本發(fā)明涉及植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及植物凝集素技術(shù)，具體涉及一種煙草凝集素蛋白及其編碼基因和在抗煙草青枯病中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

植物凝集素通常分為12個(gè)家族，分別是雙孢蘑菇家族(ABA)、莧科植物家族(Amaranthin)、幾丁質(zhì)酶相關(guān)蛋白家族(CRA)、藍(lán)藻凝集素家族(Cyanovirin)、衛(wèi)歐矛家族(Euonymus europaeus)、雪花蓮家族(Galanthus nivalis agglutinin)、橡膠蛋白家族(Hevein)、木菠蘿家族(Jacalins)、豆科家族(Legume lectin)、具有賴氨酸基序的蛋白(Lysin motif)、煙草凝集素家族(Nictaba)和蓖麻毒蛋白-B家族(Ricin-B families)。

煙草凝集素(Nictaba)于2002年第一次從煙草葉子中被分離出來。當(dāng)時(shí)發(fā)現(xiàn)：經(jīng)赤霉素(JA)處理過的煙草葉子產(chǎn)生一類凝集素(Lectin)，其cDNA序列由498個(gè)單核苷酸組成，可翻譯為165個(gè)氨基酸的無信號(hào)肽序列。蛋白質(zhì)序列分析發(fā)現(xiàn)其含有富含亮氨酸的結(jié)構(gòu)域。與其它凝集素不同的是，在酸性環(huán)境(pH<5)下，該蛋白可被激活，而在溫度高于55℃時(shí)則失活，其在煙草植株中各個(gè)部位都有分布。與植株的其他部分相比，葉子中Nictaba的含量更高，然而并不是在所有的煙草品種中都可以檢測(cè)到它的存在。

深入了解Nictaba蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)：Nictaba蛋白是一大類具有保守性結(jié)構(gòu)域的蛋白家族，不同家族成員之間的結(jié)構(gòu)與功能卻并不一定相同，其它作物中也有其同源結(jié)構(gòu)域。

一般認(rèn)為，煙草凝集素的生理功能由其糖結(jié)合特異性和其在細(xì)胞內(nèi)的位置決定(Lannoo et al.2006a；Schouppe et al.2011)。

Nictaba蛋白的功能在植物抗蟲害方面研究較多，在植物抗病性中的研究主要為抗真菌性病害和病毒性病害，極少見研究其與植物抗細(xì)菌性病害關(guān)系。

青枯病是煙草上的一種主要細(xì)菌性病害，研究表明，青枯病菌的致病機(jī)理主要是分泌胞外多糖阻塞植物導(dǎo)管。

煙草青枯病是熱帶、亞熱帶地區(qū)煙草的主要病害之一，目前在中國(guó)長(zhǎng)江流域及其以南煙區(qū)普遍發(fā)生，其中以廣東、福建、臺(tái)灣、湖南、江西、廣西東部、安徽南部、四川及貴州局部煙區(qū)為害嚴(yán)重，個(gè)別年份常常暴發(fā)流行，造成毀滅性損失。近幾年來，該病的發(fā)病和為害范圍有向北方煙區(qū)擴(kuò)展的趨勢(shì)，在山東、河南、陜西及遼寧等省都有發(fā)生，局部地區(qū)為害較重。目前該病造成的損失已居各類病害的第4位，必須重視該病的防治工作。

因此，研發(fā)新型有效的抗煙草青枯病藥劑具有重要的現(xiàn)實(shí)意義和廣闊的市場(chǎng)空間。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種具有抑制青枯病菌多糖作用的煙草凝集素蛋白。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述煙草凝集素蛋白的編碼基因序列。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供上述煙草凝集素蛋白在抗煙草青枯病中的應(yīng)用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明通過如下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)的：

一種煙草凝集素蛋白，該蛋白質(zhì)具有SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。

上述煙草凝集素蛋白的編碼基因序列具有SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4所示的核苷酸序列。

含有上述煙草凝集素蛋白的編碼基因序列的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系、表達(dá)盒或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明的煙草凝集素蛋白能夠有效抑制煙草青枯病菌分泌多糖，從而起到抗煙草青枯病菌的作用，因此，本發(fā)明的煙草凝集素蛋白可用于制備抗煙草青枯病菌的藥物，或者將本發(fā)明煙草凝集素蛋白的編碼基因按常規(guī)方法轉(zhuǎn)入植物中，可增強(qiáng)植物對(duì)煙草青枯病菌的抗性。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

1.本發(fā)明從煙草中分離煙草凝集素基因并利用無細(xì)胞表達(dá)技術(shù)生產(chǎn)出煙草凝集素蛋白，該蛋白質(zhì)可有效抑制煙草青枯病菌的多糖分泌，從而起到抗煙草青枯病的作用，增強(qiáng)該煙草凝集素蛋白基因在植物體內(nèi)的表達(dá)或?qū)⑵渲瞥伤巹┘纯稍鰪?qiáng)植物的抗病性又能保持優(yōu)良的經(jīng)濟(jì)性狀，而且可減少農(nóng)藥的使用，防止環(huán)境污染，適合在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模推廣；

2.本發(fā)明開拓了煙草凝集素蛋白在植物抗細(xì)菌性病害方面的研究，為煙草凝集素蛋白在植物抗病性的應(yīng)用中開拓了更廣闊的市場(chǎng)；

3.通過將本發(fā)明的煙草凝集素蛋白基因?qū)胫参镏?，不但能提高植物?duì)煙草青枯病菌的抗性，而且可減少農(nóng)藥的使用，防止環(huán)境污染，適合在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中大規(guī)模推廣。

附圖說明

圖1為PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖；

圖中，1為煙草抗病品種D101，2為廣東本地?zé)煵萜贩N大葉密合，3為煙草感病品種長(zhǎng)勃黃，4為廣東本地?zé)煵萜贩NGDSY-1；

圖2為煙草凝集素蛋白無細(xì)胞小量表達(dá)電泳檢測(cè)圖；

圖中，M為Marker，1為質(zhì)粒PAI-1603013/1615124-pET-B2M，2為無細(xì)胞小量表達(dá)的產(chǎn)物；

圖3為煙草凝集素蛋白無細(xì)胞大量表達(dá)電泳檢測(cè)圖；

圖中，M為Marker，1為無細(xì)胞大量表達(dá)的產(chǎn)物；

圖4為煙草凝集素蛋白的抑制青枯病菌多糖實(shí)驗(yàn)結(jié)果圖；

圖中，1為實(shí)驗(yàn)組，2為對(duì)照組。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步地描述，但具體實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何限定。

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

實(shí)施例1煙草凝集素蛋白及其編碼基因的獲得

煙草抗病品種D101、煙草感病品種長(zhǎng)勃黃、廣東本地?zé)煵萜贩N大葉密合和廣東本地?zé)煵萜贩NGDSY-1均由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供，也可由煙草國(guó)家種質(zhì)資源庫(kù)獲得。

將煙草抗病品種D101、煙草感病品種長(zhǎng)勃黃、廣東本地?zé)煵萜贩N大葉密合和廣東本地?zé)煵萜贩NGDSY-1分別在6～7片葉時(shí)接種青枯病菌，6小時(shí)后分別取葉片，提取蛋白質(zhì)，送交基因公司進(jìn)行差異蛋白分析，根據(jù)分析結(jié)果設(shè)計(jì)引物，引物序列如下所示：

HAV1c1L：5′-TAGCAATACAAGAAAGA-3′，具體如SEQ ID NO：5所示；

HAV1c1R：5′-TCAGAATAAGGTAATAAAG-3′，具體如SEQ ID NO：6所示。

用TAKARA公司的基因組總DNA提取試劑盒分別提取煙草抗病品種D101、煙草感病品種長(zhǎng)勃黃和廣東本地?zé)煵萜贩N大葉密合的基因組總DNA，然后以上述引物HAV1c1L和HAV1c1R分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系為：模板200ng，上下游引物(10μM)各2.5μl，2×PCR緩沖液25μl，ddH₂O補(bǔ)至50μl；所述2×PCR緩沖液由20mM Tris-HCl(pH8.3)、100μM dNTP、100mM KCl、3mM MgCl₂和0.1UTaq酶/μl組成。

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性5min；94℃變性40s，53℃退火40s，72℃延伸50s，30個(gè)循環(huán)；72℃終延伸7min；反應(yīng)終止4℃保存60min。

PCR擴(kuò)增電泳結(jié)果如圖1所示，4個(gè)電泳樣品均得到單一條帶。

用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒(Takara，Bio USA)將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化后進(jìn)行測(cè)序，以DNAMAN軟件進(jìn)行開放閱讀框分析，最終獲得煙草凝集素蛋白的編碼基因序列，具體如下所示：

1號(hào)煙草凝集素蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示，該序列來自于煙草抗病品種D101和廣東本地?zé)煵萜贩N大葉密合；

2號(hào)煙草凝集素蛋白的編碼基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，該序列來自于煙草感病品種長(zhǎng)勃黃；

核苷酸序列SEQ ID NO：3和核苷酸序列SEQ ID NO：4僅有1個(gè)堿基的差異，既第16位的堿基上存在c/t的差異。

翻譯后，1號(hào)煙草凝集素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，2號(hào)煙草凝集素蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

將上述兩個(gè)氨基酸序列進(jìn)行NCBI和solgenomics.net等蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，未發(fā)現(xiàn)匹配序列，因此，本實(shí)施例獲得的煙草凝集素蛋白基因?yàn)樾禄颉?/p>

實(shí)施例2煙草凝集素蛋白的體外無細(xì)胞表達(dá)

本實(shí)施例選擇1號(hào)煙草凝集素蛋白進(jìn)行體外無細(xì)胞表達(dá)，具體操作是采用金開瑞的體外無細(xì)胞蛋白表達(dá)系統(tǒng)先對(duì)1號(hào)煙草凝集素蛋白進(jìn)行無細(xì)胞小量反應(yīng)及檢測(cè)，然后再進(jìn)行無細(xì)胞大量表達(dá)并純化。

詳細(xì)步驟如下所示：

1、Top10克隆菌株的獲得

使用Takara pMD-19Ligation Kit將1號(hào)煙草凝集素蛋白的編碼基因(其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示)連接到克隆載體pMD-19上，雙酶切驗(yàn)證克隆成功的重組表達(dá)載體經(jīng)農(nóng)桿菌感染法轉(zhuǎn)入大腸桿菌Top10(按照Top10克隆菌株試劑盒操作)，篩選鑒定得到含有1號(hào)煙草凝集素蛋白編碼基因的Top10克隆菌株。

2、抽質(zhì)粒

將37℃，過夜培養(yǎng)于200mlLB培養(yǎng)基中的Top10克隆菌株，按照Promega抽質(zhì)粒試劑盒說明，抽質(zhì)粒，并命名為PAI-1603013/1615124-pET-B2M。

PAI-1603013/1615124-pET-B2M的濃度為1215ng/μl，質(zhì)量達(dá)到體外轉(zhuǎn)錄翻譯標(biāo)準(zhǔn)。

3、無細(xì)胞小量表達(dá)

無細(xì)胞小量表達(dá)反應(yīng)體系和方法均參照相應(yīng)試劑盒進(jìn)行，具體如下所示：

反應(yīng)體系各試劑組分：(1)12μl大腸桿菌抽提物，(2)轉(zhuǎn)錄酶RNA、聚合酶和tRNA的反應(yīng)混合物10μl，(3)16μl混合AA(Gly、Lys、Glu)，(4)2μl蛋氨酸，(5)2μl重組質(zhì)粒DNA，(6)5μl pH＝8.0的TE緩沖液(7)8μl水。

將上述反應(yīng)體系各試劑組分按(1)-(7)的順序加入到55ul的反應(yīng)杯中，再加入上述制備的質(zhì)粒PAI-1603013/1615124-pET-B2M，無細(xì)胞小量表達(dá)的反應(yīng)體系為55μl，然后置于30℃搖床中，180rpm，過夜，然后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。

圖2中2號(hào)泳道的樣品即為無細(xì)胞小量表達(dá)的目的蛋白(煙草凝集素蛋白)，從圖中可以看出，在25-30kDa之間產(chǎn)生大量表達(dá)的目的蛋白(煙草凝集素蛋白)。

4、無細(xì)胞大量表達(dá)及純化

4.1無細(xì)胞大量表達(dá)

無細(xì)胞大量表達(dá)是將前述的無細(xì)胞小量表達(dá)的反應(yīng)體系擴(kuò)大至2ml，其余與無細(xì)胞小量表達(dá)一致。

無細(xì)胞大量表達(dá)的電泳圖如圖3所示，從圖中可以看出，目的蛋白(煙草凝集素蛋白)被大量表達(dá)。

4.2蛋白純化

對(duì)上述無細(xì)胞大量表達(dá)的混合物進(jìn)行目的蛋白(煙草凝集素蛋白)的純化，純化步驟如下所示：

(1)取層析柱，用3倍柱床體積的去離子水沖洗柱床；

(2)用3倍柱床體積的NTA-0緩沖液沖洗柱床；

(3)用5倍柱床體積的0.1M NiSO₄緩沖液沖洗柱床；

(4)用2倍柱床體積的醋酸鈉-氯化鈉(pH4.0)溶液沖洗柱床；

(5)用3倍柱床體積的NTA-0緩沖液沖洗柱床；

(6)將無細(xì)胞大量表達(dá)的混合物上清濃縮后，用1MTris pH9.0調(diào)其pH至8.0后作為純化樣品，以1ml/min的流速將該純化樣品過柱；

(7)上樣結(jié)束后，用溶液NTA-0沖洗柱床到G250檢測(cè)基本不顯色；

(8)用250mM咪唑沖洗柱床；G250檢測(cè)有藍(lán)色開始收集洗脫峰，G250檢測(cè)基本無色停止收集洗脫峰；本步驟收集的洗脫液即為純化的目的蛋白(煙草凝集素蛋白)；

(9)用3倍柱床體積的0.1M EDTA沖洗柱床后再用水沖洗柱床，至pH試紙檢測(cè)流出液為中性，最后用3倍柱床體積的質(zhì)量百分比為20％的乙醇溶液沖洗后，封柱置于4℃。

NTA-0緩沖液配方：稱取Tris12.11g、氯化鈉146.1g、甘油500mL、濃鹽酸6mL，加水溶解定溶到5L。

0.1M NiSO₄配方：稱取26.28g硫酸鎳加水溶解定溶到1L。

醋酸鈉-氯化鈉溶液配方：稱取1.64g醋酸鈉、29.25g氯化鈉、濃鹽酸1.17mL，加水定溶到1L。

250mM咪唑配方：稱取8.5g咪唑、濃鹽酸0.17mL，加水定容至500mL。

0.1M EDTA溶液配方：稱取18.61g Na 2EDTA，2gNaOH，加水定容至500mL。

實(shí)施例3煙草凝集素蛋白抑制青枯病菌多糖實(shí)驗(yàn)

1、TZC固體培養(yǎng)基的配制：葡萄糖5.0g，蛋白胨10g，酸水解酪蛋白1g，TTC(2,3,5–氯化三苯基四氮唑)0.05g，瓊脂粉15g，pH 7.0，定容到1L，121℃滅菌20min后倒平板。

2、青枯病菌懸液制備：挑取活化的青枯病菌(青枯病菌由廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所提供)單菌落，加入到50ul無菌水中，用槍頭吹打均勻備用。

3、實(shí)驗(yàn)樣品：將實(shí)施例2無細(xì)胞大量表達(dá)純化得到的煙草凝集素蛋白溶解于pH＝8.0的TE緩沖液中，配制得到煙草凝集素蛋白中濃度為200μg/ml的實(shí)驗(yàn)樣品；所述pH＝8.0的TE緩沖液配制方法是將1M Tris-HCl Buffer(PH＝8.0)5ml和0.5M EDTA(PH＝8.0)5ml加入到燒杯中，再加入400mldd H₂O均勻混合；將溶液定容到500ml后，高溫高壓滅菌，室溫保存。

4、本實(shí)施例分為對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組

對(duì)照組：在平板中間滴入10uL無菌水，在水滴中間接種5ul青枯病菌懸液；

實(shí)驗(yàn)組：在平板中間滴入10uL濃度為200μg/ml的實(shí)驗(yàn)樣品，在實(shí)驗(yàn)樣品中間接種5ul青枯病菌懸液。

將對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組均置于28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，觀察菌落生長(zhǎng)情況。

5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示

從圖4可以看出，加入煙草凝集素蛋白的菌落顏色為白色，未發(fā)生顯色反應(yīng)，菌落形態(tài)扁平，青枯病菌未分泌多糖或者極少分泌，流動(dòng)性極弱。而正常生長(zhǎng)的菌落呈水滴狀，發(fā)生顯色反應(yīng)，菌落顏色為紅色，菌落外圍被一層厚厚的多糖分泌物包裹，流動(dòng)性強(qiáng)。

由此所示，本發(fā)明的煙草凝集素蛋白對(duì)青枯病菌有很好地抗性。

　　　　　　　　　　 SEQUENCE LISTING

<110> 廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所

<120> 一種煙草凝集素蛋白及其編碼基因和應(yīng)用

<130> 11

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 103

<212> PRT

<213> 煙草（ Nicotiana tabacum L.）

<400> 1

Met Ser Lys Pro Leu Thr Met Met Pro Asp Phe Gln Val Pro Leu Leu

1 5 10 15

Ile Ser Ile Asn Leu Ile Ser Thr Ser Pro Ser Ser Pro Lys Leu Leu

20 25 30

Lys Asn Ser Pro Ser Leu Ile Ser Asn Gln Pro Ser Leu Arg Arg Cys

35 40 45

Gly Asn Arg Pro Ser Ser Pro Gly Asn Ser Phe Phe Phe Glu Met Lys

50 55 60

Thr Val Val Pro Ser Met Pro Ala Pro Ser Ala Thr Ser Phe Thr Asn

65 70 75 80

Leu Ser Asp Ala Val Ala Arg Ser Ser Ser Arg Gly Leu Ser Val Asn

85 90 95

Leu Asn Thr Lys Tyr Thr Ala

100

<210> 2

<211> 103

<212> PRT

<213> 煙草（ Nicotiana tabacum L.）

<400> 2

Met Ser Lys Pro Leu Thr Met Met Pro Asp Phe Gln Val Ser Leu Leu

1 5 10 15

Ile Ser Ile Asn Leu Ile Ser Thr Ser Pro Ser Ser Pro Lys Leu Leu

20 25 30

Lys Asn Ser Pro Ser Leu Ile Ser Asn Gln Pro Ser Leu Arg Arg Cys

35 40 45

Gly Asn Arg Pro Ser Ser Pro Gly Asn Ser Phe Phe Phe Glu Met Lys

50 55 60

Thr Val Val Pro Ser Met Pro Ala Pro Ser Ala Thr Ser Phe Thr Asn

65 70 75 80

Leu Ser Asp Ala Val Ala Arg Ser Ser Ser Arg Gly Leu Ser Val Asn

85 90 95

Leu Asn Thr Lys Tyr Thr Ala

100

<210> 3

<211> 309

<212> DNA

<213> 煙草（ Nicotiana tabacum L.）

<400> 3

atgtcgaagc ccttaacgat gatgcctgat ttccaagtgc cgttattgat ttccatcaac 60

ctcatttcga cttcaccatc ctctcctaag ttgttgaaaa actcaccaag cttgatttct 120

aaccagccat cacttcggag atgtgggaac cggccaagtt ctcctggtaa ttcctttttc 180

tttgagatga aaacagtggt accctcaatg ccagcgccct ccgccacttc gttcacaaat 240

cttagcgatg ctgtggctcg ttcaagttca cgagggttat ctgttaactt gaacactaaa 300

tatacagca 309

<210> 4

<211> 309

<212> DNA

<213> 煙草（ Nicotiana tabacum L.）

<400> 4

atgtcgaagc ccttaacgat gatgcctgat ttccaagtgt cgttattgat ttccatcaac 60

ctcatttcga cttcaccatc ctctcctaag ttgttgaaaa actcaccaag cttgatttct 120

aaccagccat cacttcggag atgtgggaac cggccaagtt ctcctggtaa ttcctttttc 180

tttgagatga aaacagtggt accctcaatg ccagcgccct ccgccacttc gttcacaaat 240

cttagcgatg ctgtggctcg ttcaagttca cgagggttat ctgttaactt gaacactaaa 300

tatacagca 309

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tagcaataca agaaaga 17

<210> 6

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tcagaataag gtaataaag 19