本發(fā)明涉及一種植物耐旱相關(guān)蛋白VPS23A及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：隨著全球性氣候的變化、土壤沙化和鹽漬化以及水資源短缺等生態(tài)問題日益嚴(yán)重，尤其是干旱已經(jīng)成為制約農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要因素。世界土地面積的三分之一都處于干旱和半干旱狀態(tài)，造成經(jīng)濟(jì)損失非常大，干旱是最為嚴(yán)重的自然災(zāi)害類型之一。中國平均每年受旱耕地面積約2,231.6萬公頃，約占各種氣象災(zāi)害影響耕地面積的三分之二，因旱災(zāi)每年損失糧食100億千克。隨著經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展和人口劇增，水資源短缺現(xiàn)象日益嚴(yán)重，加劇了許多干旱和半干旱地區(qū)的災(zāi)情。如2014年，河北省滄州地區(qū)因持續(xù)的高溫悶熱少雨天氣，造成農(nóng)作物大量減產(chǎn)。據(jù)其農(nóng)業(yè)部門統(tǒng)計，780余萬畝農(nóng)作物中有近一半受到干旱脅迫，近1/6受災(zāi)，甚至有數(shù)萬畝玉米出現(xiàn)幾乎絕產(chǎn)的后果。因此，干旱是影響植物生長發(fā)育的一個災(zāi)害性脅迫。由于大多數(shù)農(nóng)作物對干旱脅迫非常敏感，因此探究植物如何應(yīng)對干旱脅迫和找到調(diào)節(jié)植物響應(yīng)干旱脅迫的關(guān)鍵基因尤為重要。在植物響應(yīng)干旱脅迫的過程當(dāng)中，人們發(fā)現(xiàn)抗逆激素脫落酸(ABA)發(fā)揮著極其重要的調(diào)控作用。植物根系中ABA與根周圍土壤水分含量顯著相關(guān)。ABA可以有效減緩水分脅迫，植物在受到干旱脅迫時，植物體合成大量ABA，ABA通過木質(zhì)部運(yùn)輸?shù)降厣喜糠终{(diào)節(jié)氣孔開度，降低蒸騰作用，用于促進(jìn)氣孔關(guān)閉以減少水分蒸發(fā)；ABA促進(jìn)水分吸收，增加共質(zhì)體途徑水流ABA；降低葉片伸展率，誘導(dǎo)抗旱特異性蛋白質(zhì)合成，調(diào)整保衛(wèi)細(xì)胞離子通道，誘導(dǎo)相關(guān)基因的表達(dá)，從而幫助植物有效應(yīng)對干旱的威脅。但是，ABA的含量并不是可以無止境增加的，當(dāng)植物適應(yīng)干旱環(huán)境后，ABA的含量會有所下降，并隨著干旱脅迫呈緩慢上升趨勢。此外，ABA可以提高植物抗氧化系統(tǒng)的活性，提高清除活性氧的效率。若外施適當(dāng)濃度的ABA對于提高植物抗性效果更顯著。但是，目前人工合成ABA費(fèi)用較高，它還不能直接應(yīng)用于生產(chǎn)。因此，研究和利用植物的ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，尋找調(diào)節(jié)ABA信號途徑的基因，是培育抗旱植物的突破口。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種植物耐旱相關(guān)蛋白VPS23A及其編碼基因與應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，獲自擬南芥，命名為VPS23A蛋白，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將(a)經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物抗旱性相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的VPS23A蛋白便于純化和檢測，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的VPS23A蛋白可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的VPS23A蛋白的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼所述VPS23A蛋白的基因(VPS23A基因)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。所述基因?yàn)槿缦?1)或(2)或(3)或(4)：(1)編碼區(qū)如序列表的序列2自5’末端第1001-2197位核苷酸所示的DNA分子；(2)序列表中序列2所示的DNA分子；(3)在嚴(yán)格條件下與(1)或(2)限定的DNA序列雜交且編碼抗旱性相關(guān)的蛋白質(zhì)的DNA分子；(4)與(1)或(2)或(3)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼抗旱性相關(guān)的蛋白質(zhì)的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為用0.1×SSPE(或0.1×SSC)，0.1％SDS的溶液，在DNA或者RNA雜交實(shí)驗(yàn)中65℃下雜交并洗膜。含有所述VPS23A基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明還保護(hù)VPS23A蛋白或VPS23A基因的應(yīng)用，為如下(c1)和/或(c2)：(c1)調(diào)控植物抗旱性；(c2)調(diào)控植物對抗逆激素ABA信號的敏感性。本發(fā)明還保護(hù)VPS23A基因作為靶點(diǎn)在培育抗旱植物中的應(yīng)用。本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是抑制目的植物中VPS23A基因的表達(dá)，得到抗旱性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。所述“抑制目的植物中VPS23A基因的表達(dá)”是通過CRISPER-Cas9基因編輯實(shí)現(xiàn)的。用于所述CRISPER-Cas9基因編輯的sgRNA的靶序列如序列表的序列4所示。用于所述CRISPER-Cas9基因編輯的sgRNA中的靶序列結(jié)合區(qū)如序列5所示。用于所述CRISPER-Cas9基因編輯的重組載體具體可為將pYAO：hSpCas9質(zhì)粒的SpeI酶切位點(diǎn)間插入了序列3所示的DNA分子。本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是降低目的植物中VPS23A蛋白的表達(dá)量和/或活性，得到抗旱性高于所述目的植物的轉(zhuǎn)基因植物。本發(fā)明還保護(hù)一種用于CRISPER-Cas9基因編輯的特異sgRNA；所述sgRNA的靶序列如序列表的序列4所示。本發(fā)明還保護(hù)用于抑制VPS23A基因表達(dá)的物質(zhì)或用于降低目的植物中VPS23A蛋白的表達(dá)量和/或活性的物質(zhì)或所述的sgRNA在培育抗旱植物中的應(yīng)用。以上任一所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物可為山柑目植物。所述山柑目植物可為十字花科植物。所述十字花科植物可為南芥族植物。所述南芥族植物可為擬南芥屬植物。所述擬南芥屬植物具體可為擬南芥，例如哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。本發(fā)明提供了VPS23A蛋白及其編碼基因，抑制植物中VPS23A基因的表達(dá)，可以顯著提高植物的耐旱性。本發(fā)明對于農(nóng)作物改良和培育抗旱作物具有非常重要的意義，適合于推廣應(yīng)用。附圖說明圖1為突變體vps23a及其轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)表達(dá)植株對ABA敏感性的檢測結(jié)果。圖2為重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-VPS23A的結(jié)構(gòu)示意圖圖3為VPS23A基因在各植株中的相對表達(dá)水平。圖4為突變體vps23a抗旱性檢測結(jié)果。圖5為重組表達(dá)載體pYAO：hSpCas9-AtVPS23A-sgRNA的結(jié)構(gòu)示意圖。具體實(shí)施方式以下的實(shí)施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實(shí)施例中的實(shí)驗(yàn)方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的試驗(yàn)材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。突變體CS878714：ABRC(ArabidopsisBiologicalResourceCenter)。哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(ArabidopsisthalianaecotypeColumbia，Col-0)：ABRC(ArabidopsisBiologicalResourceCenter)。pCAMBIA1300載體：參考文獻(xiàn)：YiyueZhang，ChengweiYang，YinLi，NuoyanZheng，HaoChen，QingzhenZhao，TingGao，HuishanGuoandQiXie(2007)SDIR1IsaRINGFingerE3LigaseThatPositivelyRegulatesStress-ResponsiveAbscisicAcidSignalinginArabidopsis.PlantCell.19(6)：1912-1929.；公眾可以從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。根癌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)EHA105株：參考文獻(xiàn)：YiyueZhang，ChengweiYang，YinLi，NuoyanZheng，HaoChen，QingzhenZhao，TingGao，HuishanGuoandQiXie(2007)SDIR1IsaRINGFingerE3LigaseThatPositivelyRegulatesStress-ResponsiveAbscisicAcidSignalinginArabidopsis.PlantCell.19(6)：1912-1929；公眾可以從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。AtU6-26-sgRNA-SK質(zhì)粒：參考文獻(xiàn)：LiuhuaYan，ShaoweiWei，YaorongWu，RuolanHu，，HongjuLi，WeicaiYang，QiXie(2015)HighEfficiencyGenomeEditingInArabidopsisUsingYaoPromoter-DrivenCRISPR/Cas9System.Mol.Plant8(12)：1820-1823；公眾可以從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。pYAO：hSpCas9質(zhì)粒：參考文獻(xiàn)：LiuhuaYan，ShaoweiWei，YaorongWu，RuolanHu，，HongjuLi，WeicaiYang，QiXie(2015)HighEfficiencyGenomeEditingInArabidopsisUsingYaoPromoter-DrivenCRISPR/Cas9System.Mol.Plant8(12)：1820-1823；公眾可以從中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。BsaI-HF：NEB公司。MS培養(yǎng)基的成分見表2。表2MS培養(yǎng)基成分實(shí)施例1、VPS23A蛋白及其編碼基因的獲得通過對從ABRC訂購的若干擬南芥突變體植株進(jìn)行ABA表型篩選，發(fā)現(xiàn)一個ABA超敏感的突變體CS878714，經(jīng)全基因組測序，突變體CS878714為VPS23A基因的缺失突變體(T-DNA插入突變體，插入位點(diǎn)處于VPS23A基因第1個外顯子內(nèi))，VPS23A基因以外的序列均同哥倫比亞生態(tài)型擬南芥，將其命名為突變體vps23a。擬南芥來源的VPS23A蛋白如序列表的序列1所示。擬南芥來源的VPS23A基因如序列表的序列2所示，其中自5’末端第1001-2197位核苷酸為編碼區(qū)。實(shí)施例2、突變體vps23a的生理特征檢測1、將突變體vps23a和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)的種子用10％漂白劑溶液中進(jìn)行表面滅菌，然后用無菌水洗滌3次。2、將步驟1處理后的種子進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)：對照組：將無菌種子懸浮在水溶液中并鋪板到1/2MS培養(yǎng)基平板上，將平板在4℃黑暗條件下放置3天，然后移入24℃的組織培養(yǎng)室(16h光照/8h黑暗)培養(yǎng)一周，拍照并觀察植株的生長狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)組：將無菌種子懸浮在水溶液中并鋪板到含0.3或0.5μMABA的1/2MS培養(yǎng)基平板上，將平板在4℃黑暗條件下放置3天，然后移入24℃的組織培養(yǎng)室(16h光照/8小時黑暗)培養(yǎng)一周，拍照并觀察植株的生長狀態(tài)。結(jié)果如圖1所示。圖1A為植物子葉拍照照片。圖1B為子葉變綠比例統(tǒng)計結(jié)果，其中，1為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)的統(tǒng)計結(jié)果，2為突變體vps23a的統(tǒng)計結(jié)果。圖1C為植物根生長情況拍照照片。圖1D為根長統(tǒng)計結(jié)果，其中，1為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)的統(tǒng)計結(jié)果，2為突變體vps23a的統(tǒng)計結(jié)果。在地上子葉變綠方面，在對照組(1/2MS、0μMABA)處理中，突變體vps23a和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)的生長狀態(tài)沒有顯著差異。在實(shí)驗(yàn)組處理中，與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)相比，突變體vps23a中子葉變綠的數(shù)目較少。在含有0.3μMABA的平板上，6.7％的突變體vps23a的子葉變綠，而80％的哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)的子葉伸展并變綠；在0.5μMABA處理下，突變體vps23a的子葉均未變綠，而64.4％的哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)的子葉變綠。在地下根生長方面，在對照組(1/2MS、0μMABA)處理中，突變體vps23a和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)的生長狀態(tài)沒有顯著差異。在實(shí)驗(yàn)組中，突變體vps23a的根長短于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)。在含有0.3μMABA的平板上，突變體vps23a的根長約為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)根長的50％；在0.5μMABA處理下，突變體vps23a的根長約為哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)根長的30％。以上實(shí)驗(yàn)分析說明，突變體vps23a對于ABA的響應(yīng)更為敏感，在突變體vps23a中ABA信號的激活強(qiáng)度大于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)。實(shí)施例3、轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)表達(dá)植株一、轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)表達(dá)植株的獲得1、提取哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，采用VPS23A-FW和VPS23A-Rev組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，回收PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。VPS23A-FW：5’-GGGTACCCTCTCGTCGTTGGAGTTG-3’(下劃線為KpnI酶切位點(diǎn))VPS23A-Rev：5’-CGGATCCAGCCGATGTTTATTACCT-3’(下劃線為BamHI酶切位點(diǎn))2、用限制性內(nèi)切酶KpnI和BamHI酶切pCAMBIA1300載體，回收約10000bp的載體骨架。3、將步驟1得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和步驟2得到的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-AtVPS23A。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-AtVPS23A進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將pCAMBIA1300載體的KpnI和BamHI酶切位點(diǎn)間的小片段取代為了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-AtVPS23A的結(jié)構(gòu)示意圖見圖2。4、將重組質(zhì)粒pCAMBIA1300-AtVPS23A導(dǎo)入根癌土壤桿菌EHA105株中，得到重組土壤桿菌。5、將步驟4得到的重組土壤桿菌通過植株真空滲入法(方法參照文獻(xiàn)：BentAF，CloughSJ.Agrobacterium.Germ-LineTransformation：TransformationofArabidopsis，withoutTissueCulture[M]//PlantMolecularBiologyManual.SpringerNetherlands，1998：17-30)轉(zhuǎn)化突變體vps23a，收獲種子(T0代的種子，該種子長成的植株為T1代植株)。6、將步驟5收獲的種子置于含20μg/mL潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基平板上，將平板先在4℃黑暗條件下放置2-4天，然后移入24℃的組織培養(yǎng)室(16h光照/8h黑暗)培養(yǎng)1周，然后移入24℃的溫室進(jìn)行培養(yǎng)并收獲種子(T1代的種子，該種子長成的植株為T2代植株)。7、將步驟6收獲的種子置于含50μg/mL卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基平板上進(jìn)行抗性篩選，并收獲單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株得到的T2代抗性植株的種子(該種子長成的植株為T3代植株)。如果某一T1代植株得到的T2植株中抗性植株和非抗性植株的數(shù)量比約為3∶1，說明該T1代植株為單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株。8、將步驟7收獲的種子置于含50μg/mL卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基平板上進(jìn)行抗性篩選。如果某一T2代植株得到的T3代植株均為抗性植株，說明該T2代植株為純合的轉(zhuǎn)基因植株，該T2代植株及其后代為純合互補(bǔ)表達(dá)株系。9、從步驟8得到的純合互補(bǔ)表達(dá)株系中選取兩個(3.3和4.6)。取哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)、突變體vps23a、3.3株系的T3代植株的2周齡幼苗和4.6株系的T3代植株的2周齡幼苗，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板對各個株系的植株中VPS23A基因的表達(dá)量進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR檢測，采用Actin2基因作為內(nèi)參基因，以哥倫比亞生態(tài)型擬南芥中VPS23A基因的表達(dá)量的表達(dá)量作為1，計算其它各個株系中AtVPS23A基因的相對表達(dá)量，進(jìn)行三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，取平均值。用于鑒定VPS23A基因的引物序列如下：qRT-VPS23A-Fw：5’-CACTTGAACAACAATTACAGA-3’：qRT-VPS23A-Rev：5’-AAGCATTATCCACATCCAA-3’。用于鑒定Actin2基因的引物序列如下：qRT-Actin2-FW：5’-GGTAACATTGTGCTCAGTGGTGG-3’；qRT-Actin2-Rev：5’-AACGACCTTAATCTTCATGCTGC-3’。結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，純合互補(bǔ)表達(dá)株系(3.3和4.6)植株中VPS23A基因的表達(dá)水平超出了哥倫比亞生態(tài)型擬南芥中VPS23A基因的表達(dá)水平，突變體vps23a中未檢測到VPS23A基因的表達(dá)。二、轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)表達(dá)植株的表型分析按照實(shí)施例2的方法檢測純合互補(bǔ)表達(dá)株系(3.3和4.6)T3代植株的表型。結(jié)果如圖1所示。圖lA為植物子葉拍照照片。圖1B為子葉變綠比例統(tǒng)計結(jié)果，其中，3為純合互補(bǔ)表達(dá)株系3.3植株的統(tǒng)計結(jié)果，2為純合互補(bǔ)表達(dá)株系4.6植株的統(tǒng)計結(jié)果。圖1C為植物根生長情況拍照照片。圖1D為根長統(tǒng)計結(jié)果，其中，1為純合互補(bǔ)表達(dá)株系3.3植株的統(tǒng)計結(jié)果，2為純合互補(bǔ)表達(dá)株系4.6植株的統(tǒng)計結(jié)果。結(jié)果表明，純合互補(bǔ)表達(dá)株系(3.3和4.6)T3代植株的表型與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥相同，它們在子葉變綠和根長生長方面均能互補(bǔ)突變體vps23a的表型。說明VPS23A基因的缺失是導(dǎo)致突變體vps23a表型的原因。VPS23A基因能夠調(diào)控植物對ABA信號的響應(yīng)。突變體vps23a可以用來進(jìn)行下一步的干旱表型實(shí)驗(yàn)。實(shí)施例4、突變體vps23a抗旱性鑒定1、將突變體vps23a和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)的種子用10％漂白劑溶液中進(jìn)行表面滅菌，然后用無菌水洗滌3次。2、將無菌種子懸浮在水溶液中并鋪板到1/2MS板上，4℃春化3天，然后21℃培養(yǎng)11天，再移植到土中繼續(xù)培養(yǎng)14天左右，每個孔中種植5棵。3、待植物生長處于未抽苔時期，將整個葉盤剪開，使每個葉片上氣孔獨(dú)立放置，同時不再澆水，進(jìn)行耐旱性測試。干旱處理21天后進(jìn)行復(fù)水。植株表型觀察結(jié)果如圖4A所示。突變體vps23a和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)的生長狀態(tài)在沒有干旱脅迫(按照步驟2所述正常生長4周)時沒有顯著差異。在復(fù)水前一天和復(fù)水后一天，突變體vps23a植株的生長狀態(tài)顯著優(yōu)于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥。復(fù)水后一天，統(tǒng)計各植株的存活率，發(fā)現(xiàn)突變體vps23a植株的存活率顯著高于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)(圖4B)。4、取步驟2的各植株的平展的蓮座葉，撕下葉片下表皮，浸泡在氣孔緩沖液(10mMKCl，50μMCaCl2，10mMMES-Tris，pH6.15)中，置于強(qiáng)光(90μmol.m-2.s-1)下3個小時；將葉片換至含有0μM或10μM的ABA的氣孔緩沖液中處理3-5h；將葉片下表皮平鋪在載玻片上，用毛筆刷掉葉肉細(xì)胞，蓋上蓋玻片，在Imager.A1顯微鏡下觀察氣孔，Axio軟件拍照并統(tǒng)計氣孔長寬比。統(tǒng)計結(jié)果如圖4C所示。在沒有ABA的情況下，突變體vps23a和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)的氣孔開度沒有明顯區(qū)別，在10μMABA處理下，突變體vps23a的氣孔開度明顯小于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)。氣孔開度小能夠有效減少水分丟失，這是突變體vps23a抗旱的重要原因。以上結(jié)果表明，VPS23A基因的缺失能夠增強(qiáng)植物對抗逆激素ABA信號的敏感性，使突變體植物在干旱條件下快速響應(yīng)體內(nèi)抗逆激素ABA水平的升高，關(guān)閉葉片氣孔，減少進(jìn)一步的蒸騰作用，最終賦予植物很強(qiáng)的抗旱能力。實(shí)施例5、VPS23A功能缺失轉(zhuǎn)基因擬南芥株系的建立和鑒定1、采用BsaI-HF對AtU6-26-sgRNA-SK質(zhì)粒進(jìn)行酶切，得到約4000bp的AtU6-26-sgRNA-SK載體。2、人工合成引物VPS23A-FW2和引物VPS23A-Rev2。VPS23A-FW2：5’-ATTGGGACGGCGTCGAGAATAAAG-3’(下劃線為載體AtU6-26-sgRNA-SK經(jīng)BsaI酶切后的粘性末端序列的互補(bǔ)序列)；VPS23A-Rev2：5’-AAACCTTTATTCTCGACGCCGTCC-3’(下劃線為載體AtU6-26-sgRNA-SK經(jīng)BsaI酶切后的粘性末端序列的互補(bǔ)序列)。3、將步驟2合成的引物VPS23A-FW2和引物VPS23A-Rev2進(jìn)行退火，得到雙鏈DNA片段(干擾片段)。4、將步驟3得到的雙鏈DNA片段(干擾片段)和步驟1得到的AtU6-26-sgRNA-SK載體連接，得到連接產(chǎn)物。5、將步驟4的連接產(chǎn)物用NheI和SpeI限制性內(nèi)切酶雙酶切，得到目的片段。6、采用SpeI限制性內(nèi)切酶對pYAO：hSpCas9質(zhì)粒進(jìn)行酶切，得到約12,000bp的pYAO：hSpCas9載體。7、將步驟5得到的目的片段與步驟6得到的pYAO：hSpCas9載體連接，得到重組表達(dá)載體pYAO：hSpCas9-VPS23A-sgRNA。根據(jù)測序結(jié)果，對重組表達(dá)載體pCAMBIA1300-Cas9-VPS23A進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：將pYAO：hSpCas9質(zhì)粒的SpeI酶切位點(diǎn)間插入了序列3所示的DNA分子。重組表達(dá)載體pYAO：hSpCas9-VPS23A-sgRNA的結(jié)構(gòu)示意圖見圖5。8、將步驟7得到的重組表達(dá)載體pYAO：hSpCas9-VPS23A-sgRNA導(dǎo)入根癌土壤桿菌EHA105株中，得到重組土壤桿菌。9、將步驟8得到的重組土壤桿菌通過植株真空滲入法(方法參照文獻(xiàn)：BentAF，CloughSJ.Agrobacterium，Germ-LineTransformation：TransformationofArabidopsis，withoutTissueCulture[M]//PlantMolecularBiologyManual.SpringerNetherlands，1998：17-30.)轉(zhuǎn)化哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)，收獲種子(T0代的種子，該種子長成的植株為T1代植株)。10、將步驟9收獲的種子置于含20μg/mL潮霉素的1/2MS培養(yǎng)基平板上，將平板先在4℃黑暗條件下放置2-4天，然后移入24℃的組織培養(yǎng)室(16h光照/8h黑暗)培養(yǎng)1周，然后移入24℃的溫室進(jìn)行培養(yǎng)并收獲種子(T1代的種子，該種子長成的植株為T2代植株)。11、將步驟10收獲的種子置于含50μg/mL卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基平板上進(jìn)行抗性篩選，并收獲單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株得到的T2代抗性植株的種子(該種子長成的植株為T3代植株)。如果某一T1代植株得到的T2植株中抗性植株和非抗性植株的數(shù)量比約為3∶1，說明該T1代植株為單拷貝的轉(zhuǎn)基因植株。12、將步驟11收獲的種子置干含50μg/mL卡那霉素的1/2MS培養(yǎng)基平板上進(jìn)行抗性篩選。如果某一T2代植株得到的T3代植株均為抗性植株，說明該T2代植株為純合的轉(zhuǎn)基因植株，該T2代植株及其后代為純合轉(zhuǎn)基因株系。13、從步驟12得到的純合轉(zhuǎn)基因株系中選取一個，檢測T3代植株中VPS23A基因的表達(dá)量(方法同實(shí)施例3步驟一的9)。經(jīng)過鑒定，純合VPS23A功能缺失轉(zhuǎn)基因株系植株中VPS23A基因不表達(dá)。二、轉(zhuǎn)空載體株系的獲得1、采用NheI和SpeI限制性內(nèi)切酶對AtU6-26-sgRNA-SK質(zhì)粒進(jìn)行酶切，得到目的片段。2、采用SpeI限制性內(nèi)切酶對pYAO：hSpCas9質(zhì)粒進(jìn)行酶切，得到約12,000bp的pYAO：hSpCas9載體。3、將步驟1得到的目的片段與步驟2得到的pYAO：hSpCas9載體連接，得到重組表達(dá)載體pYAO：hSpCas9-sgRNA(不含干擾片段)。4、將pYAO：hSpCas9-sgRNA載體代替重組表達(dá)載體pYAO：hSpCas9-VPS23A-sgRNA載體按照步驟一的8操作，得到轉(zhuǎn)空載體株系。三、抗旱性鑒定待測植株為：純合VPS23A功能缺失轉(zhuǎn)基因株系的T3代植株、轉(zhuǎn)空載體株系的T3代植株、突變體vps23a、哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)。1、將待測植株的種子用10％漂白劑溶液中進(jìn)行表面滅菌，然后用無菌水洗滌3次。2、將無菌種子懸浮在水溶液中并鋪板到1/2MS板上，4℃春化3天，然后21℃培養(yǎng)11天，再移植到土中繼續(xù)培養(yǎng)14天左右，每個孔中種植5棵。3、待植物生長處于未抽苔時期，將整個葉盤剪開，使每個葉片上氣孔獨(dú)立放置，同時不再澆水，進(jìn)行耐旱性測試。干旱處理21天左右進(jìn)行復(fù)水。表型觀察結(jié)果表明，VPS23A功能缺失轉(zhuǎn)基因植株、轉(zhuǎn)空載體植株、突變體vps23a和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)的生長狀態(tài)在沒有干旱脅迫(按照步驟2所述正常生長4周)時沒有顯著差異。在復(fù)水前一天和復(fù)水后一天，VPS23A功能缺失轉(zhuǎn)基因植株和突變體vps23a植株的生長狀態(tài)顯著優(yōu)于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥和轉(zhuǎn)空載體植株。復(fù)水一天后，統(tǒng)計各植株的存活率，發(fā)現(xiàn)VPS23A功能缺失轉(zhuǎn)基因植株的存活率為60％，與突變體vps23a的存活率無顯著差異，顯著高于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的存活率(23％)。轉(zhuǎn)空載體植株的存活率與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的存活率無顯著差異。4、取步驟2的各植株的平展的蓮座葉，撕下葉片下表皮，浸泡在氣孔緩沖液(10mMKCl，50μMCaCl2，10mMMES-Tris，pH6.15)中，置于強(qiáng)光(90μmol.m-2.s-1)下3個小時；將葉片換至含有0μM或10μM的ABA的氣孔緩沖液中處理3-5h；將葉片下表皮平鋪在載玻片上，用毛筆刷掉葉肉細(xì)胞，蓋上蓋玻片，在Imager.A1顯微鏡下觀察氣孔，Axio軟件拍照并統(tǒng)計氣孔長寬比。統(tǒng)計結(jié)果表明，在沒有ABA的情況下，VPS23A功能缺失轉(zhuǎn)基因植株、轉(zhuǎn)空載體植株、突變體vps23a和哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)的氣孔開度沒有明顯區(qū)別。在10μMABA處理下，VPS23A功能缺失轉(zhuǎn)基因植株的氣孔開度為0.25，與突變體vps23a的氣孔開度無顯著差異，顯著低于哥倫比亞生態(tài)型擬南芥(Col-0)的氣孔開度(0.42)。轉(zhuǎn)空載體植株的氣孔開度與哥倫比亞生態(tài)型擬南芥的氣孔開度無顯著差異。綜合以上結(jié)果，VPS23A功能缺失轉(zhuǎn)基因擬南芥植株較哥倫比亞生態(tài)型擬南芥表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性。<110>中國科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所<120>植物耐旱相關(guān)蛋白VPS23A及其編碼基因與應(yīng)用<130>GNCYXMN161964<160>5<210>1<211>398<212>PRT<213>擬南芥（Arabidopsisthaliana）<400>1MetValProProProSerAsnProGlnGlnValGlnGlnPheLeuSer151015SerAlaLeuSerGlnArgGlyProSerSerValProTyrGluGluSer202530AsnLysTrpLeuIleArgGlnHisLeuLeuAsnLeuIleSerSerTyr354045ProSerLeuGluProLysThrAlaSerPheMetHisAsnAspGlyArg505560SerValAsnLeuLeuGlnAlaAspGlyThrIleProMetProPheHis65707580GlyValThrTyrAsnIleProValIleIleTrpLeuLeuGluSerTyr859095ProArgHisProProCysValTyrValAsnProThrAlaAspMetIle100105110IleLysArgProHisAlaHisValThrProSerGlyLeuValSerLeu115120125ProTyrLeuGlnAsnTrpValTyrProSerSerAsnLeuValAspLeu130135140ValSerAspLeuSerAlaAlaPheAlaArgAspProProLeuTyrSer145150155160ArgArgArgProGlnProProProProSerProProThrValTyrAsp165170175SerSerLeuSerArgProProSerAlaAspGlnSerLeuProArgPro180185190PheProProSerProTyrGlyGlyGlyValSerArgValGlnValGln195200205HisValHisHisGlnGlnGlnSerAspAspAlaAlaGluValPheLys210215220ArgAsnAlaIleAsnLysMetValGluMetValHisSerAspLeuVal225230235240SerMetArgArgAlaArgGluAlaGluAlaGluGluLeuLeuSerLeu245250255GlnAlaGlyLeuLysArgArgGluAspGluLeuAsnIleGlyLeuLys260265270GluMetValGluGluLysGluThrLeuGluGlnGlnLeuGlnIleIle275280285SerMetAsnThrAspIleLeuAspSerTrpValArgGluAsnGlnGly290295300LysThrLysAsnLeuValAspLeuAspValAspAsnAlaPheGluCys305310315320GlyAspThrLeuSerLysGlnMetLeuGluCysThrAlaLeuAspLeu325330335AlaIleGluAspAlaIleTyrSerLeuAspLysSerPheGlnAspGly340345350ValValProPheAspGlnTyrLeuArgAsnValArgLeuLeuSerArg355360365GluGlnPhePheHisArgAlaThrGlySerLysValArgAlaAlaGln370375380MetGluValGlnValAlaAlaIleAlaGlyArgLeuHisSer385390395<210>2<211>2805<212>DNA<213>擬南芥（Arabidopsisthaliana）<400>2ctctcgtcgttggagttggcgtccagtggacaccgtttagttattactccgatccaagac60cgaataactactacgccgatcctccgccgataagatactactcagataatccagcggata120ttctccagttatgcgtgggtaatcgatgtctcatcatccagttaggttactgtgaccaag180tacctaacaacctccgcagtttcttagcagatccagaaaccacgttcgtcggtgtctgga240atggtcaagatgcaggaaagcttgctcggtgttgccaccagttggagatcggagaacttc300tggacataaggcggtacgtgactgattcgtggggaaggagcatgaggcgttcttcgtttg360aagagattgttgaggaatgtatgggctatcaaggagtgatgctagatccggagataagca420tgagcgattggaccgcttacgatctagaccttgatcagattcttcaggcgtcactagatg480cttacgtttgccatcagcttggtgtttggactcgtctctgggaagtttgaaaacaagtat540caaaatgaataaattgctacttggatttttctgtcttttgttgacaagtgacttgaatct600tctttttgttttgttatgagaaaaaaattgtggtttgaatcttttcgtttatttttgttg660tcaagtggtttgaatcttcttattgttaaagttatgagaaaaaaactgttttgtttttca720ctcgttacttacatgagtaaggtgaataaaactttgatcacaaactcgctttatgttttg780ggtgttaaactttggactttggaacatgtccactccttacaaatttttatggagtaaacc840ggattaaacactatccaaaacaacactgaagggtaaaagagtaaatagctaataaagacg900cgtataataacattacttcttcttcttaaatcgaatctcctccccagttgtcgtcgtcat960cttcaatttggacttccaacgccgacaccgtttaactccgatggttcccccgccgtctaa1020tccgcagcaggttcagcagttcctctcctctgccctctcccagcgcggcccatcttcagt1080cccctacgaagagtccaacaagtggttgatccggcaacatctacttaacctaatctcttc1140ttacccttccttagagcccaaaacggcatcgtttatgcacaacgatggtcgctccgtcaa1200cctccttcaagcagatggtacgattccgatgccttttcatggagtcacctataacatacc1260tgtgattatctggctcctcgagtcatatcctcgtcatcctccttgcgtctatgtgaatcc1320caccgctgatatgatcatcaagcgacctcacgcacatgtcactccttctggtctcgtttc1380tcttccgtaccttcagaattgggtctaccctagctccaatctcgtagatctcgtctccga1440tctcagcgctgcttttgctcgtgatccgcctctttattctcgacgccgtcctcagccacc1500gccaccgtctcctcctacggtatacgattcgtctctgtcacgacctccttcggctgatca1560gtcattgcctagaccgttcccgccatcaccttacggcggaggagtaagtagggtgcaagt1620gcagcatgttcaccaccagcagcaatctgatgatgcggcggaggttttcaagagaaatgc1680gattaataagatggtggagatggttcatagcgatttggtttcgatgaggagagccagaga1740agctgaagcagaggagctgctgagcttgcaagctgggctgaagagaagagaggatgagct1800taatatagggttgaaagagatggttgaggagaaagaaacacttgaacaacaattacagat1860tatctccatgaacactgatattctagactcgtgggttagagagaaccaaggcaaaaccaa1920gaatttagttgatttggatgtggataatgcttttgaatgtggtgacacactctctaagca1980gatgttagagtgtactgctttggatttagccattgaagatgctatttattccttggataa2040gtcgtttcaagatggtgttgttccctttgatcagtatttgaggaatgtgaggttgttgtc2100gagagaacagttcttccaccgagccacgggttctaaagtcagggcggcacaaatggaggt2160tcaggttgcagccatcgcaggtaggttacattcatgaatgaaattcagtgtttttgtttg2220cgggatactgtgtcacacaatgctggtttatatagtctgagattagcatctttgaggagt2280atttctgtggctatgcgtgtgatgatggttcctctttaagattgaattaaatgtctatag2340actatatatacacgtacactgttgtgcacatacatatttgaatggatcagggcctgagaa2400tcgtctccttttgtgatctatgactacttttttacatgttggggatctttgtgataaaca2460gtattattatctaatgaatcaatcaattggtttgagaatgttagtatctttgttttggat2520attggaacagttttgatgactcttctttcttctccattaaaaaaatgttgctttagttta2580ttcaccatgcaaaaggaaactaaaaccttgtcgaattgaacccattagctccaccatcaa2640tgatgaaaccttgtcaagtcttcttatcagcaactgcaacatccttacgccttgttttgc2700ttcatcagtgtgcctttgaatctttcgtagtcttggataaaaccagctccttccttgcaa2760ctccctagcctccttccttgaggagttaggtaataaacatcggct2805<210>3<211>635<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>3aagcttcgttgaacaacggaaactcgacttgccttccgcacaatacatcatttcttctta60gctttttttcttcttcttcgttcatacagtttttttttgtttatcagcttacattttctt120gaaccgtagctttcgttttcttctttttaactttccattcggagtttttgtatcttgttt180catagtttgtcccaggattagaatgattaggcatcgaaccttcaagaatttgattgaata240aaacatcttcattcttaagatatgaagataatcttcaaaaggcccctgggaatctgaaag300aagagaagcaggcccatttatatgggaaagaacaatagtatttcttatataggcccattt360aagttgaaaacaatcttcaaaagtcccacatcgcttagataagaaaacgaagctgagttt420atatacagctagagtcgaagtagtgattgggacggcgtcgagaataaaggttttagagct480agaaatagcaagttaaaataaggctagtccgttatcaacttgaaaaagtggcaccgagtc540ggtgctttttttgccattcttttcaagctccattgtcaaattttcggggggttttgaagt600cgcctatctgaggttagtctctctgcatctgatca635<210>4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223><400>4ctttattctcgacgccgtcc20<210>5<211>20<212>RNA<213>人工序列<220><223><400>5ggacggcgucgagaauaaag20當(dāng)前第1頁1 2 3