專利名稱：：用于從血液中體外去除病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及從哺乳動物血液中體外去除病原微生物、炎性細胞或炎性蛋液中體外去除所述病原」微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)的用途，所述碳水化合物對于病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)具有結(jié)合親和力；對于病原孩i生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)具有結(jié)合親和力的碳水化合物在制備用于治療由所述病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)引起或加重的病癥的設(shè)備中的用途，其中所述碳水化合物固定在固體基質(zhì)上；和用于治療患有由病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)引起或加重的病癥的哺乳動物受試者的方法。背景在長時間的進化過程中，很多病原微生物已學(xué)會了發(fā)現(xiàn)真核細胞表面的糖綴合物(glycoconjugate)，即糖脂、糖蛋白和蛋白聚糖(proteoglycan)，將其作為細胞附著(cellattachment)的受體分子，以促進定植(colonization)和入侵過程。簡言之，細菌、病毒、真菌和寄生蟲表面稱作粘附素(adhesin)的特定蛋白與糖綴合物的碳水化合物鏈相互作用，所述碳水化合物能使微生物定植于粘月莫表面和組織損傷(tissuelesion)。唾液酸在病原體與宿主細胞結(jié)合中的作用已經(jīng)報道了很多年。僅在最近，蛋白聚糖及其碳水化合物鏈(糖胺聚糖)顯示出結(jié)合很多不同的病原體。通過用唾液酸酶和其它外切糖苷酶，或者用單層細胞上的糖胺聚糖(GAG)降解酶，去除這些各種糖綴合物的末端碳水化合物部分，證明這些結(jié)構(gòu)是各種唾液酸粘附素和硫酸乙酰肝素結(jié)合蛋白(HeBPs)的受體分子。在SiiriHirmo，MeemeUtt和TorkelWadstr6m,Biology,Biochemistry,ClinicalBiochemistry,Volume12,包括Proceedingsfromthe17thInternationalLectinMeetinginWtirzburg,1997,editedbyEdilbertvanDriessche,SoniaBeeckmansandThorkildC.B0g-Hansen，由TEXTOP,Lemchesvej11，DK-2900Hellerup，Denmark,ISBNnumber87-984583-0-2出版，這篇綜述文章中總結(jié)了這些機制。在微生物感染過程中釋放并激活炎癥介質(zhì)。這些所謂的"致炎細胞因子(proinflammatorycytokine)"包4舌腫瘤壞死因子a和(3(TNF-a和TNF-卩)、白細胞介素-1(IL-1)和白細胞介素-6(IL-6)。這些細胞因子是膿血癥(sepsis)的炎癥反應(yīng)的一部分。由膿血癥導(dǎo)致的多器官衰竭現(xiàn)在是重病監(jiān)護病房(intensivecareunit)中死亡的主要因素。與微生物感染和心血管外科手術(shù)(例如心肺轉(zhuǎn)流術(shù)(cardiopulmonarybypass))相關(guān)，會引起炎癥響應(yīng)，并產(chǎn)生很多生物學(xué)后果，從亞臨床器官功能障礙到嚴重的多器官衰竭。細胞因子被認為是這種響應(yīng)中重要的調(diào)節(jié)子。上面提到的細胞因子具有與一些糖胺聚糖或GAG選擇性結(jié)合的能力，所述糖胺聚糖包括組織中和內(nèi)皮細胞與白細胞表面上的硫酸乙酰肝素(heparansulfate)。愛伴硫酸乙酰肝素是存在于幾乎所有哺乳動物細胞表面的糖胺聚糖。通過交替的(altemating)D-葡萄糖胺和糖醛酸殘基(L-艾杜糖醛酸和D-葡萄糖醛酸)構(gòu)建硫酸乙酰肝素。硫酸乙酰肝素是高荷電的(highlycharged)(硫酸化)的異源多糖，并代表細胞表面上很多糖綴合物(多配體聚糖(syndecan)、基底膜蛋白多糖(perlecan)、磷脂酰肌醇聚糖(glypican))的碳水化合物部分。很多微生物利用哺乳動物細胞表面上的硫酸乙酰肝素作為受體。這種機制對于幾乎所有細菌、病毒和寄生蟲是通用和有效的。一些微生物使用不止一種糖綴合物受體?？梢耘c硫酸乙酰肝素一起使用的其它受體的實例是特定的^5危酸軟骨素和包含糖蛋白的唾液酸。通過下述示例性說明結(jié)合硫酸乙酰肝素/硫酸軟骨素的微生物病毒，如單純皰滲病毒1型(herpessimplexvirustypeI)(HSV畫1)，口唇皰滲(orolabialherpes)的成因劑(causativeagent);單純皰滲病毒2型(HSV-2),生殖器皰滲的成因劑；細胞巨化病毒(cytomegalovirus)(CMV),使免疫抑制病人中的主要并發(fā)劑(complicatingagent);登革熱病毒(denguevirus),其導(dǎo)至丈反復(fù)發(fā)熱；和人免疫缺陷病毒(HIV);和細菌，如幽門螺桿菌(//6//<^^"^p_y/oW)、血鏈球菌(浙e/tococcuss朋gwz》、變異鏈球菌(5^e/tococcwsw、金黃色葡萄球菌(Sto//zy/ococcusaw/^ws)、大腸4干菌(￡^c/zen'c/z/acz7/)、4同纟錄4叚單月包菌(/^ewt/owowosaen^/wc^a)和結(jié)核分枝軒菌(A^co6a"en.i/w勵ercw/os7》；和寄生蟲，如惡性癥原蟲(/7oswc^/wm/a/(^www)(導(dǎo)致疾疾(malaria)),和克氏4偉蟲(r^pawwowacrwz/)(導(dǎo)致4,蟲病(Trypanosomiasis))。另夕卜，細胞因子(cytokine),如TNF-P,也使用細胞表面上的硫酸乙酰肝素來結(jié)合和激活。肝素是多糖，其分離自哺乳動物組織。自從由美國科學(xué)家McLean于1916年發(fā)現(xiàn)以來，已經(jīng)確認肝素的抗凝血劑(bloodanticoagulant)性質(zhì)，而且肝素在臨床上用作抗凝血劑和抗血栓形成劑(antithromboticagent)已經(jīng)超過了50年。硫酸乙酰肝素是所有由組織構(gòu)成的動物生命形式中普遍存在的組分，而肝素在哺乳動物組織中有非常特定的分布。與硫酸乙酰肝素相反，肝素只存在于肥大細胞(mastcell)的嗜堿顆粒中。然而，今天，除了已確定具有預(yù)防和治療血栓栓塞的作用之外，已經(jīng)證明肝素具有獨立于抗凝血的廣譜的不同活性。血液中大量的蛋白與肝素和/或硫酸乙酰肝素以高的親和力結(jié)合。實例是抗凝血酶(antithrombin)(AT)、纖連蛋白(fibronectin)、J皮璃粘連蛋白(vitronectin)和生長因子(growthfactor)(例如成纖維細胞(fibroblast)生長因子、月夷島素樣生長因子等)。人血清白蛋白(HSA)也可以結(jié)合，但親和力較低。另一方面，血液中存在大量的HSA。為了使用肝素的這些性質(zhì)來阻止感染，預(yù)期將肝素片段和/或包含唾液酸的片段(sialiccontainingfragment)引入血管系統(tǒng)。因此，i人為這些片段將結(jié)合微生物上的凝集素，阻斷凝集素并由此阻礙其與哺乳動物細胞表面上的受體結(jié)合。很多科學(xué)家嘗試了這個概念，但是成功有限，在大多數(shù)情況中是因為將大量肝素引入血管系統(tǒng)時的出血并發(fā)癥。US6,197,5687>開了基于蟲々某病毒(flaviviruse)和出血熱病毒(hemorrhagicfevervims)的硫酸化聚陰離子依賴性相互作用，用于分離和檢測蟲媒病毒和其它出血熱病毒(如登革熱病毒)的方法?？梢栽诟鞣N臨床情況，包括腎透析、心肺轉(zhuǎn)流術(shù)和血漿去除術(shù)中使用體外設(shè)備。"體外治療，，指可以向體液中加入如氧氣、抗凝血劑、麻醉劑等期望產(chǎn)物的過程。反之，可以在體外從體液中去除不期望的產(chǎn)物，如毒素等。實例是血液透析(haemodialysis)和血液過濾(hemofiltration)，其代表/人廢產(chǎn)物中漂洗血液的技術(shù)。發(fā)明概述本發(fā)明的目的是提供通過從患有疾病或病癥的哺乳動物血液中去除病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)來治療所述哺乳動物方法，所述疾病或病癥由不同的病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)引起或加重。本發(fā)明的另一個目的是提供從哺乳動物血液中體外去除病原;微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)的方法。研究了下面的描述后，上述目的以及本發(fā)明的其它目的，對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員是顯而易見的，所述目的通過本文所述的本發(fā)明的不同方面來實現(xiàn)。本發(fā)明的第一方面提供從哺乳動物血液體外去除病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)的方法，其包含步驟a)提供哺乳動物血液的樣品，b)在允許血液樣品中的任何病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)與碳水化合物結(jié)合的條件下，使所述樣品與固定于固體基質(zhì)上的碳水化合物接觸，所述碳水化合物對于病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)具有結(jié)合親和力，c)從固體基質(zhì)分離樣品，使所述病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)至少部分保留于所述底物上，和d)回收所述樣品，其包含的所述病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)的量降低。將肝素片段和/或包含唾液酸的片段引入病人的血管系統(tǒng)，這個現(xiàn)有技術(shù)概念已經(jīng)顯示了有限的成功，在大多數(shù)情況下是因為將大量肝素引入血管系統(tǒng)時的出血并發(fā)癥。根據(jù)本發(fā)明的方法通過固定于固體表面上的碳水化合物避免了這些問題，尤其如制備實施例6中所述。的優(yōu)勢。發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，必須將碳水化合物固定在固體表面上，使其具有結(jié)合大量待去除的化合物所必需的能力。HSV-1的實施例1和比較實施例1中描述了這種意想不到的性質(zhì)，其顯示在溶液中，少于3%的病毒與過量肝素結(jié)合(比較實施例1)，而超過94%的病毒與固定化的肝素結(jié)合(實施例1)。本發(fā)明的方法通過從病人血流中去除導(dǎo)致病癥的病原，能夠?qū)加心撗Y和膿血性休克的病人進行安全有效的治療。本發(fā)明的方法允許去除很多不同的病原微生物、炎性細胞和炎性蛋白質(zhì)?？梢允褂帽景l(fā)明的方法去除的通常與膿血癥有關(guān)的病原微生物的實例包括葡萄球菌屬，比如金黃色葡萄球菌，鏈球菌屬和大腸桿菌。因為肝素和硫酸乙酰肝素都結(jié)合于大量組分，如背景部分例示的，所以期望的是當(dāng)接觸血液時用這些蛋白中的多種覆蓋肝素表面，/人而防止孩i生物附著。本發(fā)明的發(fā)明人令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，使用根據(jù)本發(fā)明的方法和設(shè)備，可以實現(xiàn)乂人哺乳動物(包括人)高效地純化血清和全血。本文公開了使用中等大小的柱，以從血清和全血中幾乎完全去除相當(dāng)量的病毒。參見例如實施例2、3和4。在實施方案中，所述病原微生物選自下組細菌、病毒和寄生蟲。在實施方案中，所述病原微生物是病毒。在更具體的實施方案中，所述病毒選自下組單純皰滲病毒1型、單純皰滲病毒2型、A型流感病毒(influenzaAvirus)、細胞巨化病毒和人免疫缺陷病毒。在另一個更具體的實施方案中，所述病毒選自下組單純皰疹病毒1型或單純皰疹病毒2型。在另一個實施方案中，所述病原微生物是細菌。在更具體的實施方案中，所述細菌選自下組幽門螺桿菌、血鏈球菌、變異鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和結(jié)核分枝桿菌。在優(yōu)選實施方案中，所述病原孩t生物是幽門螺桿菌或金黃色葡萄球菌。在另一個實施方案中，所述病原微生物是寄生蟲。在更具體的實施方案中，所述寄生蟲選自下組惡性瘧原蟲和克氏錐蟲。在又一個的實施方案中，所述炎性細胞選自下組炎性淋巴細胞和炎性巨p藍細月包。在又一個的實施方案中，所述炎性蛋白質(zhì)是致炎細胞因子。在更具體的實施方案中，所述致炎細胞因子選自下組腫瘤壞死因子a(TNF-a)、腫瘤壞死因子卩(TNF-p)、白細胞介素-1(IL-1)和白細胞介素-6(IL-6)。在實施方案中，所述哺乳動物血液是人血。在本發(fā)明方法的實施方案中，所述碳水化合物選自下組肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、包含唾液酸(sialicacid)的碳水化合物和包含神經(jīng)氨酸(neuramicacid)的碳水化合物。在更具體的實施方案中，所述碳水化合物是肝素。在另一個實施方案中，所述固體基質(zhì)包含微粒或中空纖維。在本發(fā)明的一些實施方案中，所述固體基質(zhì)的材料選自下組玻璃、纖維素、醋酸纖維素、殼多糖、殼聚糖、交聯(lián)的葡聚糖、交聯(lián)的瓊脂糖、聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚丙烯腈、有機硅(silicone)、特氟隆(Teflon)和聚氨酯。在又一個實施方案中，所述碳水化合物與所述固體基質(zhì)共價結(jié)合。在更具體的實施方案中，所述碳水化合物通過共價端點附4妄(covalentend-pointattachment)結(jié)合于所述固體基質(zhì)。與非共價附接相比，碳水化合物與固體基質(zhì)的共價附接提供對參數(shù)(如固定化分子的表面密度和取向)的較好控制。發(fā)明人已經(jīng)顯示，這些參數(shù)對于提供病原與固定化碳水化合物分子的最優(yōu)結(jié)合是重要的。固體基質(zhì)上碳水化合物的表面濃度應(yīng)該優(yōu)選為1-10pg/cn^的范圍。共價端點本發(fā)明的第二方面提供包含固定在固體基質(zhì)上的碳外乳動物血液中體外去除所述病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)的用途，所述碳水化合物對于病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)具有結(jié)合親和力。根據(jù)本發(fā)明第二方面的用途的實施方案對應(yīng)于上面詳明的根據(jù)本發(fā)明的第一方面的方法的關(guān)于病原微生物、炎性細胞、炎性蛋白質(zhì)、哺乳動物血液、碳水化合物、固體基質(zhì)和固定化的那些實施方案。第三方面，本發(fā)明提供對于病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)具有結(jié)蛋白質(zhì)引起或加重的病癥的設(shè)備中的用途，其中所述碳水化合物固定在固體基質(zhì)上。根據(jù)本發(fā)明第三方面的用途的實施方案對應(yīng)于上面詳明的根據(jù)本發(fā)明的第一方面的方法的關(guān)于病原微生物、炎性細胞、炎性蛋白質(zhì)、哺乳動物血液、碳水化合物、固體基質(zhì)和固定化的那些實施方案。在根據(jù)本發(fā)明的用途和方法中所指的設(shè)備可以包含用于體外處理病人(例如患腎衰竭的病人)的血液和血清的常規(guī)設(shè)備。已知在接觸體外循環(huán)醫(yī)療設(shè)備的血液中的局部血流型態(tài)(localbloodflowpattern)通過停滯區(qū)(stagnantzone)中血小板聚集(aggregation)和剪切活化(shearactivation)來影響血塊的形成。因此，應(yīng)該以不產(chǎn)生這些問題的方式設(shè)計本發(fā)明的第二、第三和第四方面所用的設(shè)備。在本發(fā)明的一些實施方案中使用的設(shè)備可以具有例如下述的性質(zhì)—血流為1-500ml/min的范圍，優(yōu)選5-250ml/min。_流動阻力寸氐。-其上固定有碳水化合物的基質(zhì)具有大的表面積，例如約0.1-1m2。-穩(wěn)定涂層(不向其接觸的血液泄漏碳水化合物)。-在設(shè)備中具有適當(dāng)?shù)难簞恿W(xué)性能(沒有停滯區(qū))。-最優(yōu)的生物相容性。這種設(shè)備可以用于根據(jù)本發(fā)明的用途或方法中，其非限制性實例是兒一牛血5克透才斤器(pediatrichaemoflowdialyzer)，t匕^口GambroAB,Sweden的PrismaM10血過濾器/透析器。還可以使用其它型號或類型的用于體外處理血液或血清的設(shè)備。本發(fā)明的第四方面提供治療患有由病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)引起或加重的病癥的哺乳動物受試者的方法，所述方法包含步驟a)從受試者提取血液，b)在允許病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)與碳水化合物結(jié)合的條件下，使提取的血液接觸包含固定于固體基質(zhì)上的碳水化合物的設(shè)備，所述碳水化合物對于病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)具有結(jié)合親和力，和c)將血液重新引入受試者的血流中，所述血液包含的所述病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)的量降低。在根據(jù)本發(fā)明的處理方法的實施方案中，血液的提取和重新引入以連續(xù)循環(huán)(continuousloop)的方式進行，所述循環(huán)包含受試者血流的一部分。根據(jù)本發(fā)明第四方面的治療方法的實施方案對應(yīng)于上面詳明的根據(jù)本發(fā)明的第一方面的方法的關(guān)于病原微生物、炎性細胞、炎性蛋白質(zhì)、哺乳動物血液、碳水化合物、固體基質(zhì)和固定化的那些實施方案。如本文所使用的，術(shù)語"病原孩i生物"指微生物，將其引入生物體時，能在所述活的生物體中引起疾病。"病原微生物"的實例包括細菌、病毒和寄生蟲。如本文所使用的，術(shù)語"炎性細胞"指細胞，其與哺乳動物中的炎癥響應(yīng)有關(guān)。"炎性細胞"的實例包括炎性淋巴細胞和炎性巨噬細胞。如本文所使用的，術(shù)語"炎性蛋白質(zhì)"指蛋白質(zhì)，如細胞因子，例如與微生物感染或免疫有關(guān)而釋放的細胞因子。如本文所使用的，術(shù)語"細胞因子"指蛋白質(zhì)，例如與微生物感染或免疫有關(guān)而釋放的蛋白質(zhì)，其選自下組白細胞介素、干擾素、趨化因子和腫瘤壞死因子。實施例制備實施例1SephadexG25的胺4匕(amination)將高石典酸鈉(sodiummetaperiodate)(NaI04,6.0g)溶于7^(994ml)中，并力口至11水中的SephadexG25(PharmaciaBiotech,Uppsala,Sweden)(50g)。卄夸';昆合物在黑暗中保持振蕩24小時。在過濾和用5x11水與最終0.1M的磷酸鹽緩沖液，pH7.0洗滌后，將得到的產(chǎn)物懸浮于磷酸鹽緩沖液，pH7.0(350ml)中，并加入聚乙烯亞胺(polyethylenimine)的溶液(100mlLupasol(BASF,Germany),在水中濃度為5%)。通過加入NaBH3CN即氰基硼氫化鈉的水溶液(100ml中0.5g，磷酸鹽緩沖液，0.1M，pH7.0)將凝膠穩(wěn)定化。將所述凝膠過濾并如上所述洗滌，最后用乙酸鹽緩沖液(500ml，0.1M，pH4.0)洗滌，產(chǎn)生胺化的SephadexG25(85g)。制備實施例2肝素共價端點附接于色譜凝膠(chromatographicgel)上將如制備實施例1中所述獲得的胺化的SephadexG25(85g)懸浮于乙酸鹽緩沖液(800ml，0.1M,pH4.0)中，并加入4.0g亞硝酸降解的肝素(Pharmacia，Sweden的肝素)。振蕩0.5小時后，加入NaBH3CN(0.4g)。將反應(yīng)混合物振蕩24小時，然后如上所述進行處理，得到肝素化SephadexG25(80g)。凝膠包含2。/。肝素(w/w，硫分析)。SephadexG25珠的平均直徑為50-150pm。粗略的計算顯示1cm3包含106個珠子，得到珠的表面積為0.03m2/cm3。此外，如果肝素僅附接于珠子的表面，則具有2%肝素w/w的肝素化SephadexG25具有大約0.003嗎肝素/cm2。制備實施例3將肝素共價附接于胺化玻璃絲(glasswool)上使用下述常用方法將玻璃絲材料肝素化。用酸(HC1)徹底清洗玻璃絲，用無水乙醇沖洗，在烘箱中在IO(TC干燥4小時。通過用聚胺、聚乙烯亞胺(PEI)或殼聚糖的水溶液處理，將反應(yīng)性氨基官能引至玻璃絲表面上。出于某些目的，可以通過與具有雙官能試劑(如巴豆醛或戊二醛)交聯(lián)將聚胺穩(wěn)定于表面上。通過與硫酸化的多糖(硫酸葡聚糖或肝素)進行離子交聯(lián)，進一步穩(wěn)定涂層。如果需要的話，重復(fù)這些步驟并建立夾層結(jié)構(gòu)(sandwichstructure)。每步之間應(yīng)該進行仔細的沖洗(水，合適的緩沖液)。在最后加入PEI或殼聚糖后，通過還原性的胺化，使用天然肝素的還原末端殘基中的醛官能，使天然肝素的胺化表面進行末端附接?；旧先缰苽鋵嵤├?中所述，通過還原性胺化(氰基硼氫化物CNBH/)在水溶液中進行偶連。如制備實施例2中所述的表面分析顯示，約10mg/cm"的肝素與玻璃表面偶連。制備實施例4肝素共價附接于胺化的聚合物表面上使用下面所述的常用步驟將聚合物表面肝素化。用氧化劑(高錳酸鉀、過氧化硫酸銨(ammoniumperoxidisulfate))侵蝕聚合物表面，以引入親水特征連同一些反應(yīng)性官能團(-S03H、-OH、-C=0、-C=C-)。表面也可以用等離子體或電暈侵蝕。通過用聚胺、聚乙烯亞胺(PEI)或殼聚糖處理來引入反應(yīng)性氨基官能。出于某些目的，可以通過與雙官能試劑(如巴豆醛或戊二醛)交聯(lián)，將聚胺穩(wěn)定于表面上。可以通過與硫酸化的多糖(硫酸葡聚糖或肝素)進行離子交聯(lián)，進一步穩(wěn)定涂層。如果需要的話，重復(fù)這些步驟并建立夾層結(jié)構(gòu)。每步之間應(yīng)該進刊-仔細的沖洗(水，合適的緩沖液)。在最后加入PEI或殼聚^t后，通過還原性的胺化，使用天然肝素的還原末端殘基中的醛官能，使天然肝素的胺化表面進行末端附接(EPA)。通過肝素的部分亞硝酸降解(nitrousdegradation),可以在還原末端殘基中獲得反應(yīng)性更好的醛官能。這縮短了反應(yīng)時間，但是固定化的肝素的分子量更小。基本上如制備實施例2中所述，通過還原性胺化(氰基硼氫化物CNBH/)在水溶液中進行偶連。l-10pg/cn^的肝素可偶連于所有親水表面，如玻璃、纖維素、殼多糖等，和大約所有疏水性聚合物，如聚氯乙烯、聚乙烯、聚碳酸酯、聚苯乙烯、PTFE等。制備實施例5肝素共價單點或多點附接于聚合物表面上如制備實施例2中所述進行，只是通過在水溶液中用高碘酸鈉氧化，將醛官能引入肝素鏈中。制備實施例6將肝素附接于中空纖維的內(nèi)腔上在這個制備實施例中，使用兒科血流透析器(pediatrichaemoflowdialyzer)。透析器的纖維由聚砜制成，內(nèi)徑200微米，壁厚40微米。血液接觸材料的總表面積為4000cm2，而預(yù)充容量(primingvolume)為28ml。如制備實施例4中的一般描述進行胺化過程，只是省略了侵蝕步驟。聚砜是親水的，不需要侵蝕。如制備實施例2所述，通過泵送包含亞硝酸降解的肝素(來自Pharmacia的肝素)與NaBH3CN的溶液，進行肝素的固定化。因為對肝素量的測量是破壞性步驟，所以犧牲了在同樣條件肝素化的參照透析器，將其纖維進行硫分析。結(jié)果顯示，肝素含量為約5嗎肝素/cm2，其對應(yīng)于設(shè)備中20mg肝素的含量。制備實施例7帶有末端唾液酸殘基的寡聚物共價附接于中空纖維的內(nèi)腔上在這個制備實施例中，使用還原性末端殘基上的醛基進行偶連。如制備實施例6中所述進行纖維的胺化，并通過將式I的化合物(其與NaBH3CN(0.4g)—起溶于乙酸緩沖液(800ml，0.1M，pH4.0)中)在室溫循環(huán)24小時，來進行式I的寡糖的偶連，所述寡糖包含末端唾液酸殘基。結(jié)果顯示唾液酸的含量為約2嗎/cm2。H悉uA感30,i-40k進拳、、6I、/3N悉uAeo3-30孝.40!e隨拳-2滅,14比專交實施例1HSV-1與肝素在溶液中結(jié)合將包含107嗜菌斑形成單位的病毒(單純皰疹病毒1型菌抹KOS321)的溶液(IOpil)與總量為400pl的緩沖NaCl中20jil的3H-標記的石克酸乙酰肝素(HS)，在37。C溫育30分鐘。之后，將溶液通過Microsep1M過濾器離心，保留病毒和結(jié)合的硫酸乙酰肝素(HS)。2.3。/。的HS結(jié)合(479CPM)于病毒，而97.7%的HS未結(jié)合，且通過了過濾器。實施例1通過與固定于Sephadex珠子上的肝素結(jié)合，從緩沖鹽水(bufferedsaline)中去除HSV-1和HSV-2病毒顆粒如制備實施例2，將用肝素涂覆的Sephadex珠浸入緩沖的NaCl(PBS)中，并將0.8ml轉(zhuǎn)移至兩個小的一次性柱的每一個，形成約lcm的凝膠層。洗滌三次后，將50^的力-胸苷放射性標記的病毒懸浮于150pl的PBS中。將109嗜菌斑形成單位的HSV-l,其對應(yīng)于10"個病毒顆粒，加入柱1，而將108嗜菌斑形成單位的HSV-2，其對應(yīng)于101()個病毒顆粒，加入柱2。使病毒吸附于各柱。其后，向每個柱加入0.8ml的PBS,收集穿過流體(pass-throughfluid)用于估算未吸附的病毒。然后，用1ml的PBS將兩個柱洗滌4次，收集洗滌物(washing)作為用于定量洗出的病毒的級分。將這些，和下述級分，轉(zhuǎn)移至閃爍管(scintillationvial)，并根據(jù)在卩計數(shù)器中測定cpm來定量病毒的量。在下一步中，將柱用1ml的2MNaCl進行三次洗脫，洗脫各自結(jié)合了肝素的病毒，從每個柱收集三個級分。然后，通過兩次加入1ml的PBS中5°/。SDS(PBS-SDS)進行洗脫，并從每個柱收集兩個級分。最后，將來自兩個柱的肝素涂覆珠各自懸浮于1ml的PBS-SDS中，并通過測定放射性對200(il的等分試樣進行剩余的結(jié)合病毒顆粒的定量。結(jié)果示于下面的表1中。如表所示，只有5.5%的HSV-1顆粒和11.7%的HSV-2顆粒沒有吸附于柱。此外，因為用放射性標記的是病毒DNA而不是它們的結(jié)合肝素的蛋白，所以這些未吸附的顆?？梢源砭哂衅扑橥鈿さ姆歉腥拘圆《?即，結(jié)合肝素的病毒的外部易碎部分)。其余病毒(對于HSV-1是94.5%，而對于HSV-2是88.3%)結(jié)合于柱中涂覆肝素的珠子。從下述事實判斷結(jié)合表現(xiàn)得很強通過4次連續(xù)洗滌，只去除了0.5%的HSV-1和1.1%的HSV-2。2MNaCl在3次連續(xù)的嘗試中洗脫病毒的有限能力，著重說明了兩種病毒與涂覆肝素的珠子的結(jié)合具有高親和力的特征。相反，通過PBS-SDS洗脫大量的HSV-1和HSV-2。從柱中回收總共48%的HSV-1和68.8%的HSV-2。這可歸因于如下事實根據(jù)我們過去的觀察，2MNaCl將樣品的放射性自發(fā)地降低約30%,而SDS-PBS可能也有這種作用?？傊?，結(jié)果證明了如下原則能通過流經(jīng)包含肝素涂覆的Sephadex珠的短柱將HSV-1和HSV-2病毒顆粒從流體相去除，并將提取的病毒以高親和力與柱結(jié)合。表1.懸浮于緩沖NaCl中的放射性標記的HSV病毒顆粒與肝素-Sephadex珠子結(jié)合。HSV與肝素柱的結(jié)合<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>實施例2通過與固定于Sephadex珠子上的肝素結(jié)合從人血清中去除HSV-l病毒顆粒使用如實施例1中所述的實驗方法，區(qū)別是將放射性標記的HSV-1病毒顆粒以109PFU(相當(dāng)于1011個病毒顆粒)的量與0.5ml的人血清混合，然后施加于一次性柱中的涂覆肝素的珠子上。其后，如實施例1進行包括洗脫和洗滌的過程。結(jié)果示于下面的表2中。表2.懸浮于人血清中的放射性標記的HSV-1病毒顆粒(10")與肝素畫Sephadex珠子(lcm3)結(jié)合。_<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>如表所示，懸浮于人血清中的HSV-1顆粒的97.6%與柱結(jié)合。通過4次洗滌，只去除了3.8%的病毒顆粒。使用2MNaCl，只洗脫了2.7%的病毒，通過SDS洗脫又得到3.5%。這些結(jié)果的結(jié)論是在血清中懸浮病毒(其為嚴重播散感染(severe,disseminatedinfection)過程中的真實狀況)在與放射性標記病毒的結(jié)合方面改進了去除病毒的柱子的性能，只有2.4%的HSV-1顆粒未被吸附。作為可能的解釋，血清蛋白幫助穩(wěn)定病毒顆粒，從而改進了通過肝素化的Sephadex珠子去除HSV-1。實施例3通過與固定于中空纖維血流透析器上的肝素結(jié)合從人血清中去除HSV-1病毒顆粒使用如實施例1中所述的實驗步驟，區(qū)別是將放射性標記的HSV-1病毒顆粒以109PFU(相當(dāng)于1011個病毒顆粒)的量與0.5ml的人血清混合，然后施加于制備實施例6中涂覆肝素的中空纖維透析器。其后，如實施例1進行包括洗脫和洗滌的過程。結(jié)果示于下面的表3中。如表所示，懸浮于人血清中的HSV-1顆粒的92.3%與柱結(jié)合。通過4次洗滌，只去除了4.2%的病毒顆粒。用2MNaCl，只洗脫得到4.0%的病毒，用SDS洗脫又得到4.5%。這些結(jié)果的結(jié)論是，懸浮于人血清中的病毒顆粒與肝素化的纖維的結(jié)合，與類似懸浮的病毒與涂覆肝素的Sephadex珠子的結(jié)合是可比較的(comparable)，只有7.7%的HSV-1顆粒未被吸附。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>通過與固定于S印hadex珠子上的肝素結(jié)合從人全血中去除HSV-1和HSV-2病毒顆粒使用如實施例1中所述的實驗步驟，區(qū)別是將放射性標記的HSV-1和HSV-2病毒顆粒以相當(dāng)于每毫升10"個病毒顆粒的量與1ml的人血混合，然后施加于一次性柱中l(wèi)ml涂覆肝素的珠子。其后，如實施例l進行包括洗脫和洗滌的過程。結(jié)果示于下面的表4中。如表所示，人血中懸浮的99.1%的HSV-1顆粒和99.8%的HSV-2顆粒結(jié)合于柱子。表4.懸浮于人血中的放射性標記的HSV病毒顆粒與肝素-Sephadex珠(lcm"結(jié)合。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>實施例5通過與包含唾液酸的固定化寡糖結(jié)合從人血清中去除A型流感病毒在MDCK細胞中復(fù)制A型流感病毒//77W的病毒原種(virusstock),所述細胞在標準條件下于35。C生長3天，然后將細胞均質(zhì)化(homogenize)并滴定以評價病灶形成單位(focusformingunit)的數(shù)目(FFU)/ml。將病毒顆粒懸浮于人血清中，至106FFU/ml的終濃度。將10ml的懸浮液施加于涂覆唾液酸的中空纖維透析器上，所述透析器使用制備實施例7中所述方法制備。通過滴定法測定通過透析器之后的包含A型流感病毒的血清的感染性，并將其與未通過該設(shè)備的包含相同病毒的血清等分試樣的效價(titer)進行比較，其后得出結(jié)論，87%的A型流感病毒FFU保持與纖維結(jié)合。實施例6通過與固定化肝素結(jié)合去除幽門螺桿菌和金黃色葡萄球菌將四支無菌吸管充滿玻璃絲(0.5ml),所述玻璃絲如制備實施例3所述肝素化。由此形成的"柱"用3ml無菌磷酸鹽鹽水緩沖液(PBS)，pH7.2洗滌。測試兩抹不同的幽門螺桿菌菌抹和兩抹不同的金黃色葡萄球菌菌株。懸浮于PBS緩沖液中的四個不同的細菌樣品，每個都施加于單獨的"柱"。在施加于柱之前和從柱洗脫之后，通過560nm處的光密度(OD)和活菌計數(shù)(CFU/ml)測定樣品中的細菌量。>^人下表中可明顯看出，約90%的幽門螺桿菌和約50%的金黃色葡萄球菌被固定在柱上。表6.幽門螺桿菌和金黃色葡萄球菌與肝素化玻璃絲的結(jié)合。<table>tableseeoriginaldocumentpage22</column></row><table>權(quán)利要求1.用于從哺乳動物血液中體外去除病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)的方法，其包含步驟a)提供哺乳動物血液的樣品，b)在允許所述血液樣品中的任何病原微生物、炎性細胞和炎性蛋白質(zhì)與碳水化合物結(jié)合的條件下，使所述樣品與固定在固體基質(zhì)上的碳水化合物接觸，所述碳水化合物對于病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)具有結(jié)合親和力，c)從固體基質(zhì)分離樣品，使所述病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)至少部分地保留在固體基質(zhì)上，和d)回收所述樣品，其包含的所述病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)的量減少。2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述病原微生物選自下組細菌、病毒和寄生蟲。3.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項的方法，其中所述病原微生物是病毒。4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述病毒選自下組單純皰滲病毒1型、單純皰滲病毒2型、A型流感病毒、細胞巨化病毒和人免疫缺陷病毒。5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述病毒選自下組單純皰滲病毒l型和單純皰滲病毒2型。6.根據(jù)權(quán)利要求1-2中任一項的方法，其中所述病原微生物是細菌。7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述細菌選自下組幽門螺桿菌、血鏈球菌、變形鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和結(jié)核分枝桿菌。8.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述細菌是幽門螺桿菌或金黃色葡萄球菌。9.根據(jù)權(quán)利要求1至2中任一項的方法，其中所述病原微生物是寄生蟲。10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述寄生蟲選自下組惡性癡原蟲和克氏錐蟲。11.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的方法，其中所述炎性細胞選自下組炎性淋巴細胞和炎性巨噬細胞。12.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的方法，其中所述炎性蛋白質(zhì)是致炎細胞因子。13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述致炎細胞因子選自下組腫瘤壞死因子a(TNF-a)、腫瘤壞死因子(3(TNF-(3)、白細胞介素-1(IL-1)和白細胞介素-6(IL-6)。14.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的方法，其中所述哺乳動物血液是人血液。15.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的方法，其中所述碳水化合物選自下組肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素、包含唾液酸的碳水化合物和包含神經(jīng)氨酸的碳水化合物。16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述碳水化合物是肝素。17.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的方法，其中所述固體基質(zhì)包含微粒。18.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的方法，其中所述固體基質(zhì)包含一種或多種中空纖維。19.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的方法，其中所述固體基質(zhì)的材料選自下組玻璃、纖維素、醋酸纖維素、殼多糖、殼聚糖、交聯(lián)的葡聚糖、交聯(lián)的瓊脂糖、聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚丙烯腈、有機硅、特氟隆和聚氨酯。20.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的方法，其中所述碳水化合物共價結(jié)合于所述固體基質(zhì)。21.根據(jù)任一項前述權(quán)利要求的方法，其中所述碳水化合物通過共價端點附接結(jié)合于所述固體基質(zhì)。22.包含固定于固體基質(zhì)上的碳水化合物的設(shè)備用于從哺乳動物血液中體外去除病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)的用途，所述碳水化合物對于病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)具有結(jié)合親和力。23.對于病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)具有結(jié)合親和力的碳水化合物在制備用于治療由病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)引起或加重的病癥的設(shè)備中的用途，其中將所述碳水化合物固定于固體基質(zhì)上。24.根據(jù)權(quán)利要求22-23中任一項的用途，其中所述病原微生物選自下組細菌、病毒和寄生蟲。25.根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其中所述病原微生物是病毒。26.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述病毒選自下組單純皰瘆病毒1型、單純皰滲病毒2型、A型流感病毒、細胞巨化病毒和人免疫缺陷病毒。27.根據(jù)權(quán)利要求26的用途，其中所述病毒選自下組單純皰滲病毒1型和單純皰瘆病毒2型。28.根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其中所述病原微生物是細菌。29.根據(jù)權(quán)利要求28的用途，其中所述細菌選自下組幽門螺桿菌、血鏈球菌、變異鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和結(jié)核分枝桿菌。30.根據(jù)權(quán)利要求29的用途，其中所述細菌是幽門螺桿菌或金黃色葡萄球菌。31.根據(jù)權(quán)利要求24的用途，其中所述病原微生物是寄生蟲。32.根據(jù)權(quán)利要求31的用途，其中所述寄生蟲選自下組惡性癥原蟲和克氏4,蟲。33.根據(jù)權(quán)利要求22-32中任一項的用途，其中所述炎性細胞選自下組炎性淋巴細胞和炎性巨噬細胞。34.根據(jù)權(quán)利要求22-32中任一項的用途，其中所述炎性蛋白質(zhì)是致炎細胞因子。35.根據(jù)權(quán)利要求34的用途，其中所述致炎細胞因子選自下組腫瘤壞死因子a(TNF-a)、腫瘤壞死因子卩(TNF-p)、白細胞介素-1(IL-1)和白細胞介素-6(IL-6)。36.根據(jù)權(quán)利要求22-35中任一項的用途，其中所述哺乳動物血液是人血液。37.根據(jù)權(quán)利要求22-36中任一項的用途，其中所述碳水化合物選自下組肝素、石克酸乙酰肝素、石克酸軟骨素、包含唾液酸的石友水化合物和包含神經(jīng)氨酸的碳水化合物。38.根據(jù)權(quán)利要求37的用途，其中所述碳水化合物是肝素。39.根據(jù)權(quán)利要求22-38中任一項的用途，其中所述固體基質(zhì)包含微粒。40.根據(jù)權(quán)利要求22-39中任一項的用途，其中所述固體基質(zhì)包含一種或多種中空纖維。41.根據(jù)權(quán)利要求22-40中任一項的用途，其中所述固體基質(zhì)選自下組玻璃、纖維素、醋酸纖維素、殼多糖、殼聚糖、交聯(lián)的葡聚糖、交聯(lián)的瓊脂糖、聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚丙烯腈、有機硅、特氟隆和聚氨酯。42.治療哺乳動物受試者的方法，所述哺乳動物受試者患有由病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)引起或加重的病癥，所述方法包含步驟a)從受試者提取血液，b)在允許病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)與碳水化合物結(jié)合的條件碳水化合物對于病原-欽生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)具有結(jié)合親和力，和c)將血液重新引入受試者的血流，所述血液中包含的所述病原;徵生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)的量減少。43.根據(jù)權(quán)利要求42的方法，其中以連續(xù)循環(huán)的方式進行血液的提取和重新引入，所述循環(huán)包含受試者的部分血流。44.根據(jù)權(quán)利要求42-43中任一項的方法，其中所述病原微生物選自下組細菌、病毒和寄生蟲。45.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所述病原微生物是病毒。46.根據(jù)權(quán)利要求45的方法，其中所述病毒選自下組單純皰滲病毒1型、單純皰滲病毒2型、A型流感病毒、細胞巨化病毒和人免疫缺陷病毒。47.根據(jù)權(quán)利要求46的方法，其中所述病毒選自下組單純皰瘆病毒1型和單純皰滲病毒2型。48.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所述病原微生物是細菌。49.根據(jù)權(quán)利要求48的方法，其中所述細菌選自下組幽門螺桿菌、血鏈球菌、變異鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌和結(jié)核分枝桿菌。50.根據(jù)權(quán)利要求49的方法，其中所述細菌是幽門螺桿菌或金黃色葡萄球菌。51.根據(jù)權(quán)利要求44的方法，其中所述病原微生物是寄生蟲。52.根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述寄生蟲選自下組惡性瘧原蟲和克氏4偉蟲。53.根據(jù)權(quán)利要求42-52中任一項的方法，其中所述炎性細胞選自下組炎性淋巴細胞和炎性巨噬細胞。54.根據(jù)權(quán)利要求42-53中任一項的方法，其中所述炎性蛋白質(zhì)是致炎細胞因子。55.根據(jù)權(quán)利要求54的方法，其中所述致炎細胞因子選自下組腫瘤壞死因子a(TNF-a)、胂瘤壞死因子p(TNF-P)、白細胞介素-1(IL-1)和白細胞介素-6(IL-6)。56.根據(jù)權(quán)利要求42-55中任一項的方法，其中所述碳水化合物選自下組肝素、硫酸乙酰肝素、硫酸軟骨素，以及包含唾液酸的碳水化合物和包含神經(jīng)氨酸的碳水化合物。57.根據(jù)權(quán)利要求56的方法，其中所述碳水化合物是肝素。58.根據(jù)權(quán)利要求42-57中任一項的方法，其中所述固體基質(zhì)包含微粒。59.根據(jù)權(quán)利要求42-58中任一項的方法，其中所述固體基質(zhì)包含一種或多種中空纖維。60.根據(jù)權(quán)利要求42-59中任一項的方法，其中所述固體基質(zhì)選自下組玻璃、纖維素、醋酸纖維素、殼多糖、殼聚糖、交聯(lián)的葡聚糖、交聯(lián)的瓊脂糖、聚丙烯、聚乙烯、聚砜、聚丙烯腈、有機硅、特氟隆和聚氨酯。全文摘要本發(fā)明涉及從哺乳動物血液中體外去除病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)的方法/包含固定在固體基質(zhì)上的碳水化合物的設(shè)備用于從哺乳動物血液中體外去除所述病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)的用途，所述碳水化合物對于病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)具有結(jié)合親和力/對于病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)具有結(jié)合親和力的碳水化合物在制備用于治療由所述病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)引起或加重的病癥的設(shè)備中的用途，其中所述碳水化合物固定在固體基質(zhì)上/和用于治療患有由病原微生物、炎性細胞或炎性蛋白質(zhì)引起或加重的病癥的哺乳動物受試者的方法。文檔編號A61K31/70GK101370536SQ200680052757公開日2009年2月18日申請日期2006年12月13日優(yōu)先權(quán)日2005年12月13日發(fā)明者奧爾·拉姆,托馬斯·伯格斯特羅姆申請人:埃克塞拉有限責(zé)任公司