本發(fā)明涉及一種鷹嘴豆防御素的制備方法及其應(yīng)用，是利用鷹嘴豆為原料制備的具有抗菌、抑癌活性的防御素，在醫(yī)藥衛(wèi)生領(lǐng)域具有很好的應(yīng)用前景。

背景技術(shù)：

抗生素的發(fā)現(xiàn)曾是人類醫(yī)學(xué)史上的一個里程碑，而由于抗生素的濫用帶來諸多新的問題，傳統(tǒng)抗生素的使用正面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，研究和應(yīng)用無毒、無公害、無耐藥的新型抗菌制劑替代抗生素已成發(fā)展趨勢?？咕淖鳛閭鹘y(tǒng)抗生素的可能替代物以其無比優(yōu)越的特性越來越成為人們關(guān)注的熱點。

抗菌肽(antibacterial peptide,ABP)又稱抗微生物肽(antimicrobial peptide,AMP)或肽抗生素(peptide antibiotics)，是廣泛存在于自然界生物中的一種具有抗茵、抗病毒、抗寄生蟲、提高機(jī)體免疫力等生物學(xué)功能的活性多肽，它是生物非特異性防御系統(tǒng)的免疫應(yīng)答產(chǎn)物，具有廣譜抗菌活性，不僅可以抑制多種細(xì)菌或真菌，甚至可以在不傷及正常細(xì)胞的情況下抑制動物體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞。傳統(tǒng)抗生素是通過消除微生物生長或生存必需的功能，如阻撓細(xì)菌蛋白質(zhì)的合成或者改變酶的活性來達(dá)到殺菌目的，而細(xì)菌通過改變一種基因就足以對付抗生素的這種進(jìn)攻?？咕膭t作用于細(xì)菌細(xì)胞膜，導(dǎo)致膜的通透性增大，以此穿透、殺滅細(xì)菌。細(xì)菌必須改變膜的結(jié)構(gòu)，即改變相當(dāng)部分的基因才能防御抗菌肽的進(jìn)攻，而這幾乎是不可能的。因此，抗菌肽極大地減少了產(chǎn)生耐藥性的可能，這也是與抗生素相比的一大優(yōu)勢?？咕氖莿游餀C(jī)體分泌的小分子短肽，也是機(jī)體成分之一，因此具有安全無毒副作用的生物學(xué)特性，從而避免了傳統(tǒng)抗生素類藥物對機(jī)體免疫系統(tǒng)的損害?？咕脑?00℃加熱10min條件下仍能保持活力，對pH值有較強(qiáng)適應(yīng)性，水溶性好?？咕膶φ５恼婧思?xì)胞幾乎沒有殺傷作用，只作用于原核細(xì)胞和發(fā)生病變的真核細(xì)胞。

根據(jù)來源不同，可將抗菌肽分為6類：昆蟲抗菌肽，哺乳動物抗菌肽，兩棲動物抗菌肽，魚類、軟體動物、甲殼類動物來源的抗菌肽，植物抗菌肽，細(xì)菌抗菌肽。其中，植物抗菌肽被稱為植物防御素。大多數(shù)植物抗菌肽對植物病原具有良好活性，部分植物抗菌肽對革蘭氏陽性菌、陰性菌、真菌、酵母及哺乳動物細(xì)胞均有毒性。

目前，新疆鷹嘴豆種植面積已超過20萬畝，年產(chǎn)上萬噸鷹嘴豆產(chǎn)品，資源豐富，將這一資源利用起來，將極大促進(jìn)鷹嘴豆科技附加值。因此，提取鷹嘴豆防御素，并開發(fā)相關(guān)的抗菌、抑癌醫(yī)藥產(chǎn)品，具有很強(qiáng)的現(xiàn)實意義。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的在于，提供一種鷹嘴豆防御素的制備方法及其應(yīng)用，該方法將鷹嘴豆粉碎并采用正己烷脫脂后，利用磷酸鹽緩沖溶液提取、硫酸銨沉淀，并經(jīng)陰、陽離子交換樹脂分離，超濾純化、HW-55F凝膠樹脂凝膠柱層析分離純化，得到分子量為5.483kDa的鷹嘴豆防御素，其N-端氨基酸序列為：N-丙氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-谷氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-蘇氨酸-酪氨酸-精氨酸-甘氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸，即H₂N-Ala-Cys-Cys-Glu-Asn-Lue-Ala-Asp-Thr-Tyr-Arg-Gly-Pro-Cys-Phe。屬于植物防御素一族，經(jīng)對本發(fā)明所述方法獲得的鷹嘴豆防御素進(jìn)行抑菌和抗癌活性實驗表明：該?dān)椬於狗烙貙瘘S色葡萄球菌或大腸桿菌具有較強(qiáng)的抑制作用，對人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2有很強(qiáng)的抑制作用(C₅₀值為1.74μg/mL)。

本發(fā)明所述的一種鷹嘴豆防御素的制備方法，該方法中的原料為鷹嘴豆，具體操作按下列步驟進(jìn)行：

a、將鷹嘴豆粉碎，過篩，并用正己烷或石油醚浸泡脫脂；

b、將步驟a所得脫脂的鷹嘴豆粉用磷酸鹽緩沖液溶解，溫度4℃，超聲30min，離心，棄去沉淀，得到鷹嘴豆多肽提取液；

c、將步驟b所得的鷹嘴豆多肽提取液中加入硫酸銨，使其飽和度為30％，攪拌溶解并靜置24h后，沉淀，溫度4℃，轉(zhuǎn)速12000rpm離心15min，取出沉淀除鹽干燥，得到粗多肽；

d、將二乙氨基乙基纖維素用水浸泡8-10h后，依次用0.5N的NaOH和HCl進(jìn)行處理，然后保存在水中，將處理好的二乙氨基乙基纖維素裝入25×150mm柱子內(nèi)，先用水沖洗，再用醋酸銨緩沖溶液0.05mol/L，pH＝9.0溶解步驟c所得粗多肽，溫度4℃，轉(zhuǎn)速10000rpm離心5min，去除沉淀，將上清液用處理后的二乙氨基乙基纖維素吸附，取二乙氨基乙基纖維素未吸附組分；

e、將陽離子交換樹脂CM-TSK-650M用水浸泡8-10h后，依次用0.5N的NaOH和HCl進(jìn)行處理，然后保存在水中，將處理好的陽離子交換樹脂CM-TSK-650M裝入15×100mm柱子內(nèi)，先用水沖洗，用0.05mol/L，pH＝5.0的醋酸銨緩沖溶液平衡，再將步驟d所得二乙氨基乙基纖維素未吸附組分用醋酸調(diào)pH為5.0，用處理后的陽離子交換樹脂CM-TSK-650M柱子進(jìn)行分離，取CM結(jié)合部位并透析脫鹽，干燥；

f、將步驟e得到的樣品用三蒸水溶解，使其濃度為1mg/mL，在溫度4℃，轉(zhuǎn)速10000rpm離心5min，去除沉淀，將上清液加入到截留分子量10kDa的超濾離心管中，溫度4℃，轉(zhuǎn)速3000rpm離心3min，收集并濃縮得到滲透組分；

g、將步驟f所得的滲透組分利用HW-55F凝膠樹脂進(jìn)行分離，純化，得到具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，Ala Cys Cys Glu Asn Lue Ala Asp Thr Tyr Arg Gly Pro Cys Phe的鷹嘴豆防御素。

所述方法獲得的鷹嘴豆防御素在制備抗金黃色葡萄球菌或大腸桿菌的藥物中的用途。

所述方法獲得的鷹嘴豆防御素在制備治療人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2的藥物中的用途。

通過本發(fā)明所述方法獲得的鷹嘴豆防御素(YZDCM)采用用液相色譜-質(zhì)譜分析方法和Edman降解法進(jìn)行鑒定：

(1)采用用液相色譜-質(zhì)譜分析鷹嘴豆防御素的分子量，具體檢測條件為：固體激光源，波長355nm；離子類型：正離子；檢測方式：線性方式(飛行管長1.22m，加速電壓20kV)；基質(zhì)：CHCA；

(2)采用Edman降解法測定鷹嘴豆防御素的氨基酸序列，其N-端氨基酸序列為：為N-丙氨酸-半胱氨酸-半胱氨酸-谷氨酸-天冬酰胺-亮氨酸-丙氨酸-天冬氨酸-蘇氨酸-酪氨酸-精氨酸-甘氨酸-脯氨酸-半胱氨酸-苯丙氨酸，即H₂N-Ala-Cys-Cys-Glu-Asn-Lue-Ala-Asp-Thr-Tyr-Arg-Gly-Pro-Cys-Phe，此多肽為首次從鷹嘴豆中分離得到；氨基酸序列分析圖見附圖。

本發(fā)明所述的一種鷹嘴豆防御素的制備方法及其應(yīng)用，該方法結(jié)合多肽類化合物的物理化學(xué)性質(zhì)、結(jié)合現(xiàn)代反相柱層析和超濾膜技術(shù)工藝制成的鷹嘴豆防御素粉。該方法得到的防御素是來自鷹嘴豆原料中的自然多肽，被驗證其具有抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌生物活性，對人結(jié)腸腺癌細(xì)胞具有很強(qiáng)的抑制作用，可開發(fā)制備抗金黃色葡萄球菌、大腸桿菌生物活性的藥物和制備抑制人結(jié)腸腺癌細(xì)胞的藥物。

附圖說明

圖1為本發(fā)明高效液相色譜分析鷹嘴豆籽粒的多肽成分圖譜；

圖2為本發(fā)明由飽和度30％的硫酸銨沉淀的鷹嘴豆多肽提取溶液的二乙氨基乙基纖維素洗脫曲線圖；

圖3為本發(fā)明由飽和度30％的硫酸銨沉淀的鷹嘴豆多肽提取溶液的二乙氨基乙基纖維素未吸附組分的CM洗脫曲線圖；

圖4為本發(fā)明由飽和度30％的硫酸銨沉淀的鷹嘴豆多肽提取溶液的沉淀部位堿性多肽組分的滲透組分的凝膠樹脂(型號：HW-55F)洗脫圖；

圖5為本發(fā)明鷹嘴豆防御素的液-質(zhì)圖；

圖6為本發(fā)明鷹嘴豆防御素對金黃色葡萄球菌的抑制作用圖；

圖7為本發(fā)明鷹嘴豆防御素對大腸桿菌的抑制作用圖。

具體實施方式

實施例1

a、將鷹嘴豆粉碎，過篩，并用正己烷浸泡脫脂；

b、將步驟a所得脫脂的鷹嘴豆粉10g用磷酸鹽緩沖液溶解，溫度4℃，超聲30min，離心，棄去沉淀，得到鷹嘴豆多肽提取液；

c、將步驟b所得的鷹嘴豆多肽提取液中加入硫酸銨，使其飽和度為30％，攪拌溶解并靜置24h后，沉淀，低溫，轉(zhuǎn)速12000rpm離心15min，取出沉淀除鹽干燥，得到粗多肽；

d、取100mL二乙氨基乙基纖維素DE-52用水浸泡8-10h后，依次用0.5N的NaOH和HCl進(jìn)行處理，然后保存在水中，將處理好的二乙氨基乙基纖維素DE-52裝入25×150mm柱子內(nèi)，先用水沖洗，再用醋酸銨緩沖溶液0.05mol/L，pH＝9.0溶解步驟c所得粗多肽，溫度4℃，轉(zhuǎn)速10000rpm離心5min，去除沉淀，將上清液用處理后的二乙氨基乙基纖維素吸附，取二乙氨基乙基纖維素未吸附組分；

e、取100mL陽離子交換樹脂CM-TSK-650M用水浸泡8-10h后，依次用0.5N的NaOH和HCl進(jìn)行處理，然后保存在水中，將處理好的陽離子交換樹脂CM-TSK-650M裝入15×100mm柱子內(nèi)，先用水沖洗，用0.05mol/L，pH＝5.0的醋酸銨緩沖溶液平衡，再將步驟d所得二乙氨基乙基纖維素未吸附組分用醋酸調(diào)pH為5.0，用處理后的陽離子交換樹脂CM-TSK-650M柱子進(jìn)行分離，取CM結(jié)合部位并透析脫鹽，干燥；

f、將步驟e得到的樣品水溶液，用三蒸水溶解，使其濃度為1mg/mL，在溫度4℃，轉(zhuǎn)速10000rpm離心5min，去除沉淀，將上清液加入到截留分子量10kDa的超濾離心管中，溫度4℃，轉(zhuǎn)速3000rpm離心3min，收集并濃縮得到滲透組分；

g、將步驟f所得的滲透組分1mL利用HW-55F(25×1000mm)凝膠樹脂進(jìn)行分離，純化，得到具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，Ala Cys Cys Glu Asn Lue Ala Asp Thr Tyr Arg Gly Pro Cys Phe的鷹嘴豆防御素(YZDCM)。

實施例2

a、將鷹嘴豆粉碎，過篩，并用石油醚浸泡脫脂；

b、將步驟a所得脫脂的鷹嘴豆粉10g用磷酸鹽緩沖液溶解，溫度4℃，超聲30min，離心，棄去沉淀，得到鷹嘴豆多肽提取液；

c、將步驟b所得的鷹嘴豆多肽提取液中加入硫酸銨，使其飽和度為30％，攪拌溶解并靜置24h后，沉淀，低溫，轉(zhuǎn)速12000rpm離心15min，取出沉淀除鹽干燥，得到粗多肽；

d、取100mL二乙氨基乙基纖維素DE-52用水浸泡8-10h后，依次用0.5N的NaOH和HCl進(jìn)行處理，然后保存在水中，將處理好的二乙氨基乙基纖維素DE-52裝入25×150mm柱子內(nèi)，先用水沖洗，再用醋酸銨緩沖溶液0.05mol/L，pH＝9.0溶解步驟c所得粗多肽，溫度4℃，轉(zhuǎn)速10000rpm離心5min，去除沉淀，將上清液用處理后的二乙氨基乙基纖維素吸附，取二乙氨基乙基纖維素未吸附組分；

e、取100mL陽離子交換樹脂CM-TSK-650M用水浸泡8-10h后，依次用0.5N的NaOH和HCl進(jìn)行處理，然后保存在水中，將處理好的陽離子交換樹脂CM-TSK-650M裝入15×100mm柱子內(nèi)，先用水沖洗，后用0.05mol/L，pH＝5.0的醋酸銨緩沖溶液平衡，再將步驟d所得二乙氨基乙基纖維素未吸附組分用醋酸調(diào)pH為5.0，用處理后的陽離子交換樹脂CM-TSK-650M柱子進(jìn)行分離，取CM結(jié)合部位并透析脫鹽，干燥；

f、將步驟e得到的樣品水溶液，用三蒸水溶解，使其濃度為1mg/mL，在溫度4℃，轉(zhuǎn)速10000rpm離心5min，去除沉淀，將上清液加入到截留分子量10kDa的超濾離心管中，溫度4℃，轉(zhuǎn)速3000rpm離心3min，收集并濃縮得到滲透組分；

g、將步驟f所得的滲透組分1mL利用HW-55F(25×1000mm)凝膠樹脂進(jìn)行分離，純化，得到具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列，Ala Cys Cys Glu Asn Lue Ala Asp Thr Tyr Arg Gly Pro Cys Phe的鷹嘴豆防御素(YZDCM)。

實施例3

所述方法獲得的鷹嘴豆防御素進(jìn)行抗菌活性檢驗：

對金黃色葡萄球菌或大腸桿菌菌株進(jìn)行培養(yǎng)，測定樣品對這兩種菌的抑制作用，并測定樣品對兩種菌的抑菌環(huán)大小，以此判斷樣品的抑菌能力，具體方法為：利用瓊脂平板法檢測樣品的抑菌活性；革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌和革蘭氏陰性菌大腸桿菌于LB液體培養(yǎng)基中，175rpm、溫度37℃，過夜培養(yǎng)至OD₆₀₀在2.0左右(1×10⁶CFU/mL)；取過夜培養(yǎng)的菌液10μL與8mL含0.7％瓊脂的LB培養(yǎng)基混勻后平鋪在含25mL 1.5％瓊脂的LB培養(yǎng)基上，當(dāng)頂層瓊脂凝固后，滴加用0.22μm微孔濾膜濾后的樣品溶液，溫度37℃過夜培養(yǎng)，測量抑菌環(huán)直徑，以氨芐青霉素為陽性對照，生理鹽水為陰性對照。

實施例4

所述方法獲得的鷹嘴豆多肽粉抑制人結(jié)腸腺癌細(xì)胞活性檢驗：

采用對人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2的抑制作用來測定鷹嘴豆中的多肽部位、組分和純化多肽抗腫瘤活性的能力，采用MTT分析法進(jìn)行測定：

Caco-2細(xì)胞置于含10％胎牛血清的杜爾伯科改良伊格爾(DMEM)培養(yǎng)基，溫度37℃、5％CO₂、100％濕度孵育箱培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗；取培養(yǎng)4-5天，處于指數(shù)生長期的細(xì)胞培養(yǎng)液一瓶，加入胰蛋白酶-乙二胺四乙酸液，使貼壁細(xì)胞脫落，用10mL含5％胎牛血清的洛斯維(RPMI)1640培養(yǎng)液配成懸液，用臺盼藍(lán)染色后，在血球計數(shù)板上做細(xì)胞計數(shù)，不著色的活細(xì)胞應(yīng)在97％以上；

用完全培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液，配成每100mL含5000-40000個細(xì)胞，取96孔平板，每孔加細(xì)胞懸液100μL，加細(xì)胞的過程應(yīng)控制在4h內(nèi)，將平板置于溫度37℃的5％CO₂溫箱24h；

受試化合物作5個稀釋度，最大濃度為10^-4mol/L，依次作1：10稀釋(10^-4，10^-5，10^-6，10^-7，10^-8mol/L)；文獻(xiàn)報道中天然產(chǎn)物的粗提物最大濃度用250μg/mL，也作1：10稀釋，樣品不需要加熱消毒或過濾，為了避免污染，在稀釋樣品用的完全培養(yǎng)基中加50μg/mL慶大霉素(Gentamicin)；

將平板在含5％CO₂空氣及100％濕度的溫箱中孵育2-4天；

噻唑藍(lán)(MTT)用無血清RPMI 1640培養(yǎng)液配成1mg/mL溶液，每孔加50μL，溫度37℃溫育4h，使噻唑藍(lán)(MTT)還原為甲臜；

吸出上清液，加入150μL的二甲基亞砜(DMSO)使甲臜溶解，用平板搖床(plate shaker)搖勻；

用自動化分光光度平板讀數(shù)計(Model 312，Biotech Research Laboratories，Inc.，Rockville，Md)在550nm處測定每個小孔的光密度；

結(jié)果分析：

細(xì)胞的存活率：將各測試孔的OD值減去本底OD值(完全培養(yǎng)基加噻唑藍(lán)(MTT)，無細(xì)胞)或空白藥物孔OD值(完全培養(yǎng)基，加受試藥物的不同稀釋度，加噻唑藍(lán)(MTT)，無細(xì)胞)，各重復(fù)孔的OD值取均數(shù)±SD；

細(xì)胞的存活率以T/C％表示，T為加藥細(xì)胞的OD值，C為對照細(xì)胞的OD值；

細(xì)胞存活率％＝(加藥細(xì)胞OD/對照細(xì)胞OD)×100

求出T/C＝50％時的藥物濃度(IC₅₀)。

從結(jié)果表明：鷹嘴豆防御素YZDCM對人結(jié)腸腺癌細(xì)胞Caco-2有很強(qiáng)的抑制作用，其IC₅₀的值為1.74μg/mL。

SEQUENCE LISTING

<110> 中國科學(xué)院新疆理化所

<120> 一種鷹嘴豆防御素的制備方法及應(yīng)用

<160> 1

<210> 1

<211> 15

<212> PRT

<213> 鷹嘴豆（Cicer arietinum L.）

<220>

<221>鷹嘴豆防御素ZYDCM

<400> 1

Ala Cys Cys Glu Asn Lue Ala Asp Thr Tyr Arg Gly Pro Cys Phe

1 5 10 15