技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的反應(yīng)培養(yǎng)基。本發(fā)明還涉及這種培養(yǎng)基的用途以及鑒定MRSA細(xì)菌的方法。
背景技術(shù)：
：甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)是金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)菌株，其特征在于它們對抗生素甲氧西林的抗性以及對諸如苯唑西林的相關(guān)抗生素的抗性。MRSA細(xì)菌代表了高百分比的醫(yī)院感染，并且通常產(chǎn)生嚴(yán)重和潛在致死的健康問題。MRSA在患者之間通常經(jīng)由醫(yī)護(hù)人員交叉?zhèn)鞑?，其是非常難以控制的流行性感染。除了合適的治療以外，篩選MRSA的載體并分離受感染的患者構(gòu)成了目前諸如美國醫(yī)療保健流行病學(xué)學(xué)會(SocietyforHealthcareEpidemiologyofAmerica)的官方組織所推薦的最有效的方法。因此，早期和系統(tǒng)性篩選是重要的?？梢酝ㄟ^各種技術(shù)來檢測MRSA。因此，可以通過分子生物學(xué)技術(shù)來檢測MRSA。在這一方面，可以具體提及申請EP887424。然而，這樣的方法作為常規(guī)測試非常昂貴，并且要求合格的操作人員?？梢允褂贸Ｒ?guī)培養(yǎng)基來檢測金黃色葡萄球菌，例如申請EP1390524所述的培養(yǎng)基。通過特異性凝集測試(SlidexMRSA,bioMérieux)或者通過瓊脂擴(kuò)散法在苯唑西林、頭孢西丁或拉氧頭孢盤的存在下(Comitédel’AntibiogrammedelaSociétédeMicrobiologie[AntibiogramCommitteeoftheFrenchSocietyforMicrobiology]和ClinicalLaboratoryStandardInstitute的推薦)，以額外的步驟檢測MRSA。還可以在抗生素的存在下，在瓊脂培養(yǎng)基上培養(yǎng)可能是MRSA的細(xì)菌。這樣的培養(yǎng)基可以是發(fā)色的，由此有助于讀取并檢測MRSA。可以特別地提及申請EP1543147所述的培養(yǎng)基。然而，由于在所述條件下檢測磷酸酯酶活性并不是非常特異性的，因此需要將其與幾種其他酶活性的檢測組合，由此降低了培養(yǎng)基的利用率并增加了成本。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明通過提供新型靈敏特異性反應(yīng)培養(yǎng)基來解決現(xiàn)有技術(shù)的問題，所述反應(yīng)培養(yǎng)基允許分離并快速鑒定甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)。本發(fā)明人令人驚奇地證實(shí)，使用包括頭孢菌素與氨基糖苷的抗生素的特定組合，使得可以獲得用于分離和鑒定甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的完美反應(yīng)培養(yǎng)基。在進(jìn)一步描述本發(fā)明之前，為了便于更清楚地理解本發(fā)明而不作為限制給出以下定義。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語“反應(yīng)培養(yǎng)基”表示這樣的培養(yǎng)基，其包含諸如金黃色葡萄球菌的微生物的存活和/生長所需的所有成分。所述反應(yīng)培養(yǎng)基可以僅是顯示性培養(yǎng)基，或者是培養(yǎng)且顯示性的培養(yǎng)基。在第一種情況中，微生物的培養(yǎng)在接種之前進(jìn)行；在第二種情況中，反應(yīng)培養(yǎng)基也構(gòu)成培養(yǎng)性培養(yǎng)基。所述反應(yīng)培養(yǎng)基可以是固體、半固體或者液體。術(shù)語“固體培養(yǎng)基”是指，例如膠凝化的培養(yǎng)基。優(yōu)選地，本發(fā)明的培養(yǎng)基是膠凝化的培養(yǎng)基。瓊脂是常規(guī)的凝膠劑，在微生物學(xué)中用于培養(yǎng)微生物，但是可使用其他膠凝劑，例如脫乙酰吉蘭糖膠(gelrite)、明膠或瓊脂糖?？缮藤彨@得某些配制品，例如Columbia瓊脂、胰蛋白酶解酪蛋白-大豆瓊脂(géloseTrypcase-soja)、MacConkey瓊脂、Chapman瓊脂、Sabouraud瓊脂，或者，更概括地，HandbookofMicrobiologicalMedia(CRCPress)中所述的那些。本發(fā)明的反應(yīng)培養(yǎng)基可以包含可能的其他添加劑，例如蛋白胨、一種或多種生長因子、碳水化合物、一種或多種選擇劑、緩沖液、一種或多種膠凝劑等。所述反應(yīng)培養(yǎng)基可以是可即用的液體或凝膠形式，即可即用于接種于試管或燒瓶或培養(yǎng)皿。當(dāng)表現(xiàn)形式為燒瓶中的凝膠時，優(yōu)選地在倒入培養(yǎng)皿之前進(jìn)行培養(yǎng)基的預(yù)先再生(改變至100℃)。優(yōu)選地，本發(fā)明的培養(yǎng)基為選擇培養(yǎng)基，即包含有利于金黃色葡萄球菌生長的抑制劑的培養(yǎng)基?？梢跃唧w地提及氯化鋰(LiCl)、疊氮化鈉(NaN3)、多粘菌素E(Colistine)、兩性霉素、氨曲南、可利邁仙、氯化鈉(NaCl)、去鐵胺和弧菌抑制化合物O/129。對于本發(fā)明的目的，酶促或代謝活性的底物選自任何底物，其可以被水解以產(chǎn)生允許直接或間接檢測酶促或代謝活性的產(chǎn)物，例如，特別是糖苷酶活性，優(yōu)選葡糖醛酸糖苷酶、葡糖苷酶或半乳糖苷酶活性。所述底物可以是天然或合成底物。底物的代謝導(dǎo)致反應(yīng)培養(yǎng)基或有機(jī)體的細(xì)胞的物理化學(xué)性質(zhì)的改變。這種改變可以通過物理化學(xué)方法來檢測，特別是操作者可視的光學(xué)方法，或者通過光譜、電學(xué)、磁性等裝置來檢測。優(yōu)選地，所述改變是光學(xué)性質(zhì)的改變，例如吸收、熒光或發(fā)光(luminescence)的變化。在本發(fā)明中，術(shù)語“顯色”涵蓋染色，其是可見光譜的光的吸收；或者熒光，其是在一種波長吸收(λex)并在更高的波長發(fā)射(λem，λem>λex)。對于本發(fā)明的目的，術(shù)語發(fā)色底物表示任何底物，其可以被水解以產(chǎn)生允許直接或間接檢測酶活性的產(chǎn)物，例如，特別是糖苷酶活性，優(yōu)選α-葡糖苷酶活性、酯酶活性，優(yōu)選磷酸酯酶活性或肽酶活性，優(yōu)選凝固酶活性?？梢跃唧w的提及基于吲哚氧基、黃酮、茜素、吖啶、吩噁嗪、硝基酚、硝基苯胺、萘酚、兒茶酚、羥基喹啉、香豆素或羥基苯基喹啉噁唑-4-酮(hydroxyphenyl-quinoxazol-4-one)的底物。優(yōu)選地，本發(fā)明所用的底物基于吲哚氧基。作為α-葡糖苷酶底物，可以更具體地提及以下底物：5-溴-6-氯-3-吲哚氧基-α-葡糖苷、二羥基黃酮-α-葡糖苷、3,4-環(huán)己酮七葉苷-α-葡糖苷、8-羥基喹啉-α-葡糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-葡糖苷、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-葡糖苷、6-氯-3-吲哚氧基-α-葡糖苷、5-溴-3-吲哚氧基-α-葡糖苷、5-碘-3-吲哚氧基-α-葡糖苷、6-氟-3-吲哚氧基-α-葡糖苷、茜素-α-葡糖苷、硝基苯基-α-葡糖苷、4-甲基傘形酮-α-葡糖苷、萘酚苯因-α-葡糖苷(naphtholbenzein-alpha-glucoside)、吲哚氧基-N-甲基-α-葡糖苷、萘基-α-葡糖苷、氨基苯基-α-葡糖苷、二氯氨基苯基-α-葡糖苷。優(yōu)選地，所用的α-葡糖苷酶底物為5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-葡糖苷或5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-葡糖苷。作為磷酸酯酶底物，可以更具體地提及以下底物：5-溴-6-氯-3-吲哚氧基磷酸酯、3,4-環(huán)己酮七葉苷磷酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基磷酸酯、5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基磷酸酯、6-氯-3-吲哚氧基磷酸酯、5-溴-3-吲哚氧基磷酸酯、5-碘-3-吲哚氧基磷酸酯、6-氟-3-吲哚氧基磷酸酯、硝基苯基磷酸酯、4-甲基傘形酮磷酸酯、吲哚氧基-N-甲基磷酸酯、萘基磷酸酯、ELF97-磷酸酯。優(yōu)選地，所用的磷酸酯酶底物為6-氯-3-吲哚氧基磷酸酯。本發(fā)明所用底物可以與其他底物組合，例如糖苷酶、酯酶，特別是磷酸酯酶或磷脂酶、肽酶，并且特別是凝固酶的底物。特別地，所述培養(yǎng)基可以包含兩種α-葡糖苷酶底物。本發(fā)明的底物可以用于寬pH范圍，特別是pH5.5-10，優(yōu)選6.5-9。對于本發(fā)明的目的，屬于頭孢菌素家族的抗生素為優(yōu)選自以下的抗生素：ο第一代頭孢菌素，例如頭孢氨芐、頭孢噻啶、頭孢噻吩、頭孢唑啉、頭孢羥氨芐、頭孢西酮、頭孢曲秦、頭孢匹林、頭孢拉定、頭孢乙腈、cefrodaxine、頭孢替唑。ο第二代頭孢菌素，例如頭孢西丁、頭孢呋辛、頭孢孟多、頭孢克洛、頭孢替坦、頭孢尼西、頭孢替安、氯碳頭孢、頭孢美唑、頭孢丙烯、頭孢雷特、頭孢米諾。ο第三代頭孢菌素，例如頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢磺啶、頭孢曲松、頭孢甲肟、拉氧頭孢、頭孢唑肟、頭孢克肟、頭孢地秦、頭孢他美、頭孢匹胺、頭孢哌酮、頭孢泊肟、頭孢布烯、頭孢地尼、頭孢托侖、頭孢曲松、頭孢哌酮、頭孢拉宗、頭孢地尼。ο第四代頭孢菌素，例如頭孢吡肟、頭孢匹羅。在本發(fā)明中，屬于頭孢菌素家族的抗生素優(yōu)選為頭孢米諾或頭孢地尼。對于本發(fā)明的目的，屬于氨基糖苷家族的抗生素為優(yōu)選自以下的抗生素：阿米卡星、慶大霉素、異帕米星、卡那霉素、奈替米星、鏈霉素和妥布霉素。在本發(fā)明中，屬于氨基糖苷家族的抗生素優(yōu)選為阿米卡星或卡那霉素。術(shù)語生物學(xué)樣品表示臨床樣品，其源自支氣管、氣管或肺穿刺樣本、胸液樣本、支氣管肺泡灌洗樣本、痰樣本、血液樣本或肺活檢樣本、或關(guān)節(jié)液樣本或者心包液樣本；生物學(xué)流體或食品樣品，其源自任何類型的食品或表面樣本。因此，所述樣品可以是液體或固體的，以非限制性的方式可以提及血液、血漿、尿液或糞便的臨床樣品，或者來自鼻、會陰、喉、皮膚、傷口或腦脊液的樣品，或者食品樣品。因此，術(shù)語“樣品”是指樣本本身(拭子、糞便、食物等)以及由所述樣本而得的微生物菌落(例如在膠凝化的培養(yǎng)基上分離后，或者用所述樣本接種的富集培養(yǎng)液)。在這一方面，本發(fā)明涉及用于檢測和/或鑒定甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的反應(yīng)培養(yǎng)基，其包含發(fā)色底物；屬于頭孢菌素家族的第一抗生素；和屬于氨基糖苷家族的第二抗生素。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案，所述第一抗生素為頭孢米諾或頭孢地尼。優(yōu)選地，頭孢米諾濃度為10-35mg/l，優(yōu)選12-28mg/l。優(yōu)選地，頭孢地尼濃度為0.1-1mg/l，優(yōu)選0.2-0.6mg/l。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案，所述第二抗生素為卡那霉素或阿米卡星。優(yōu)選地，卡那霉素濃度為0.2-1.5mg/l，優(yōu)選0.5-1.25mg/l。優(yōu)選地，阿米卡星濃度為0.5-5mg/l，優(yōu)選1-2mg/l。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案，兩種抗生素的組合包括頭孢米諾和卡那霉素。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，兩種抗生素的組合包括頭孢米諾和阿米卡星。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，兩種抗生素的組合包括頭孢地尼和卡那霉素。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，兩種抗生素的組合包括頭孢地尼和阿米卡星。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案，所述發(fā)色底物允許檢測糖苷酶、酯酶或肽酶活性。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案，所述糖苷酶活性為α-葡糖苷酶活性。所述α-葡糖苷酶活性的底物優(yōu)選為吲哚氧基-α-葡糖苷。優(yōu)選地，所用的底物為5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-葡糖苷(X-α-葡糖苷)或5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-葡糖苷(GreenA-α-葡糖苷)。優(yōu)選地，所述底物在培養(yǎng)基中存在的濃度為0.01-0.2g/l，優(yōu)選0.03-0.15g/l。事實(shí)上，在這種底物濃度下獲得更好的顯色對照。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案，所述酯酶活性為磷酸酯酶活性。優(yōu)選地，所用的底物為6-氯-3-吲哚氧基磷酸酯(粉紅色-磷酸酯)。優(yōu)選地，所述底物存在于培養(yǎng)基中的濃度為0.05-0.5g/l，優(yōu)選0.1-0.4g/l。事實(shí)上，在這種底物濃度下獲得更好的顯色對照。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施方案，所述反應(yīng)培養(yǎng)基還包含第二酶底物。優(yōu)選地，所述第二底物為α-葡糖苷酶底物。優(yōu)選地，所述第一底物為α-葡糖苷酶底物，優(yōu)選X-α-葡糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-葡糖苷)；并且所述第二底物為α-葡糖苷酶底物，優(yōu)選GreenA-α-葡糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-葡糖苷)。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案，所述培養(yǎng)基還包含有利于金黃色葡萄球菌生長的至少一種抑制劑，例如氯化鋰(LiCl)、疊氮化鈉(NaN3)、多粘菌素E、兩性霉素、氨曲南、多粘菌素、氯化鈉(NaCl)和去鐵胺。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案，所述培養(yǎng)基還包含抑制劑的混合物，所述混合物包含有利于金黃色葡萄球菌生長的四種抑制劑，所述抑制劑為LiCl、弧菌抑制化合物O/129、氨曲南和兩性霉素。本發(fā)明還涉及如上文定義的反應(yīng)培養(yǎng)基的體外用途，其用于分離和鑒定甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)。本發(fā)明還涉及檢測和/或鑒定生物學(xué)樣品中的甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述方法包括：a)將可能包含甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的生物學(xué)樣品接種于上文所定義的反應(yīng)培養(yǎng)基上；b)進(jìn)行溫育；c)鑒定是MRSA菌落的菌落。所述溫育優(yōu)選在30℃-42℃的溫度下進(jìn)行。MRSA優(yōu)選通過一種或兩種α-葡糖苷酶活性或磷酸酯酶活性來檢測，這使得可以獲得顯色或熒光菌落。其他種的葡萄球菌(Staphylococcus)看起來是無色的，或者具有不同于金黃色葡萄球菌(S.aureus)菌落的顏色或熒光。步驟a)之前可以進(jìn)行選擇或非選擇培養(yǎng)基中的預(yù)富集步驟。本發(fā)明還涉及用于檢測和/或鑒定甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的反應(yīng)培養(yǎng)基，其包含酶促或代謝活性的底物；第一抗生素，其選自頭孢地尼和頭孢米諾；以及第二抗生素，其屬于氨基糖苷家族。優(yōu)選地，頭孢米諾濃度為10-35mg/l，優(yōu)選12-28mg/l。優(yōu)選地，頭孢地尼濃度為0.1-1mg/l，優(yōu)選0.2-0.6mg/l。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案，所述第二抗生素為卡那霉素或阿米卡星。優(yōu)選地，卡那霉素濃度為0.2-1.5mg/l，優(yōu)選0.5-1.25mg/l。優(yōu)選地，阿米卡星濃度為0.5-5mg/l，優(yōu)選1-2mg/l。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案，兩種抗生素的組合包括頭孢米諾和卡那霉素。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，兩種抗生素的組合包括頭孢米諾和阿米卡星。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，兩種抗生素的組合包括頭孢地尼和卡那霉素。根據(jù)本發(fā)明的另一優(yōu)選實(shí)施方案，兩種抗生素的組合包括頭孢地尼和阿米卡星。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案，所述酶促或代謝活性的底物允許檢測糖苷酶、酯酶或肽酶活性。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案，所述糖苷酶活性為α-葡糖苷酶活性。所述α-葡糖苷酶活性的底物優(yōu)選為吲哚氧基-α-葡糖苷。優(yōu)選地，所用的底物為5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-葡糖苷(X-α-葡糖苷)或5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-葡糖苷(GreenA-α-葡糖苷)。優(yōu)選地，所述底物存在于培養(yǎng)基中的濃度為0.01-0.2g/l，優(yōu)選0.03-0.15g/l。事實(shí)上，在這種底物濃度下獲得更好的顯色對照。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案，所述酯酶活性為磷酸酯酶活性。優(yōu)選地，所用的底物為6-氯-3-吲哚氧基磷酸酯(粉紅色-磷酸酯)。優(yōu)選地，所述底物存在于培養(yǎng)基中的濃度為0.05-0.5g/l，優(yōu)選0.1-0.4g/l。事實(shí)上，在這種底物濃度下獲得更好的顯色對照。根據(jù)本發(fā)明的一具體實(shí)施方案，所述反應(yīng)培養(yǎng)基還包含第二酶底物。優(yōu)選地，所述第二底物為α-葡糖苷酶底物。優(yōu)選地，所述第一底物為α-葡糖苷酶底物，優(yōu)選X-α-葡糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-α-葡糖苷)；并且所述第二底物為α-葡糖苷酶底物，優(yōu)選GreenA-α-葡糖苷(5-溴-4-氯-3-吲哚氧基-N-甲基-α-葡糖苷)。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案，所述培養(yǎng)基還包含有利于金黃色葡萄球菌生長的至少一種抑制劑，例如氯化鋰(LiCl)、疊氮化鈉(NaN3)、多粘菌素E、兩性霉素、氨曲南、多粘菌素(polymixines)、氯化鈉(NaCl)和去鐵胺。根據(jù)本發(fā)明的一優(yōu)選實(shí)施方案，所述培養(yǎng)基還包含抑制劑的混合物，所述混合物包含有利于金黃色葡萄球菌生長的四種抑制劑，所述抑制劑為LiCl、弧菌抑制化合物O/129、氨曲南和兩性霉素。本發(fā)明還涉及如上文定義的反應(yīng)培養(yǎng)基的體外用途，其用于分離和鑒定甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)。本發(fā)明還涉及檢測和/或鑒定生物學(xué)樣品中的甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的方法，所述方法包括：a)將可能包含甲氧西林抗性金黃色葡萄球菌(MRSA)的生物學(xué)樣品接種于上文所定義的反應(yīng)培養(yǎng)基上；b)進(jìn)行溫育；c)鑒定MRSA菌落。所述溫育優(yōu)選在30℃-42℃的溫度下進(jìn)行。MRSA優(yōu)選通過一種或兩種α-葡糖苷酶活性或磷酸酯酶活性來檢測，這使得可以獲得顯色或熒光菌落。其他種的葡萄球菌看起來是無色的，或者具有不同于金黃色葡萄球菌菌落的顏色或熒光。步驟a)之前可以進(jìn)行選擇或非選擇培養(yǎng)基中的預(yù)富集步驟。具體實(shí)施方式以示例且不宜任何限定的方式給出以下的實(shí)施例。這使得可以更清楚地理解本發(fā)明。實(shí)施例1包含頭孢米諾–卡那霉素抗生素組合和各種發(fā)色底物的MRSA培養(yǎng)基1.制備本發(fā)明的培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)中測試的培養(yǎng)基如下：培養(yǎng)基T：chromIDMRSA對照培養(yǎng)基(ref.43451).培養(yǎng)基A：培養(yǎng)基T；頭孢西丁由頭孢米諾(DaewooChemical,A8060902；16mg/l)/卡那霉素(Sigma,ref.K4000；1mg/l)抗生素組合代替；發(fā)色底物為粉紅色-磷酸酯(Biosynth,ref.C-5100；0.25g/l)。培養(yǎng)基B：培養(yǎng)基T；頭孢西丁由頭孢米諾(16mg/l)/卡那霉素(0.75mg/l)抗生素組合代替；發(fā)色底物為X-α-葡糖苷(Biosynth,B7230；0.045g/l)和GreenA-α-葡糖苷(Inalco,ref.1758-0730)。培養(yǎng)基C：培養(yǎng)基T；頭孢西丁由頭孢米諾(16mg/l)/卡那霉素(0.75mg/l)抗生素組合代替；發(fā)色底物為X-α-葡糖苷(Biosynth,B7230；0.045g/l)和GreenA-α-葡糖苷(Inalco,ref.1758-0730,0.08g/l)。2.培養(yǎng)基接種和讀取將金黃色葡萄球菌的各種甲氧西林抗性(MRSA)或甲氧西林敏感性(MSSA)菌株和凝固酶陰性葡萄球菌菌株(CoNS)(全部來自申請人的保藏)懸浮于生理鹽水中，然后根據(jù)四區(qū)劃線法接種在培養(yǎng)基上。將培養(yǎng)皿在37℃下溫育24小時。接種18h-24h后視覺檢查形成的菌落。3.結(jié)果結(jié)果示于表1。這些結(jié)果顯示了本發(fā)明的培養(yǎng)基完美的靈敏度。特別地，培養(yǎng)基A使得可以檢測所有MRSA。實(shí)施例2包含各種濃度的頭孢米諾和卡那霉素的MRSA培養(yǎng)基1.制備本發(fā)明的培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)中測試的培養(yǎng)基如下：培養(yǎng)基T：chromIDMRSA對照培養(yǎng)基(ref.43451).培養(yǎng)基D：培養(yǎng)基T；頭孢西丁由各種濃度的頭孢米諾(與實(shí)施例1所用相同的抗生素)/卡那霉素(與實(shí)施例1所用相同的抗生素)抗生素組合代替；發(fā)色底物為X-α-葡糖苷(與實(shí)施例1所用相同的底物；0.045g/l)和GreenA-α-葡糖苷(與實(shí)施例1所用相同的底物；0.08g/l)。[頭孢米諾]，mg/l[卡那霉素]，mg/lD1160.75D2161D3140.75D41412.培養(yǎng)基接種和讀取如實(shí)施例1進(jìn)行該步驟3.結(jié)果獲得的結(jié)果示于下表2這些結(jié)果表明，16mg/l的頭孢米諾濃度和0.75mg/l的卡那霉素濃度使得可以獲得完美的特異性和靈敏度。實(shí)施例3包含頭孢米諾–阿米卡星抗生素組合和各種發(fā)色底物的MRSA培養(yǎng)基1.制備本發(fā)明的培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)中測試的培養(yǎng)基如下：培養(yǎng)基T：chromIDMRSA對照培養(yǎng)基(ref.43451).培養(yǎng)基E：培養(yǎng)基T；頭孢西丁由頭孢米諾(與實(shí)施例1所用相同的抗生素；16mg/l)/阿米卡星(Sigma,ref.2324；2mg/l)抗生素組合代替；發(fā)色底物為粉紅色-磷酸酯(Biosynth,C-5100；0.25g/l)。培養(yǎng)基F：培養(yǎng)基T；頭孢西丁由頭孢米諾(16mg/l)/阿米卡星(2.5mg/l)抗生素組合代替；發(fā)色底物為X-α-葡糖苷(與實(shí)施例1所用相同的底物；0.045g/l)和GreenA-α-葡糖苷(與實(shí)施例1所用相同的底物；0.08g/l)。2.培養(yǎng)基的接種和讀取如實(shí)施例3進(jìn)行該步驟3.結(jié)果獲得的結(jié)果示于下表3這些結(jié)果顯示了本發(fā)明的抗生素組合使得可以獲得完美的靈敏度，和所用的底物無關(guān)。實(shí)施例4包含頭孢地尼和阿米卡星的MRSA培養(yǎng)基1.制備本發(fā)明的培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)中測試的培養(yǎng)基如下：培養(yǎng)基T：chromIDMRSA對照培養(yǎng)基(ref.43451).培養(yǎng)基G：培養(yǎng)基T；頭孢西丁由各種濃度的頭孢地尼(CDR0806007)/阿米卡星(與實(shí)施例3所用相同的抗生素)抗生素組合代替；發(fā)色底物為粉紅色-磷酸酯(與實(shí)施例3所用相同的底物；0.25g/l)。[頭孢地尼]，mg/l[阿米卡星]，mg/lG10.32G20.22培養(yǎng)基H：培養(yǎng)基T；頭孢西丁由各種濃度的頭孢地尼/阿米卡星抗生素組合代替；發(fā)色底物為X-α-葡糖苷(與實(shí)施例1所用相同的底物；0.045g/l)和GreenA-α-Glu(與實(shí)施例1所用相同的底物；0.08g/l).[頭孢地尼]，mg/l[阿米卡星]，mg/lH10.32H20.222.培養(yǎng)基的接種和讀取如實(shí)施例1進(jìn)行該步驟3.結(jié)果獲得的結(jié)果示于下表4這些結(jié)果表明本發(fā)明的頭孢地尼/阿米卡星抗生素組合使得可以獲得完美的靈敏度和特異性，和所用的濃度無關(guān)。實(shí)施例5在本發(fā)明的MRSA培養(yǎng)基上分析臨床樣本1.制備本發(fā)明的培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)中測試的培養(yǎng)基如下：培養(yǎng)基T：chromIDMRSA對照培養(yǎng)基(ref.43451).批次1：0.08g/lGreenA-α-Glu+0.045g/lX-α-Glu,16mg/l頭孢米諾+0.75mg/l卡那霉素.批次2：0.08g/lGreenA-α-Glu+0.045g/lX-α-Glu,0.3mg/l頭孢地尼+2mg/l阿米卡星.批次3：0.25g/l粉紅色-磷酸酯,16mg/l頭孢米諾+2mg/l阿米卡星.批次4：0.25g/l粉紅色-磷酸酯,0.3mg/l頭孢地尼+2mg/l阿米卡星.所用的底物和抗生素與前面的實(shí)施例所用的相同。2.培養(yǎng)基的接種和讀取利用各種臨床樣本(鼻、喉、會陰、傷口)平行進(jìn)行兩個研究，將所述臨床樣本懸浮于生理鹽水中，然后根據(jù)四區(qū)劃線法接種在培養(yǎng)基上以獲得分離的菌落。將培養(yǎng)皿在37℃下溫育24小時。接種18h-24h后視覺檢查形成的菌落。3.結(jié)果獲得的結(jié)果示于下表。第一研究：第二研究：這些結(jié)果表明本發(fā)明的抗生素組合從18h開始顯示出完美的檢測靈敏度。當(dāng)前第1頁1 2 3