)定性和均勻性將骨橋蛋白粉末在室溫下貯藏。將骨橋蛋白的原液貯藏在冰箱中。試驗系統(tǒng)物種，品系和供應(yīng)者在來自M&B-Taconic的7-8周大的32只雌性C57BL/6J小鼠中進行了研究。環(huán)境將小鼠關(guān)在標準的2型Macrolon籠中。在層流單元中每周更換一次襯墊。溫度為20°C-24°C，通過實驗室中的環(huán)境通風(fēng)系統(tǒng)控制溫度。光周期是12-小時黑暗和12-小時光亮(在06.00開燈)。飲食和水飲食是Altromin1314飲食。水是經(jīng)UV-滅菌的，在適應(yīng)環(huán)境和實驗期間必要時再裝滿水瓶。隨意給予飲食和水。動物健康和福利動物具有FELASASPF-狀態(tài)，設(shè)計居住和變化系統(tǒng)以保證在研究期間保持SPF-狀態(tài)。由獸醫(yī)監(jiān)督下的受過培訓(xùn)的人員操作動物。至于動物福利，則進行每日記錄和決定。試驗前程序適應(yīng)環(huán)境和健康程序使動物適應(yīng)環(huán)境約7曰。細菌培養(yǎng)金黃色葡萄球菌(Pipeline野生型菌抹)。細菌濃度2xl06cfu/mL實驗程序分組在第l日，將小鼠分組，并根據(jù)下列安排給藥:<table>tableseeoriginaldocumentpage46</column></row><table>細菌濃度2xl06cfu/mL麻醉在傷口操作前1小時通過施用5mg/kgs.c.Ri歸ldyl麻醉所有小鼠，引入傷口在Rimadryl給藥后1小時后和在手術(shù)麻醉后約15分鐘，在每個小鼠上引入一個傷口。通過下列操作在每只小鼠的背部皮膚上引入一個傷口1.在小鼠的背部刮出2x3cm的區(qū)域。2.使用8mm的打孔活組織檢查工具在所刮出區(qū)域的中心區(qū)域上制作出圓形切口。3.將皮膚塊抬起一點，小心地從小鼠上切離。然后根據(jù)下列程序向傷口中接種金黃色葡萄球菌1.通過吸量管將50|i1具有細菌培養(yǎng)物的PBS置于傷口區(qū)域中。2.用"Compeel"泡罩模覆蓋所有傷口。3.然后準備好小鼠以進行治療。治療在第1日開始治療。在小鼠的"Compeel"模中切出一個窗口。然后如5.1部分所述將藥骨應(yīng)用于所有治療組。用栽體藥膏治療第4組，用0.5。/。0PN的藥骨治療第5組，用0.1%0PN的藥膏治療第6組，用1.5%OPN的藥骨治療第7組。將藥骨小心地局部施用于傷口上。每曰重復(fù)治療，共15曰。觀察和測量從第1-15日對傷口進行評分和測量?？v向(根據(jù)從頭到尾這條線)測量傷口的直徑，并每日記錄。根據(jù)下列系統(tǒng)對傷口的外觀進行評分，并每日記錄0:完全愈合1:仍然檢測到小傷口2:沒有結(jié)疤，但仍然有傷口3:沒有原來的疤，但有新疤(舊疤衰退，但新疤產(chǎn)生)4:原來的疤仍然在傷口上。在第1，5，8，12和15日記錄體重。結(jié)束在實驗結(jié)束時使小鼠安樂死。<table>tableseeoriginaldocumentpage48</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage49</column></row><table>n.s.:非顯著的結(jié)論:第4組第5組第6組+感染;+感染;+感染;載體藥青。0.5%OPN藥骨,1.0%OPN藥骨,第7組+感染；1.5。/。OPN藥膏與第4組沒有差異。在第13曰的評分顯著低于第4組。在第7，11，12,13和15日的評分顯著低于第4組傷口直徑結(jié)果如表2(附錄)所示。通過配對F-和Studentt-檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。將試驗組的結(jié)果與第4組進行比較。統(tǒng)計分析的結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage50</column></row><table>傷口直徑的AUC(曲線下面積)統(tǒng)計分析的結(jié)果如下(將試驗組的結(jié)果與第4組進行比較。)第5組非顯著的。第6組非顯著的。第7組非顯著的。200680052909.5勢溢*被48/100K結(jié)論:4組:5組:6組7組+感染；栽體藥骨。+感染；0.5%OPN藥骨+感染；1.0%OPN藥膏,+感染；1.5%OPN藥青在第13日的直徑顯著小于第4組。但是直徑一般不顯著小于第4組。直徑一般不顯著小于第4組。在第8，11，12,13和15曰的直徑顯著小于第4組。但是直徑一般不顯著小于第4組。傷口面積結(jié)果如表3(附錄)所示。通過配對F-和Studentt-檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。將試驗組的結(jié)果與第4組進行比較。統(tǒng)計分析的結(jié)果如下第第第第<table>tableseeoriginaldocumentpage52</column></row><table>結(jié)論:載體藥骨。0.5%OPN藥青。1.0%OPN藥青。1.5%OPN藥青。直徑一般不顯著小于第4組。直徑一般不顯著小于第4組。在第8，11，12和13日的直徑顯著小于第4組。但是面積一般不顯著小于第4組。相對于第1日的傷口面積結(jié)果如表4(附錄)所示。通過配對F-和Studentt-檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。將試驗組的結(jié)果與第4組進行比較。統(tǒng)計分析的結(jié)果如下染染染染感感感感p二frl一fy-一f一,一4567第第第第<table>tableseeoriginaldocumentpage54</column></row><table>相對傷口面積的AUC(曲線下面積)統(tǒng)計分析的結(jié)果如下(將試驗組的結(jié)果與第4組進行比較。)第5組:第6組:第7組:非顯著的。非顯著的。<0.0結(jié)論載體藥膏。0.5%OPN藥骨。面積一般不顯著小于第4組。1.0%0PN藥骨。面積一般不顯著小于第4組。1.5%OPN藥骨。面積一般不顯著小于第4組。結(jié)論在治療的最后一周期間，用1.5°/。骨橋蛋白藥青治療明顯降低了受感染傷口的傷口評分。因此1.5%骨橋蛋白藥骨對于這些傷口的愈合具有積極效果。這些相同的積極效果僅僅在用1.0%骨橋蛋白藥骨治療的動物中在第13日才能觀察到。用0.1%骨橋蛋白藥骨沒有觀察到效果。如傷口直徑、傷口面積和相對傷口面積所反映出來的，1.5%骨橋蛋白藥膏對于傷口大小也具有顯著的積極效果。用具有低濃度的骨橋蛋白的藥膏沒有觀察到相同的積極效果。檔案在實驗結(jié)束后五(5)年的時間里將最終報告以及所有的原始數(shù)據(jù)和結(jié)果都保存在PipelineBiotechA/S的檔案室中。染染染染感感感感+It二f，J.一f-一f-一4567第第第第表l;傷口評分:<table>tableseeoriginaldocumentpage56</column></row><table>評分0:完鎮(zhèn)合1:仍然檢測到小傷口.2:沒有結(jié)疤，但仍然有傷口3:沒有原來的疤，但有新疤(舊疤衰退，但新疤產(chǎn)生)4:原來的疤仍然在傷口上。<table>tableseeoriginaldocumentpage57</column></row><table>表l;傷口評分(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage58</column></row><table>評分0:完全愈合1:仍然檢測到小傷口.2:沒有結(jié)疤，但仍然有傷口3:沒有原來的疤，但有新疤(舊疤衰退，但新疤產(chǎn)生)4:原來的疤仍然在傷口上。表2;傷口評分(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage59</column></row><table>評分0:完全愈合1:仍然檢測到小傷口.2:沒有結(jié)疤，但仍然有傷口表2;傷口直徑<table>tableseeoriginaldocumentpage60</column></row><table>所有傷口都是根據(jù)從頭到尾這條線測量的。所有傷口都是從傷口的邊緣(在傷口表面和正常皮膚之間)測量的。<table>tableseeoriginaldocumentpage61</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage62</column></row><table>所有傷口都是根據(jù)從頭到尾這條線測量的。所有傷口都是從傷口的邊緣(在傷口表面和正常皮膚之間)測量的。<table>tableseeoriginaldocumentpage63</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage64</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage65</column></row><table>表3;傷口面積(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage66</column></row><table>表3;傷口面積(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage67</column></row><table>所有傷口都是根據(jù)從頭到尾這條線測量的。所有傷口都是從傷口的邊緣(在傷口表面和正常皮膚之間)測量的。200680052909.5轉(zhuǎn)溢齒被65/1005x表4;相對傷口面積<table>tableseeoriginaldocumentpage68</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage69</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage70</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage71</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage72</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage73</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage74</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage75</column></row><table>in.在野生型小鼠中加速的傷口愈合介紹目的該研究的目的是測試在正常野生型小鼠中，骨橋蛋白對于傷口愈合的藥理學(xué)功效。概要在第2日將3組的8只C57BL/6J小鼠麻醉，剃毛，并用8mm的打孔活組織檢查工具在它們的背部制作一個8mm的傷口。如下，用骨橋蛋白(OPN)的藥骨治療各組每日重復(fù)治療，共15日。同時，在第1日到第15日對傷口進行評分和測量。用0.1%OPN藥膏治療傷口小鼠看來對于愈合過程的最后一部分的傷口愈合具有顯著的積極效果。試驗品說明，鑒定和貯藏試驗品骨橋蛋白，局部施用，0.1%和1.0%.載體載體藥骨載體藥膏。0.1%OPN藥膏。1.0°/。0PN藥膏。rtB4OMJnM^123第第第制劑Pipeline制備的藥骨中的骨橋蛋白的原液和給藥溶液。在研究開始時制備原液。將給藥溶液貯藏在冰箱中。組成分析未進行濃縮和貯藏，穩(wěn)定性和均勻性將骨橋蛋白粉末在室溫下貯藏。將骨橋蛋白的原液貯藏在冰箱中。試驗系統(tǒng)物種，品系和供應(yīng)者在來自M&B-Taconic的7-8周大的24只雌性C57BL/6J小鼠中進行了研究。環(huán)境將小鼠關(guān)在標準的2型Macrolon籠中。在層流單元中每周更換一次襯墊。溫度為20°C-24。C，通過實驗室中的環(huán)境通風(fēng)系統(tǒng)控制溫度。光周期是12-小時黑暗和12-小時光亮(在06.00開燈)。飲食和水々大食是Altromin1314飲食。水是經(jīng)UV-滅菌的，在適應(yīng)環(huán)境和實驗期間必要時再裝滿水瓶。隨意給予飲食和水。動物Y建康和福利動物具有FELASASPF-狀態(tài)，設(shè)計居住和變化系統(tǒng)以保證在研究期間保持SPF-狀態(tài)。由獸醫(yī)監(jiān)督下的受過培訓(xùn)的人員操作動物。至于動物福利，則進行每日記錄和決定。試驗前程序適應(yīng)環(huán)境和健康程序使動物適應(yīng)環(huán)境約7日。實驗程序分組<table>tableseeoriginaldocumentpage78</column></row><table>麻醉在傷口操作前l(fā)小時通過施用5mg/kgs.c.Rimaldyl麻醉所有小鼠。引入傷口在第1日在小鼠上引入傷口。在Riraadryl給藥后1小時后和在手術(shù)麻醉后約15分鐘，在每只小鼠上引入一個傷口。通過下列操作在每只小鼠的背部皮膚上引入一個傷口1.在小鼠的背部刮出2x3cm的區(qū)域。2.使用8mm的打孔活組織檢查工具在所刮出區(qū)域的中心區(qū)域上制作出圓形切口。3.將皮膚塊抬起一點，小心地從小鼠上切離。治療在第1日開始治療。然后如5.l部分所述將藥骨應(yīng)用于所有治療組。用載體藥膏治療第l組，用0."/。OPN的藥骨治療第2組，用1.0%OPN的藥膏治療第3組。將藥骨小心地局部施用于傷口上。每曰重復(fù)治療，共15日。觀察和測量從第1-15日對傷口進行評分和測量。縱向(根據(jù)從頭到尾這條線)測量傷口的直徑，并每日記錄。根據(jù)下列系統(tǒng)對傷口的外觀進行評分，并每日記錄0:完全愈合1:仍然檢測到小傷口2:沒有結(jié)疤，但仍然有傷口3:沒有原來的疤，但有新疤(舊疤衰退，但新疤產(chǎn)生)4:原來的疤仍然在傷口上。在第1，5，8，12和15日記錄體重。結(jié)束在實驗結(jié)束時使小鼠安樂死。<table>tableseeoriginaldocumentpage80</column></row><table>結(jié)果傷口評分結(jié)果如表l(附錄)所示。通過Mann-Whitney配對的秩和檢驗(Wilcoxon雙樣品檢驗)對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。將對照組和試驗組的結(jié)果與第1組進行比較。統(tǒng)計分才斤的結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage81</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage82</column></row><table>結(jié)論第l組載體藥骨。第2組0.1。/。0PN藥骨。一般直徑顯著小于笫l組。第3組1.0%OPN藥骨。一般直徑顯著小于第l組。傷口面積結(jié)果如表3(附錄)所示。通過配對F-和Studentt-檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。將對照組和試驗組的結(jié)果與第4組進行比較。統(tǒng)計分析的結(jié)果如下<table>tableseeoriginaldocumentpage84</column></row><table>n.s.:非顯著的傷口面積的AUC(曲線下面積)統(tǒng)計分析的結(jié)果如下(將對照組和試驗組的結(jié)果與第1組進行比較。)第2組<0.05第3組非顯著的。相對于第1日的傷口面積結(jié)果如表4(附錄)所示。通過配對F-和Studentt-檢驗對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。將對照組和試驗組的結(jié)果與笫4組進行比較。統(tǒng)計分析的結(jié)果如下栽體藥骨。0.1。/。0PN藥膏。面積一般顯著小于第l組。1.0%OPN藥膏。傷口面積在第7和12日顯著更小。論123i第第笫<table>tableseeoriginaldocumentpage86</column></row><table>n.s.:非顯著的相對傷口面積的AUC(曲線下面積)統(tǒng)計分析的結(jié)果如下(將對照組和試驗組的結(jié)果與第1組進行比較。)笫2組非顯著的。第3組非顯著的。體重動物的體重如表5和6(附錄)所示。觀察到各組之間的體重沒有差異。結(jié)論觀察到各組之間的傷口評分沒有差異。笫2組(0.1%OPN)和第3組(1.0%OPN)的傷口直徑顯著小于第l組(栽體)。當(dāng)比較傷口面積時，看來僅第2組的傷口面積一般顯著減小。第3組的傷口面積僅在第7和12日顯著小于第l組。當(dāng)傷口面積與第1日相比時，笫2組的相對傷口面積在第10，11和12日顯著小于第l組。發(fā)現(xiàn)第l組和第3組之間沒有顯著的差異。因此，用0.OPN藥骨治療野生型小鼠的傷口看來對于愈合過程的最后一部分的傷口愈合具有積極效果。檔案在實驗結(jié)束后五(5)年的時間里將最終報告以及所有的原始數(shù)據(jù)和結(jié)果都保存在PipelineBiotechA/S的檔案室中。載體藥青。0.r/oOPN藥骨。在第10，11和12日相對傷口面積顯著小于第1組。1.0%0PN藥骨。與第1組沒有差異。表l;傷口評分:<table>tableseeoriginaldocumentpage88</column></row><table><image>imageseeoriginaldocumentpage89</image><table>tableseeoriginaldocumentpage90</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage91</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage92</column></row><table>動物123467891011121314159纖4,905,894，455,956，033，923，704，072,452，742，260,83000108,116,915，826,696，076，395,404,262,502,272，270,81000118，356，786,446,155，356,495，315,252,802，132,131，100,7800124，123,523，033,464,043,903,872,602,612,212，000,93l，ll0013■'二、i:6,687,788，558,618，758，897,346,803，562，880，660,6600014纖6，796,285,777,177，086,665,686，056，052，562,310,830,610015^^^^:》％4,046,695,715,255，416,074,893,800000,61000168,257，786，805,745,597，066，886，295，193，311,5900,780，850-'F均^^^^6,46,55，86,16，06，25，44,93,12,31,70，70，40，10,0標準偏差.^1,81,41,61,51,41,61,31，41,91，o0，90，30,50，30，0,所有傷口都是根據(jù)從頭到尾這條線測量的.所有傷口都是從傷口的邊緣(在傷口表面和正常皮膚之間)測量的。200680052909.5轉(zhuǎn)溢也被90/1005t傷口直徑(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage93</column></row><table>所有傷口都是根據(jù)從頭到尾這條線測量的。所有傷口都是從傷口的邊緣(在傷口表面和正常皮膚之間)測量的。表3;傷口面積<table>tableseeoriginaldocumentpage94</column></row><table>所有傷口都是根據(jù)從頭到尾這條線測量的。所有傷口都是從傷口的邊緣(在傷口表面和正常皮膚之間)測量的。<image>imageseeoriginaldocumentpage95</image>所有傷口都是根據(jù)從頭到尾這條線測量的。所有傷口都是從傷口的邊緣(在傷口表面和正常皮膚之間)測量的。200680052909.5轉(zhuǎn)漲a被93/100到<table>tableseeoriginaldocumentpage96</column></row><table>表4;相對傷口面積<table>tableseeoriginaldocumentpage97</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage98</column></row><table>相對傷口面積(續(xù))<table>tableseeoriginaldocumentpage99</column></row><table>表5;動物重量<table>complextableseeoriginaldocumentpage100</column></row><table>表6;動物重量，相對于第1日<table>tableseeoriginaldocumentpage101</column></row><table>主要結(jié)論在健康和糖尿病小鼠以及受感染的、健康的動物上進行了該實驗。為了影響正常灌注組織中急性傷口的愈合，所檢驗的試驗品的效果必須相當(dāng)強。骨橋蛋白試驗證明了同樣對這些模型的效果，特別是在傷口愈合過程結(jié)束時。至于所使用的骨橋蛋白濃度，看來會有一些小的差異，但是這也可能是由于各種傷口模型的結(jié)構(gòu)。觀察到牛骨橋蛋白對于糖尿病動物以及對于不同誘發(fā)的細菌而停止愈合的受感染的傷口具有效果。這證明了牛骨橋蛋白的傷口愈合作用。在完全健康的動物上也能夠觀察到該效果，可以支持該假設(shè)。因此，主要結(jié)論是，牛骨橋蛋白對于急性傷口的愈合具有效果。因此，也有理由相信該作用也適用于慢性未愈合的傷口。權(quán)利要求1.一種傷口愈合的局部用制劑，包含牛骨橋蛋白和輔助劑。2.權(quán)利要求l的制劑，其中該制劑是軟青、液體、粉末或硬骨。3.權(quán)利要求2的軟膏，其中骨橋蛋白的水平是0.01%到10%。4.權(quán)利要求3的軟膏，其中骨橋蛋白的水平是0.1%到5%。5.權(quán)利要求4的軟青，其中骨橋蛋白的水平是0.1%到2%。6.權(quán)利要求5的軟膏，其中骨橋蛋白的水平是0.1%到1.5%。7.權(quán)利要求6的軟膏，其中骨橋蛋白的水平是0.5%到1%。8.牛骨橋蛋白在制備用于改善傷口愈合的局部用藥物制劑中的應(yīng)用。9.牛骨橋蛋白在制備改善受感染或發(fā)炎的傷口愈合的局部用藥物制劑中的應(yīng)用。10.牛骨橋蛋白在制備用于改善糖尿病性傷口愈合的局部用藥物制劑中的應(yīng)用。11.一種改善傷口愈合的方法，包括給有此需要的患者施用有效量的牛骨橋蛋白。全文摘要用于改善傷口愈合的局部用制劑，包含牛骨橋蛋白。該傷口可以是受感染的或發(fā)炎的或者它可以是糖尿病性傷口。文檔編號A61P17/02GK101374542SQ200680052909公開日2009年2月25日申請日期2006年12月15日優(yōu)先權(quán)日2005年12月16日發(fā)明者A·S·克維斯特加德,E·S·瑟倫森,H·伯靈申請人:阿爾拉食品公司