本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種從動(dòng)物組織得到的蛋白以及在生物制藥中的用途。

背景技術(shù)：
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兩棲動(dòng)物一直以來(lái)都是傳統(tǒng)藥物的源泉。很多兩棲類動(dòng)物作為中國(guó)傳統(tǒng)中藥和民族藥物被廣泛應(yīng)用。如中華蟾蜍(Bufo gargarizans)，大蹼鈴蟾(Bombina maxima)，黑斑蛙(Pelophylax nigromaculata)和澤蛙(Euphlyctis limnocharis)等。這些兩棲類動(dòng)物的皮膚和內(nèi)臟具有廣泛的藥理活性和臨床療效。已報(bào)道藥理活性有：抗微生物、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、局部麻醉、免疫調(diào)節(jié)、促傷口愈合等(Chem Rev.2015,115(4):1760-1846)。因此，兩棲類皮膚特定藥理活性單體化合物的尋找已是新藥發(fā)明的熱點(diǎn)。從爪蟾(Xenopus laevis)皮膚分泌物獲得的活性多肽Magainin具廣譜抗微生物作用，同時(shí)具有抗腫瘤活性，在美國(guó)已獲準(zhǔn)作為廣譜抗菌藥物，其基因工程產(chǎn)品已經(jīng)作為抗菌藥物被Microbiological biotech公司用于治療糖尿病人足部潰瘍(Curr Protein Pept Sci,2012,13(8):723-738)。

抗菌肽是蛙類皮膚眾多活性物質(zhì)中的一種。與傳統(tǒng)的抗生素，例如青霉素、紅霉素和鏈霉素相比，抗菌肽不但具有廣譜的抗微生物活性，同時(shí)具有“傳統(tǒng)抗生素”無(wú)法比擬的優(yōu)越性：如，除了可以直接殺滅微生物和很難誘導(dǎo)菌株產(chǎn)生耐藥性外，抗菌肽還可以調(diào)節(jié)宿主的免疫、抑制炎癥反應(yīng)，間接地在感染性疾病治療中發(fā)揮作用(Nat Rev Microbiol,2012,10(4):243-254)。此外，在嚴(yán)重細(xì)菌感染時(shí)，抗菌肽還能夠中和內(nèi)毒素、減輕膿毒癥，在快速殺滅病原微生物的同時(shí)迅速停止或限制感染擴(kuò)散(Antimicrob Agents Chemother,2014,58(9):5363-5371)。此外，部分抗菌肽除有抗菌功能外，還兼有免疫調(diào)節(jié)、組胺釋放和促傷口愈合等功能，如，esculentin-2Cha、frenatin 2D、dersonin-D1、B2RP-Era能調(diào)節(jié)細(xì)胞因子的合成；Pipinin、XO-4、pLR、pYR和HR-II等有顯著的促肥大細(xì)胞脫粒和組胺釋放功能(Chem Rev.2015,115(4):1760-1846)；因此，抗菌肽有希望成為新一代抗微生物藥物。近年來(lái)，隨著“傳統(tǒng)抗生素”的濫用，微生物抗藥性已成為臨床微生物感染疾病治療的重大問(wèn)題，以至于某些病原細(xì)菌已沒(méi)有臨床治療的一線藥物。萬(wàn)古霉素抗性的葡萄球菌、腸球菌以及其他革蘭氏陰性感染疾病目前均是世界范圍內(nèi)的臨床難題，三類主要引起腦膜炎的細(xì)菌在臨床上也出現(xiàn)了強(qiáng)的抗藥性，抗青霉素、氯霉素腦膜炎雙球菌、肺炎球菌，對(duì)抗新頭孢菌素抗生素的肺炎球菌也廣泛出現(xiàn)。因此新一類抗生素的研制已成為當(dāng)務(wù)之急和國(guó)際上的熱點(diǎn)。正是由于此，國(guó)際上許多大公司都大規(guī)模開(kāi)展抗菌肽的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用研究。截至目前，至少有20種從不同生物分離得到的活性多肽候選藥物進(jìn)入了臨床試驗(yàn)階段(Future Med Chem,2013,5(3):315-337)。如，Xoma公司研發(fā)的用于治療腦膜炎球菌血癥的孤兒藥Neuprex和Cutanea life science公司研發(fā)的用于治療紅斑痤瘡的Omiganan外用乳膏均進(jìn)入三期臨床研究(Curt Protein Pept Sci,2012,13(7):611-619)；另外，Ellceutix公司研發(fā)的用于治療MRSA引起的皮膚感染藥物PMX-30063已經(jīng)進(jìn)入開(kāi)發(fā)臨床前研究(Expert Rev Anti Infect Ther,2014,12(12):1477-1486)。

作為新藥發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)新的源泉，新結(jié)構(gòu)天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)和復(fù)雜化合物的高效制備一直是天然產(chǎn)物藥物研究的核心。進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，基因組學(xué)的飛速發(fā)展及合成生物學(xué)的興起大大促進(jìn)了天然產(chǎn)物的生物結(jié)構(gòu)與功能研究(Future Med Chem,2013，5(3)；315-337)；花姬蛙(Microhyla pulchra)是傳統(tǒng)中藥材和受國(guó)家保護(hù)的有重要經(jīng)濟(jì)和科學(xué)研究?jī)r(jià)值的陸生野生動(dòng)物，其成體被白酒內(nèi)浸泡或加酒搗敷后能用于治療骨折、腰痛、風(fēng)濕痹痛、體弱無(wú)力、跌打損傷、瘡癰潰后化膿和久不封口等多種病癥。但是由于花姬蛙個(gè)體小和捕捉困難，目前對(duì)其皮膚藥理活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能研究在世界范圍內(nèi)還未見(jiàn)報(bào)道，其作為中藥療效的物質(zhì)基礎(chǔ)仍不為人們所知。

本發(fā)明利用基因組學(xué)方法和藥理學(xué)研究獲得花姬蛙抗菌肽編碼基因，發(fā)明人將本發(fā)明的花姬蛙抗菌肽編碼基因經(jīng)基因數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜尋比較，未發(fā)現(xiàn)有任何相同基因。發(fā)明人將本發(fā)明的花姬蛙抗菌肽全序列結(jié)構(gòu)經(jīng)蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行搜索比較未發(fā)現(xiàn)有任何相同的多肽。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
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本發(fā)明的目的是基于上述技術(shù)背景，提供種新的具有廣譜抗微生物(包括革蘭氏陰、陽(yáng)性細(xì)菌、真菌)和免疫調(diào)節(jié)活性的花姬蛙抗菌肽及其基因和它作為制備病原微生物感染性疾病的治療藥物應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：

一種花姬蛙抗菌肽，其特征在于，所述多肽的序列如SEQ ID No.1所示。

GRCNLLCKAKKKLRAVGNKIKEIKNVVFNR SEQ ID NO.1

一種編碼上述的花姬蛙抗菌肽的核苷酸。

一種花姬蛙抗菌肽，所述的花姬蛙抗菌肽由30個(gè)氨基酸組成的多肽，分子量3440.53道爾頓，等電點(diǎn)10.726，其氨基酸序列為：Gly Arg Cys Asn Leu Leu Cys Lys Ala Lys Lys Lys Leu Arg Ala Val Gly Asn Lys Ile Lys Glu Ile Lys Asn Val Val Phe Asn Arg(GRCNLLCKAKKKLRAVGNKIKEIKNVVFNR)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的其第三半胱氨酸和第七位半胱氨酸相成分子內(nèi)二硫鍵。

所述花姬蛙抗菌肽的編碼基因由462個(gè)核苷酸組成，自5’端至3’端序列為其序列為(SEQ ID NO.4)：

序列中第370-459位核苷酸編碼具有功能的成熟花姬蛙抗菌肽。

所述花姬蛙抗菌肽在制備病原微生物感染性疾病的治療藥物應(yīng)用。

所述花姬蛙抗菌肽在制備抗細(xì)菌的藥物中的用途，優(yōu)選地，所述細(xì)菌選自大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草桿菌、綠膿桿菌中的一種或多種。

所述花姬蛙抗菌肽在制備抗真菌的藥物中的用途，優(yōu)選地，所述真菌選自白色念珠菌、黃曲霉中的一種或多種。

本發(fā)明的有益效果在于:

由花姬蛙抗菌肽編碼基因推導(dǎo)其氨基酸結(jié)構(gòu)，合成的花姬蛙抗菌肽具有顯著的抑制細(xì)菌、真菌、病毒生長(zhǎng)和免疫調(diào)節(jié)作用。該花姬蛙抗菌肽具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、人工合成方便、抗菌譜系廣的有益特點(diǎn)。

附圖說(shuō)明：

圖1為本發(fā)明花姬蛙抗菌肽HPLC純化鑒定結(jié)果；

圖2為本發(fā)明花姬蛙抗菌肽質(zhì)譜鑒定結(jié)果；

圖3為本發(fā)明花姬蛙抗菌肽對(duì)肥大細(xì)胞組胺釋放的影響；

圖4為本發(fā)明花姬蛙抗菌肽對(duì)RAW 264.7細(xì)胞分泌INF-α的抑制作用；

圖5為本發(fā)明花姬蛙抗菌肽對(duì)RAW 264.7細(xì)胞分泌IL-10的促進(jìn)作用。

具體實(shí)施方式：

下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明：

本發(fā)明的花姬蛙抗菌肽，所述的花姬蛙抗菌肽由30個(gè)氨基酸組成的環(huán)肽，分子量3440.53道爾頓，等電點(diǎn)10.726，其氨基酸序列為：Gly Arg Cys Asn Leu Leu Cys Lys Ala Lys Lys Lys Leu Arg Ala Val Gly Asn Lys Ile Lys Glu Ile Lys Asn Val Val Phe Asn Arg(GRCNLLCKAKKKLRAVGNKIKEIKNVVFNR)(SEQ ID NO.1)，上述多肽的其第三半胱氨酸和第七位半胱氨酸相成分子內(nèi)二硫鍵。

所述花姬蛙抗菌肽的基因序列SEQ ID NO.4的第370-459位核苷酸編碼。本發(fā)明的花姬蛙抗菌肽及其基因的制備過(guò)程包括如下步驟：

實(shí)施例1，花姬蛙抗菌肽基因克?。?/p>

I、花姬蛙皮膚總RNA提?。夯铙w花姬蛙用水清洗干凈，放入液氮中速凍4h，取皮膚組織，稱重，取300mg皮膚組織，加入10m1總RNA提取緩沖液(Trizol溶液，美國(guó)GIBCOBRL公司產(chǎn)品)，于20m1玻璃勻漿器中勻漿30min。加入等體積酚/氯仿溶液，劇烈混勻，室溫放置10min，4℃，12000rpm離心10min，棄除沉淀。向上清中加入等體積的異丙醇，室溫放置10min，4℃，12000rpm離心10min，沉淀用75％乙醇洗一次，晾干，管底的沉淀物即為花姬蛙皮膚總RNA。

II、花姬蛙皮膚mRNA的純化：花姬蛙皮膚mRNA分離純化采用美國(guó)PROMEGA公司的mRNA Isolation Systems試劑盒。具體如下：取花姬蛙皮膚總RNA 500μg溶于500μl DEPC水中，放入65℃水浴10min，加人3μl Oligo(dT)探針和13μl 20×SSC溶液，混勻，放置室溫冷卻，稱為A液。將磁珠輕彈混勻，至磁力架吸附30S，棄上清，加0.5×SSC 0.3m1，至磁力架吸附30S，最后加0.1ml 0.5×SSC懸浮，稱之為B液。將A液加入B液中，室溫放置10分鐘，至磁力架吸附30sec，棄上清，用0.1×SSC洗滌4次，最后棄上清，加0.L ml DEPC水懸浮，至磁力架上吸附30sec，將上清移至新的試管，再加入0.15m1DEPC水重新懸浮，至磁力架吸附30S，移上清至上述試管，則上清中為純化的花姬蛙皮膚mRNA。加入1/10體積3M乙酸鈉，pH5.2，等體積異丙醇，于-70℃放置30分鐘，4℃，12000rpm離心10min，棄上清，沉淀溶解于10μl DEPC水中得到花姬蛙皮膚mRNA。

III、花姬蛙皮膚cDNA文庫(kù)構(gòu)建：采用CLONTECH公司Creator^TM SMART^TM cDNA Library Construction Kit質(zhì)粒cDNA文庫(kù)構(gòu)建試劑盒。

A.cDNA第一鏈合成(mRNA反轉(zhuǎn)錄)：在0.5ml無(wú)菌的離心管加入1μl花姬蛙皮膚mRNA、1μl SMART IV寡聚核苷酸、1μl CDS III/3’PCR引物，加2μl去離子水使總體積達(dá)到5μl?；靹螂x心管中的試劑并以12000rpm離心15sec，72℃保溫2min。將離心管在冰上孵育2min。在離心管中加入以下試劑2.0μl 5×第一鏈緩沖、1.0μl 20mM二硫蘇糖醇、1.0μl 10mM dNTP混合物、1.0μl PowerScript反轉(zhuǎn)錄酶。混合離心管中試劑并以12000rpm離心15sec，在42℃保溫1h。將離心管置于冰上中止第一鏈的合成。從離心管取2μl所合成的cDNA第一鏈備用。

B.采用長(zhǎng)末端聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LD-PCR)方法擴(kuò)增第二鏈：95℃預(yù)熱PCR儀。將2μl cDNA第一鏈(mRNA反轉(zhuǎn)錄)、80μl去離子水、10μl 10×Advantage 2PCR緩沖、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl大腸桿菌聚合酶離心管進(jìn)行反應(yīng)。在PCR儀中按以下程序擴(kuò)增：95℃20sec，95℃5sec，68℃6min，22個(gè)循環(huán)。循環(huán)結(jié)束后，將離心管中合成的cDNA雙鏈進(jìn)行抽提。

C.PCR產(chǎn)物用PROMEGA公司的SV Gel and PCR Clean-Up System試劑盒進(jìn)行抽提回收，步驟如下：將通過(guò)PCR得到的cDNA雙鏈加入等體積的膜結(jié)合緩沖顛倒混勻，然后將混和液轉(zhuǎn)入離心純化柱，室溫靜置5分鐘，使DNA充分與硅膠膜結(jié)合。以12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。加入700μl的洗脫液(含乙醇)于離心純化柱中，以12000rpm離心30sec，倒掉收集管中的廢液。重復(fù)步驟上述步驟。12000rpm離心5min。將離心純化柱置于新的離心管中。加入30μl超純水，在室溫下靜置5min。以12000rpm離心30sec，管底溶液即為所純化過(guò)的cDNA雙鏈。

D.酶切、連接以及連接產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化：在微量離心管中加入1μl Takara pMD18-T載體、4μl花姬蛙cDNA雙鏈溶液，全量為5μl。加入5μl的連接酶緩沖混合物。16℃反應(yīng)2h。全量(10μl)加入至100μl DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，冰中放置30min。42℃加熱90Sec后，再在冰中放置1分鐘。加入37℃孵育過(guò)的LB培養(yǎng)基890μl，37℃緩慢振蕩培養(yǎng)60min。取200μl涂布于含有X-Gal、IPTG、Amp的LB培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)16h，形成單菌落。每個(gè)LB平皿用5m1LB液體培養(yǎng)基洗滌菌落，加30％甘油凍存。構(gòu)建的cDNA大約含1×10⁶個(gè)單獨(dú)克隆。

Ⅳ、花姬蛙抗菌肽基因克隆篩選：擴(kuò)增引物長(zhǎng)度為25個(gè)核苷酸，其序列為5’ATGAAGGTCTGGCAGTGCGCGCTC 3’(SEQ ID NO.2)，PCR另一擴(kuò)增引物為CLONTECH公司SMART^TMcDNA Library Construction Kit中的3’PCR Primer引物，其序列為5’ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG 3’(SEQ ID NO.3)。PCR反應(yīng)在如下條件下進(jìn)行：94℃30sec，48℃45sec和72℃2.5min，35個(gè)循環(huán)。

首先滴定構(gòu)建的細(xì)菌cDNA文庫(kù)，然后用含100μg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基稀釋至適當(dāng)?shù)募?xì)菌濃度(大約5000個(gè)細(xì)菌/毫升和30個(gè)細(xì)菌/毫升分別用于首輪篩選第二輪篩選)，在96孔培養(yǎng)板上按8×8矩陣鋪板(共64孔，每孔100μ1),37℃過(guò)夜培養(yǎng)。按行、列分別合并細(xì)菌培養(yǎng)液，有16個(gè)樣品進(jìn)行PCR鑒定，交叉陽(yáng)性孔細(xì)菌樣品進(jìn)入第二輪篩選。

Ⅴ、花姬蛙抗菌肽基因序列測(cè)定和結(jié)果：提取質(zhì)粒DNA用雙脫氧法測(cè)定核苷酸序列，使用儀器為美國(guó)Applied Biosystems 373A全自動(dòng)核苷酸序列測(cè)定儀，測(cè)序引物為BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M和BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47，BcaBESTTM Sequencing Primer RV-M序列：5`GAGCGGATAACAATTTCACACAGG 3’(SEQ ID NO.5)，BcaBESTTM Sequencing Primer M13-47：5’CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3’(SEQ ID NO.6)。基因測(cè)序結(jié)果自5’端至3’端序列為(SEQ ID NO.4):

花姬蛙抗菌肽基因核苷酸的序列表為：序列長(zhǎng)度為359個(gè)堿基；序列類型：核酸；鏈數(shù)：?jiǎn)捂湥煌負(fù)鋵W(xué)：直鏈狀；序列種類：cDNA；來(lái)源：花姬蛙皮膚。

根據(jù)花姬蛙抗菌肽的基因推斷編碼由功能的成熟活抗菌肽為第133-261位核苷酸，氨基酸序列為：GRCNLLCKAKKKLRAVGNKIKEIKNVVFNR(見(jiàn)序列SEQ ID NO.1)

實(shí)施例2，花姬蛙抗菌肽的制備：

Ⅰ、花姬蛙抗菌肽的制備方法：根據(jù)花姬蛙抗菌肽的基因推斷編碼由功能的成熟活抗菌肽氨基酸序列后用自動(dòng)多肽合成儀合成多肽。通過(guò)HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。二硫鍵的形成采用空氣氧化法，具體為在燒瓶中將多肽溶解按照0.1mg/ml于0.1％醋酸溶液中后用氫氧化銨滴定成pH 7.8,然后室溫?cái)嚢柽^(guò)夜。通過(guò)HPLC反相C18柱層析脫鹽、純化。純化時(shí)A液體為0.05％TFA+2％CH₃CN，B液為0.05％TFA+90％CH₃CN，梯度方法是B液體在15min從25％升到40％，檢測(cè)波長(zhǎng)為220nm，多肽出現(xiàn)在9.257分鐘。

Ⅱ、分子量測(cè)定采用快原子轟擊質(zhì)譜法(Fast atom bombardment mass spectrometry,FAB-MS)，以甘油:間硝基芐醇:二甲亞砜(1:1:l，V:V:V，體積比)為底物，Cs+作為轟擊粒子，電流為1μA，發(fā)射電壓為25Kv。

Ⅲ、純化的花姬蛙抗菌肽用高效液相色譜(HPLC)方法鑒定其純度，等電聚焦電泳測(cè)定等電點(diǎn)，用自動(dòng)氨基酸測(cè)序儀測(cè)定氨基酸序列結(jié)構(gòu)。

花姬蛙抗菌肽是中國(guó)兩棲類動(dòng)物花姬蛙抗菌肽基因編碼的一種環(huán)狀多肽，分子量3440.53道爾頓，等電點(diǎn)10.726，多肽全序列一級(jí)結(jié)構(gòu)為：GRCNLLCKAKKKLRAVG NKIKEIKNVVFNR，其第三位半胱氨酸和第七位半胱氨酸相成分子內(nèi)二硫鍵。

實(shí)施例3，花姬蛙抗菌肽的活性實(shí)驗(yàn)

Ⅰ、抑制細(xì)菌生長(zhǎng)能力測(cè)定

抗菌活性檢測(cè)采用杯碟法，培養(yǎng)基為普通瓊脂培養(yǎng)基。分別注入加熱融化的培養(yǎng)基20m1于平皿中作為底層，使其在皿底內(nèi)均勻攤布，凝固后，另取培養(yǎng)基適量加熱融化后，分別在每皿中加入5m1菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離均勻放入已消毒的不銹鋼杯6個(gè)。第一個(gè)鋼杯加入0.1-0.3mg/ml濃度的待測(cè)化合物溶液0.l ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，觀察抑菌圈大小。抑菌圈l0mm以上的作為最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration,MIC)。細(xì)菌菌株來(lái)源于昆明醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，此試驗(yàn)重復(fù)四次，取平均值，結(jié)果如表1所示，合成的花姬蛙抗菌肽能顯著的抑制細(xì)菌生長(zhǎng)。

表1.花姬蛙抗菌肽抑制細(xì)菌生長(zhǎng)活性

Ⅱ、抑制真菌生長(zhǎng)能力測(cè)定

抗真菌活性檢測(cè)采用杯碟法，培養(yǎng)基為改良沙保氏(Sabousand)培養(yǎng)基。分別注入加熱溶化的培養(yǎng)基20ml于平皿中作為底層，使其在皿底均勻攤布，凝固后另取培養(yǎng)基適量加熱溶化，分別向每皿中加入5ml菌懸液，搖勻，使其在底層上均勻攤布，作為菌層。冷卻后，在平皿中等距離放入已消毒的不銹鋼杯5個(gè)。第一個(gè)鋼杯加入0.3mg/ml濃度的待測(cè)化合物溶液0.1ml，其余鋼杯采用二倍稀釋法加入樣品液，37℃培養(yǎng)，24-48h后測(cè)量抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上作為最小抑菌濃度(MIC)。細(xì)菌菌株來(lái)源于云南大學(xué)微生物研究所，此實(shí)驗(yàn)做三個(gè)平行取幾何平均值，結(jié)果如表2所示，合成的花姬蛙抗菌肽能顯著的抑制真菌生長(zhǎng)。表2.花姬蛙抗菌肽抑制真菌生長(zhǎng)活性

Ⅲ、免疫調(diào)節(jié)作用：

A.對(duì)肥大細(xì)胞組胺釋放的影響

健康Wistar大鼠斷頸處死，腹腔內(nèi)注射10ml臺(tái)氏液，腹部按摩10min，打開(kāi)腹腔吸出含有肥大細(xì)胞的臺(tái)氏液，1000rpm離心5min，重復(fù)用臺(tái)氏液洗一次，再用1-2ml的臺(tái)氏液懸浮肥大細(xì)胞。取10μl樣品和90μl細(xì)胞懸液在37℃孵育10min，37℃孵育10min，然后加1.9ml冷的臺(tái)氏液，3000rpm離心5min，吸出上清，沉淀用2ml臺(tái)氏液懸浮，并在開(kāi)水上煮10min。上清或者沉淀分別加入0.6g NaCl、2.5mL正丁醇和0.2ml 2.5mol/LNaOH，立即混勻，振蕩后低速離心5min；取2mL有機(jī)相加到已加0.6mL 0.1mol/L HCl和2.5mL正庚烷的試管，振蕩后低速離心5min，棄有機(jī)相；取0.5mL HCl相用雙蒸水稀釋1倍后，加入0.25mL 0.4mol/L NaOH和0.05mL 1mg/L OPT甲醇溶液，在20℃條件下準(zhǔn)確反應(yīng)10min后，加入0.25mL 0.5mol/L HC1終止反應(yīng)?？瞻坠転橄燃尤?.25mol/L HC1后，再加入鄰苯二甲醛。利用PE公司的自動(dòng)熒光分光光度計(jì)于激發(fā)波360nm，熒光波長(zhǎng)450nm，狹縫10nm的條件下測(cè)定熒光強(qiáng)度讀數(shù)(T)。組胺釋放率按下式計(jì)算：

組胺釋放率＝[(樣本的組胺釋放量-自發(fā)組胺釋放量)/組胺總含量]×100％

該試驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果如圖3所示，花姬蛙抗菌肽能顯著促進(jìn)肥大細(xì)胞釋放組胺，并且呈現(xiàn)劑量依賴性。

B.對(duì)細(xì)胞因子分泌的影響

1ml濃度為1×106/ml RAW 264.7細(xì)胞用含100U/ml青霉素、0.1mg/ml鏈霉素、10％胎牛血清的DMEM(Gibco公司產(chǎn)品)37℃5％CO₂在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)。終濃度是0、5、10和25μg/ml的多肽樣品分別加入到含0或100ng/ml LPS(from E.coli 055:B5,Sigma-Aldrich,USA)刺激的細(xì)胞中孵育24h。細(xì)胞上清被收集，1000rpm離心10min，上清液中TNF-α和IL-10的含量用上海酶聯(lián)公司生產(chǎn)的ELISA檢測(cè)試劑盒按照說(shuō)明書檢測(cè)。該試驗(yàn)重復(fù)三次。結(jié)果如圖4和5所示，花姬蛙抗菌肽能顯著調(diào)節(jié)RAW 264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子。