本發(fā)明涉及一種化學(xué)合成的藥物胡椒酸鉀及其用于制備乳腺癌靶向治療藥物的應(yīng)用,更具體地說(shuō)涉及藥物胡椒酸鉀的化學(xué)合成、抗癌效果以及對(duì)于乳腺癌靶向治療的應(yīng)用研究。

背景技術(shù)：

心血管疾病主要是由于血液中膽固醇的增加引起的，據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)大約有20％的中風(fēng)和50％的心臟病與血液中的高膽固醇含量有關(guān)。在臨床上廣泛使用的降血脂藥物為他汀類藥物(statins)，例如辛伐他汀(simvastatin)、阿托伐他汀(atorvastatin)、洛伐他汀(lovastatin)等。他汀類藥物作為3-羥基-3甲基戊二酰輔酶A(HMG-CoA)還原酶的抑制劑,可以可逆的抑制HMG-CoA向甲羥戊酸轉(zhuǎn)變，使細(xì)胞內(nèi)膽固醇和類異戊二烯的生物合成降低。蓽茇(Piper longum L.)是常見的胡椒科植物,是傳統(tǒng)的具有降脂作用的蒙藥。針對(duì)蓽茇的有效成分鑒定，可以得到胡椒堿(piperine,GBO)、蓽茇環(huán)堿(pipernonaline)、蓽茇寧(piperlonguminine,GBN)三種有效成分。這些有效成分可以顯著的降低實(shí)驗(yàn)大鼠血清總膽固醇(TC)、血清中甘油三酯(TG)的含量，顯著增加高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol，HDL-C)的含量，輕度的減少低密度脂蛋白膽固醇的含量(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)，降脂的效果與降脂西藥辛伐他汀相類似。以胡椒堿為起始原料，已經(jīng)成功地合成了具有降血脂生物活性的蓽茇寧，并且在合成過(guò)程中產(chǎn)生了一系列具有降血脂活性的衍生物，比如胡椒酸鉀(potassium piperate，GBK)。通過(guò)大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)化學(xué)合成的蓽茇寧及衍生物胡椒酸鉀可以顯著的降低實(shí)驗(yàn)大鼠血清總膽固醇(TC)、血清中甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白膽固醇的含量(LDL-C)，增加高密度脂蛋白膽固醇的含量(HDL-C)，降脂的效果與胡椒堿及辛伐他汀相類似。

他汀類藥物除了具有降血脂的作用之外，還具有抗腫瘤、抗炎癥反應(yīng)、抗增殖等作用。脂類代謝異常是細(xì)胞癌變的一個(gè)重要特點(diǎn)，因?yàn)閰⑴c膽固醇生物合成和蛋白質(zhì)異戊烯化的甲羥戊酸途徑參與了腫瘤形成的多個(gè)方面。致癌基因,例如Ras蛋白家族的Ras和Rho GTPases的翻譯后修飾也與上述途徑有關(guān)。他汀類藥物可以通過(guò)類異戊二烯中間物焦磷酸法尼酯(farnesyl pyrophosphat，F(xiàn)PP)和牛龍牛兒醇焦磷酸酯(geranyl pyrophosphate，GPP)抑制癌基因蛋白異戊烯化，這對(duì)Ras蛋白家族的修飾非常重要。臨床研究表明他汀類藥物可降低炎癥標(biāo)志物高敏C反應(yīng)蛋白(hypersensitive C-reactive protein，hs-CRP)表達(dá)水平，減少炎癥反應(yīng)等作用。通過(guò)降低類異戊二烯中間物FPP和GPP的合成，可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤組織血管再生、腫瘤轉(zhuǎn)移和侵染等。

蒙藥蓽茇有效成分及其衍生物是否也具有抗腫瘤的效果,是否可以作為某些腫瘤治療的輔助藥物尚未見相關(guān)報(bào)道。基于上述原理，申請(qǐng)人探索了蒙藥蓽茇有效成分及其衍生物的抗腫瘤的效果，以便作為某些腫瘤治療的輔助藥物。申請(qǐng)人選取化學(xué)合成的蓽茇有效成分胡椒堿(GBO)、蓽茇寧(GBN)以及衍生物胡椒酸鉀(GBK)，探索其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用和分子機(jī)理。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在胡椒堿(GBO)、蓽茇寧(GBN)及胡椒酸鉀(GBK)中，只有胡椒酸鉀對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用，而對(duì)正常細(xì)胞的增殖沒有影響。進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)GBK對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞的增殖有較強(qiáng)的抑制作用,GBK特異性阻止乳腺腫瘤細(xì)胞MCF-7的G1/S轉(zhuǎn)接(transition)。GBK抗腫瘤機(jī)理主要是通過(guò)作用于細(xì)胞周期的G1期，激活腫瘤抑制因子p53，促進(jìn)細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑p27的表達(dá)，抑制G1/S期轉(zhuǎn)接過(guò)程中關(guān)鍵復(fù)合物CyclinE/CDK2活性及CDK2的表達(dá)，抑制S期關(guān)鍵復(fù)合物CyclinA/CDK2的活性及CyclinA的表達(dá)，抑制M期關(guān)鍵復(fù)合物CyclinB/CDK1的活性及CyclinB的表達(dá)，最終抑制細(xì)胞周期進(jìn)程。并通過(guò)使轉(zhuǎn)錄因子E2F的表達(dá)量下調(diào)，影響DNA復(fù)制起始解旋酶復(fù)合物MCM2-7中蛋白組分的轉(zhuǎn)錄及翻譯，抑制DNA復(fù)制。同時(shí)GBK也可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞對(duì)于還原氧引起的壓力應(yīng)答，誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。GBK可能會(huì)通過(guò)抑制DNA甲基化和促進(jìn)組蛋白去乙酰化等表觀遺傳修飾方式抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。通過(guò)小鼠異種移植模型實(shí)驗(yàn)，證實(shí)在體內(nèi)作用的過(guò)程中，GBK處理可以在不影響小鼠正常生長(zhǎng)發(fā)育的情況下抑制乳腺癌瘤體的進(jìn)一步生長(zhǎng)。GBK與依托泊苷聯(lián)合用藥，可以在達(dá)到相同腫瘤細(xì)胞抑制率的情況下，減少依托泊苷的用量，因此有可能在臨床中與依托泊苷聯(lián)合使用，用于乳腺癌的化療過(guò)程。

探索化學(xué)合成化合物的藥理藥效，特別是抗腫瘤的藥理藥效,常用的手段為測(cè)定IC50(能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡50％的藥品濃度)、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞集落形成實(shí)驗(yàn)、細(xì)胞周期檢測(cè)、鼠異種移植實(shí)驗(yàn)。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，可以檢測(cè)藥物是否可以抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞周期，是否在小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中具有與體外實(shí)驗(yàn)相似的抑制腫瘤細(xì)胞增殖的功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是通過(guò)化學(xué)合成的胡椒酸鉀對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞增殖的特異性抑制作用和內(nèi)在分子機(jī)理研究，提供一種用于治療乳腺癌靶向藥物胡椒酸鉀，為胡椒酸鉀進(jìn)入治療乳腺癌的臨床階段奠定基礎(chǔ)。

同時(shí)，本申請(qǐng)的目的還在于提供了乳腺癌靶向藥物胡椒酸鉀制備方法和乳腺癌靶向藥物胡椒酸鉀的藥理藥效鑒定方法。

本申請(qǐng)的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：一種乳腺癌靶向藥物胡椒酸鉀(GBK)，其結(jié)構(gòu)式如下：

。

乳腺癌靶向藥物胡椒酸鉀制備方法，其特征在于：胡椒酸鉀是以胡椒堿為原料合成的水溶性降脂胡椒堿衍生物，具體的合成步驟如下：首先將3.5kg氫氧化鉀在15升95％乙醇中充分溶解，然后加入2kg胡椒堿攪拌充分溶解，回流反應(yīng)10h,此時(shí)將溫度控制在88℃，抽濾，即得到胡椒酸鉀。

乳腺癌靶向藥物胡椒酸鉀的藥理藥效鑒定方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)化學(xué)合成:胡椒酸鉀是以胡椒堿為原料合成的水溶性降脂胡椒堿衍生物，具體的合成步驟如下：首先將3.5kg氫氧化鉀在15升95％乙醇中充分溶解，然后加入2kg胡椒堿攪拌充分溶解，回流反應(yīng)10h,此時(shí)將溫度控制在88℃，抽濾，即得到胡椒酸鉀鹽；

(2)腫瘤細(xì)胞系及正常對(duì)照細(xì)胞系的培養(yǎng)：

實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用到的腫瘤細(xì)胞系及正常對(duì)照細(xì)胞系的名稱及培養(yǎng)方式如下：

三種培養(yǎng)基的不同成分購(gòu)自不同的生物公司，其中DMEM、RPMI-1640購(gòu)自HyClone公司，F(xiàn)12購(gòu)自gibco公司、青鏈霉素混合液Pen Strep(+10000Units/ml Penicillin、+10000μg/ml Streptomycin)、谷氨酰胺L-Glu(100×L-Glutamin)，胰島素(insulin)和地塞米松(dexamethasone)購(gòu)自SIGMA公司；

培養(yǎng)步驟：貼壁細(xì)胞在相應(yīng)培養(yǎng)基中置于37℃，5％(v/v)CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到培養(yǎng)器皿底面積的80％的時(shí)候，按照1：10的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。傳代時(shí)先用適量胰酶消化細(xì)胞，直至大多數(shù)的細(xì)胞從培養(yǎng)皿底部消化起來(lái)，之后用9倍于胰酶體積的完全培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)。按照所需細(xì)胞濃度進(jìn)行細(xì)胞的傳代；

(3)胡椒酸鉀對(duì)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞毒性測(cè)定

通過(guò)測(cè)定胡椒酸鉀對(duì)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞毒性，以確定在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中藥物的使用濃度，步驟如下：

將多種正常細(xì)胞(GES-1，L132，HSF，COS-7)和癌細(xì)胞(MCF-7，SUM159，HepG2，A549，BGC-823，SGC-7901)從37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中拿出來(lái)，在超凈臺(tái)中去掉各自的培養(yǎng)基，加入10ml 1×PBS(Transgen Biotech)洗去殘留的培養(yǎng)基，在每個(gè)培養(yǎng)皿中加1ml 0.05％的胰酶，放回到細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃，5％CO₂中消化3min。3min后取出培養(yǎng)皿，在顯微鏡下觀察是否將細(xì)胞消化起來(lái)，在消化起來(lái)的細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入適量相應(yīng)培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后，取10μl于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)1ml培養(yǎng)基中細(xì)胞的個(gè)數(shù)，之后調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的細(xì)胞個(gè)數(shù)，使其終濃度為5×10³/100μl。取出96孔板，在96孔板最外層每孔加入100μl 1×PBS，然后向96孔板的最左側(cè)一列加入100μl空白培養(yǎng)基，作為陰性對(duì)照組，在其余孔中各加入100μl相應(yīng)的細(xì)胞懸液，搖勻后重新放回培養(yǎng)箱中37℃，5％CO₂培養(yǎng)24h，用于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。24h后除陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照外，從左向右依次加入0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml濃度梯度的GBK作用于細(xì)胞中48h，48h后向每孔(包括陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組)均加入10μl CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)中繼續(xù)培養(yǎng)90min，在酶標(biāo)儀上OD＝450nm波長(zhǎng)下，測(cè)定細(xì)胞的存活率，預(yù)測(cè)GBK對(duì)不同細(xì)胞作用的IC₅₀值；

(4)胡椒酸鉀的選擇性抑制作用實(shí)驗(yàn)

通過(guò)測(cè)定胡椒酸鉀對(duì)于不同的癌細(xì)胞系以及正常細(xì)胞系生長(zhǎng)的抑制作用，確定胡椒酸鉀是否對(duì)某些癌細(xì)胞的增殖具有選擇性的抑制作用，步驟如下：

將貼壁的正常細(xì)胞及癌細(xì)胞消化起來(lái)，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，使其濃度為5×10³/100μl，在96孔板最外層每孔加入100μl 1×PBS，向第一列加入每種細(xì)胞相應(yīng)的空白培養(yǎng)基，向96孔板的其余每個(gè)孔中各加100μl細(xì)胞懸液，37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；24h后按照0μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、290μg/ml、400μg/ml的濃度向每孔中加入無(wú)菌無(wú)酶水或GBK溶液，每種細(xì)胞分別都設(shè)置這6個(gè)GBK的濃度梯度；每次實(shí)驗(yàn)相同濃度重復(fù)3次，且獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每種細(xì)胞均使用各自培養(yǎng)基作為調(diào)0孔，到相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后向每孔加入10μl CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)90min，用酶標(biāo)儀在OD＝450nm波長(zhǎng)下讀數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活性；

(5)胡椒酸鉀對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響

抗腫瘤藥物對(duì)于腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用一般是通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞壓力(cellular stress),比如氧化壓力、復(fù)制壓力、代謝和蛋白毒性壓力以及DNA損傷；DNA復(fù)制壓力作用于細(xì)胞周期進(jìn)程的不同階段，阻礙細(xì)胞周期進(jìn)程，最終達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的；因此檢測(cè)胡椒酸鉀對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響，用于確認(rèn)其抑制癌細(xì)胞增殖的機(jī)理。

取出MCF-7、HepG2、SGC-7901，消化細(xì)胞后，將細(xì)胞分別用6cm板，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃，5％CO₂培養(yǎng)24h；24h后以0μg/ml、1/2IC₅₀μg/ml、IC₅₀μg/ml、2IC₅₀μg/ml濃度加入GBK溶液處理細(xì)胞48h；48h后收集細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)：配制70％乙醇，放在-20℃預(yù)冷；倒掉培養(yǎng)基，向每個(gè)6cm板中加入少量1×PBS，洗去殘留的培養(yǎng)基，向每個(gè)6cm板中加入0.6ml 0.05％的胰酶，放回到37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞3min。3min后，取出6cm板，向每個(gè)6cm板中加入1.4ml 1×PBS吹打均勻，終止消化，并將其收集到2ml離心管中；500rpm，離心10min。取出離心管，棄上清液，重新加入1ml 1×PBS重懸細(xì)胞，洗去殘留胰酶，500rpm，離心10min。10min后，取出離心管，棄上清液，再次加入200μl 1×PBS重懸細(xì)胞；從冰箱中取出提前預(yù)冷的70％乙醇，取800μl加入到1.5ml離心管中，置于冰上繼續(xù)預(yù)冷；將200μl 1×PBS重懸的細(xì)胞懸液加到預(yù)冷的70％乙醇中，置于冰上固定30min；從-20℃中取出RNase A，取1μl 10mg/ml RNase+99μl去離子水配制成100μg/ml Ribonuclease A(RNase A)，備用；從4℃冰箱中取出1mg/ml PI，取62.5μl 1mg/ml PI+937.5μl去離子水將PI稀釋為62.5μg/ml，備用；30min后，從冰上取出離心管，置于離心機(jī)中500rpm，離心10min；10min后取出離心管，棄上清液，加入500μl 1×PBS重懸細(xì)胞，500rpm，離心10min，洗去殘留的乙醇。取出離心管，棄上清液，向每個(gè)離心管中各自加入100μl 100μg/ml Ribonuclease A(RNase A)，室溫下孵育5min；5min后，向每個(gè)離心管中加入400μl 62.5μg/ml的PI染料，工作濃度為50μg/ml，置于冰上，避光孵育染色30min；30min后，將細(xì)胞懸液用200目的篩子過(guò)濾到流式細(xì)胞上樣管中，每個(gè)上樣管都須置于冰上，上樣檢測(cè)，分析數(shù)據(jù)；

(6)胡椒酸鉀對(duì)腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路的影響

首先從胡椒酸鉀處理過(guò)的癌細(xì)胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行人類細(xì)胞全基因組轉(zhuǎn)錄芯片(global transcriptional microarray)篩選，篩選出胡椒酸鉀處理后乳腺瘤細(xì)胞(MCF-7)及胃癌細(xì)胞(SGC-7901)相對(duì)于不處理的相應(yīng)腫瘤細(xì)胞系的差異表達(dá)基因，篩選出GBK影響的細(xì)胞途徑；

提取總RNA的過(guò)程及反轉(zhuǎn)錄過(guò)程：將MCF-7及SGC-7901細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出后，用胰蛋白酶消化起來(lái)，并以2×10⁶個(gè)/10ml的細(xì)胞量鋪板，并放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，24h后取出2個(gè)10cm板，按照1.5IC50μg/ml的濃度分別向兩個(gè)培養(yǎng)皿中加入GBK溶液和無(wú)菌無(wú)酶的水(對(duì)照組)，分別標(biāo)為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，48h后提取總RNA，具體步驟如下：從培養(yǎng)箱中取出2個(gè)培養(yǎng)皿，去掉培養(yǎng)基，并用1×PBS洗一次，洗去殘留的培養(yǎng)基；向2個(gè)培養(yǎng)皿中分別加入1ml TransZol^TM Up，輕輕搖晃培養(yǎng)皿，吹打細(xì)胞，使裂解液能夠均勻的分布在培養(yǎng)皿表面，與細(xì)胞密切接觸。用細(xì)胞刮鏟充分刮鏟貼壁細(xì)胞，使得裂解液中無(wú)明顯沉淀；用無(wú)菌無(wú)酶的槍頭將細(xì)胞裂解液加入到1.5ml無(wú)菌無(wú)酶離心管中；在無(wú)菌無(wú)酶的條件下，室溫中靜置5min；向1.5ml無(wú)菌無(wú)酶離心管中加入200μl氯仿，劇烈振蕩30s，無(wú)菌無(wú)酶條件下室溫放置3min；將離心管置于提前預(yù)冷的低溫離心機(jī)中10000rpm，低溫(4℃)離心15min；取500μl上清液于一個(gè)新的1.5ml無(wú)菌無(wú)酶離心管中，然后加入500μl異丙醇，顛倒混勻，在室溫條件下放置10min；10000rpm，低溫(4℃)，離心10min；從離心機(jī)中取出離心管，棄上清；向1.5ml離心管中加入1ml提前配制好的75％乙醇溶液，渦旋1min；7500rpm，低溫(4℃)離心5min；棄上清，在無(wú)菌無(wú)酶條件下室溫干燥，使殘留的乙醇完全揮發(fā)掉；向1.5ml離心管中加入50μl RNA溶解液；在60℃烘箱中放置10min，在超凈臺(tái)中分裝3μl于小的無(wú)菌無(wú)酶PCR管中，用于凝膠電泳和濃度檢測(cè)，其余保存于-80℃冰箱中用于后續(xù)qRT-PCR；用無(wú)水乙醇處理電泳槽，并重新配置電泳用凝膠取少量樣品跑電泳；反轉(zhuǎn)錄的試劑購(gòu)自TransGen Biotech(貨號(hào)AT-311)，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄；

對(duì)人類細(xì)胞全基因組轉(zhuǎn)錄芯片篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證：實(shí)驗(yàn)所使用的熒光染料為Takara公司的 Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(貨號(hào)RR820A)。

本申請(qǐng)作為一種治療乳腺癌的臨床藥物，其特征在于：所述的乳腺癌靶向藥物胡椒酸鉀。

本申請(qǐng)乳腺癌靶向藥物胡椒酸鉀能夠在制備治療乳腺癌臨床藥物中的應(yīng)用。

本申請(qǐng)乳腺癌靶向藥物胡椒酸鉀在制備治療乳腺癌臨床藥物中的應(yīng)用方式之一是，將乳腺癌靶向藥物胡椒酸鉀與依托泊苷聯(lián)合用藥。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn):

(1)本發(fā)明通過(guò)對(duì)化學(xué)合成藥物胡椒酸鉀對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞增殖的特異性抑制作用和內(nèi)在分子機(jī)理的研究，為胡椒酸鉀進(jìn)入治療乳腺癌的臨床階段奠定基礎(chǔ)。胡椒酸鉀是具有降脂作用的化學(xué)合成藥物，因此在高血脂病人長(zhǎng)期服用的過(guò)程中，可以同時(shí)用于預(yù)防乳腺癌發(fā)病的目的。

(2)有些抗腫瘤藥物對(duì)于細(xì)胞周期的抑制作用沒有細(xì)胞特異性，導(dǎo)致在殺死腫瘤細(xì)胞的同時(shí)也抑制了正常細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程，對(duì)患者的身體造成比較大的傷害。對(duì)胡椒酸鉀抗腫瘤作用及其機(jī)制的研究，胡椒酸鉀對(duì)腫瘤細(xì)胞的增殖具有抑制作用，而對(duì)正常細(xì)胞的增殖沒有影響，因此，具有理論意義和臨床應(yīng)用前景，可以開發(fā)為一種新型的抗腫瘤臨床藥物，或與現(xiàn)有抗腫瘤藥物聯(lián)合用藥，進(jìn)一步可以研發(fā)出低毒性、具有選擇性的抗腫瘤輔助藥物。

附圖說(shuō)明

下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。

圖1胡椒酸鉀在不同的癌細(xì)胞系以及正常細(xì)胞系中半致死濃度測(cè)定。胡椒酸鉀對(duì)于不同的癌細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，對(duì)于正常細(xì)胞沒有毒性。

圖2胡椒酸鉀濃度梯度處理對(duì)正常細(xì)胞增殖基本沒有影響。

圖3胡椒酸鉀濃度梯度處理選擇性抑制腫瘤細(xì)胞增殖，特別是乳腺癌細(xì)胞的增殖。

圖4胡椒酸鉀濃度梯度處理選擇性抑制乳腺癌細(xì)胞周期進(jìn)程，對(duì)肝癌及胃癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程無(wú)影響。

圖5胡椒酸鉀處理影響乳腺癌細(xì)胞MCF-7和胃癌細(xì)胞SGC-7901的不同信號(hào)通路。

圖6胡椒酸鉀處理下調(diào)乳腺癌細(xì)胞中與細(xì)胞周期及DNA復(fù)制相關(guān)的基因。

圖7胡椒酸鉀處理會(huì)抑制NOD/SCID鼠體內(nèi)乳腺癌細(xì)胞異種移植腫瘤的生長(zhǎng)。

圖8胡椒酸鉀處理后NOD/SCID鼠乳腺癌細(xì)胞異種移植腫瘤組織切片病理分析，A為HE染色顯示胡椒酸鉀處理會(huì)降低組織惡性化水平，B為免疫組化染色顯示胡椒酸鉀處理會(huì)降低血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子的表達(dá)水平。

圖9胡椒酸鉀與依托泊苷聯(lián)合使用對(duì)MCF-7細(xì)胞活性的影響，將兩種藥物共同作用于MCF-7細(xì)胞后，可以在達(dá)到相似的細(xì)胞抑制率的同時(shí)減少依托泊苷的用量。

具體實(shí)施方式

在下面的實(shí)施例中進(jìn)一步說(shuō)明了本發(fā)明的應(yīng)用實(shí)例，但這并不限制本發(fā)明的范圍，這些方法可以應(yīng)用于其他化學(xué)合成藥物、天然產(chǎn)物的活性成分、以及其他慢性藥物抗癌藥效的研究。

實(shí)施例1：胡椒酸鉀對(duì)癌細(xì)胞的選擇性抑制作用

在用0μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、290μg/ml和400μg/ml濃度的GBK處理正常細(xì)胞(GES-1，HSF，L132，COS-7)及癌細(xì)胞(MCF-7，SUM159，A549，BGC-823，SGC-7901，HepG2)48h，然后每孔加入10μl CCK-8，37℃，5％CO₂處理細(xì)胞90min，在酶標(biāo)儀上OD＝450nm的波長(zhǎng)下測(cè)定光吸收值，并在Excel表格中運(yùn)用公式：細(xì)胞活性＝(加藥組的光吸收值-陰性對(duì)照組光吸收值)/(加水組的光吸收值-陰性對(duì)照組光吸收值)，得出在不同的GBK濃度下細(xì)胞活性比率，進(jìn)行3次彼此獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)隨著GBK濃度從0到400μg/ml增加，在濃度不斷上升過(guò)程中，正常細(xì)胞的細(xì)胞活性沒有受到抑制或受到的抑制作用很小，而癌細(xì)胞的活性在不斷下降(參見圖2，圖3)。

實(shí)施例2：胡椒酸鉀選擇性抑制乳腺癌細(xì)胞周期進(jìn)程

GBK對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用實(shí)驗(yàn)證明，GBK選擇性抑制癌細(xì)胞的增殖，尤其是乳腺癌細(xì)胞，而對(duì)正常細(xì)胞的增殖基本沒有影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，GBK會(huì)特異性阻止乳腺癌細(xì)胞MCF-7的G1/S轉(zhuǎn)接(transition)，而對(duì)其他癌細(xì)胞(SGC-7901，HepG2)的G1/S轉(zhuǎn)接沒有影響。用0μg/ml、145μg/ml、290μg/ml、580μg/ml濃度的GBK來(lái)處理乳腺癌細(xì)胞48h，48h收集細(xì)胞，PI避光染色后，進(jìn)行檢測(cè)。隨著GBK濃度從0到580μg/ml不斷上升的過(guò)程中，MCF-7細(xì)胞系中處于G1期的乳腺癌細(xì)胞在不斷增加，處于S期的細(xì)胞在明顯減少(參見圖4)。

實(shí)施例3：胡椒酸鉀處理乳腺癌細(xì)胞后對(duì)于相關(guān)信號(hào)通路的影響

通過(guò)人類細(xì)胞全基因組轉(zhuǎn)錄芯片(global transcriptional microarray)技術(shù)，篩選出胡椒酸鉀處理后乳腺癌細(xì)胞(MCF-7)及胃癌細(xì)胞(SGC-7901)相對(duì)于不處理的相應(yīng)腫瘤細(xì)胞系的差異表達(dá)，篩選出GBK影響的細(xì)胞途徑(參見圖5)。從柱狀圖中可以看出MCF-7細(xì)胞中表達(dá)量發(fā)生改變的基因主要涉及到細(xì)胞周期，DNA復(fù)制與細(xì)胞凋亡等腫瘤發(fā)生發(fā)展的過(guò)程；在SGC-7901細(xì)胞中發(fā)生改變的基因多數(shù)涉及對(duì)有機(jī)物的應(yīng)答，細(xì)胞遷移，與肥厚性心肌病等疾病相關(guān)。

實(shí)施例4：胡椒酸鉀處理乳腺癌細(xì)胞后對(duì)相關(guān)基因表達(dá)水平的影響

通過(guò)人類細(xì)胞全基因組芯片的分析發(fā)現(xiàn)，與細(xì)胞周期及DNA復(fù)制相關(guān)信號(hào)通路中差異表達(dá)的基因最多。進(jìn)一步對(duì)這些相關(guān)基因在GBK處理前后的MCF-7細(xì)胞中的表達(dá)量進(jìn)行了實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證。

將290μg/ml GBK處理過(guò)的MCF-7細(xì)胞提取到的RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA以及未用GBK處理過(guò)的MCF-7提取所得RNA反轉(zhuǎn)錄成的cDNA作為模板，用待測(cè)基因的qRT-PCR引物作為反應(yīng)引物，進(jìn)行qRT-PCR實(shí)驗(yàn)(參見圖6)。從柱狀圖中可以看出，在用GBK處理的細(xì)胞中，與細(xì)胞周期及DNA復(fù)制相關(guān)的基因與未用GBK處理的細(xì)胞中相應(yīng)的基因相比有所下調(diào)。

實(shí)施例5：在NOD/SCID鼠中建立異種移植腫瘤模型檢測(cè)胡椒酸鉀在體內(nèi)的抗腫瘤效果

NOD/SCID鼠中異種移植模型的建立所選用的是處于3-4周齡的12只NOD/SCID雌鼠，購(gòu)買于北京博艾動(dòng)物技術(shù)有限公司，培養(yǎng)在SPF級(jí)鼠房中，飼養(yǎng)NOD/SCID鼠所需的所有飼料、水、墊料以及動(dòng)物需要直接接觸的器物等均需通過(guò)126℃、20min高壓蒸氣滅菌。在向NOD/SCID鼠體內(nèi)注射癌細(xì)胞之前需要進(jìn)行如下處理：將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞用0.05％胰蛋白酶消化起來(lái)，加入一定量的PBS，吹打均勻后，收集于離心管中，1000rpm，低溫(4℃)，離心5min。棄上清，重新向離心管中加入適量的PBS，用于重懸細(xì)胞。細(xì)胞計(jì)數(shù)，三次取平均值，作為細(xì)胞數(shù)的數(shù)值。按Matrigel：PBS＝1:1比例，調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，使細(xì)胞濃度為2×10⁶個(gè)/100μl。在SPF級(jí)鼠房中向NOD/SCID鼠雙側(cè)后腿皮下注射配制好的腫瘤細(xì)胞懸液100μl，隨機(jī)選定5只裸鼠作為對(duì)照組，另7只作為實(shí)驗(yàn)組，佩戴耳標(biāo)。將NOD/SCID鼠以兩只為一單位，置于鼠籠中每天給與食物和水，于SPF級(jí)鼠房中培養(yǎng)3周。在實(shí)驗(yàn)前一天給小鼠喝Neomycin sulfate/Polymycin B sulfate雙抗水，并換上高壓滅菌的墊料盒。在注射腫瘤細(xì)胞后每3天稱量小鼠體重，并統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)。在腫瘤塊長(zhǎng)到8mm³后，向每只裸鼠注射GBK藥物或0.9％生理鹽水。實(shí)驗(yàn)組按照10μg/g體重注射GBK，對(duì)照組注射相應(yīng)體積的0.9％生理鹽水，連續(xù)注射21天。在給藥期間，每隔3天對(duì)小鼠進(jìn)行稱重并做好記錄。每隔3天用游標(biāo)卡尺對(duì)瘤塊的大小進(jìn)行測(cè)量記錄，腫瘤體積按照如下的公式計(jì)算，腫瘤體積V＝ab²/2，(其中a是腫瘤最長(zhǎng)徑，b是腫瘤最短徑)，并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線和體重變化曲線。21天后，脫頸處死荷瘤鼠，摘取腫瘤塊，剝離腫塊秤重，并將實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組放置一起拍照，記錄質(zhì)地、浸潤(rùn)情況及血供情況。置于10％福爾馬林中浸泡，用于后續(xù)做石蠟包埋、切片、HE染色及免疫組化，分析結(jié)果(參加圖7)。

從圖7-A中可以看出，注射了GBK藥物的實(shí)驗(yàn)組瘤體大小比注射了生理鹽水的對(duì)照組瘤體大小明顯減小，存在顯著性差異。在未注射藥物之前，小鼠腫瘤的體積無(wú)顯著性差異(p＝0.239)。我們可以從圖7-B瘤體大小的折線圖中看出，從第6天開始，與注射生理鹽水組相比，當(dāng)小鼠注射了GBK藥物后，瘤體大小會(huì)顯著小于對(duì)照組，在第21天時(shí)，對(duì)照組的體積為2.18225±0.512813，GBK組的體積為0.994857±0.384695，p＝0.000487。

實(shí)施例6：免疫與組織化學(xué)檢測(cè)注射胡椒酸鉀的NOD/SCID鼠腫瘤切片相關(guān)蛋白表達(dá)水平的變化。

通過(guò)免疫組織化學(xué)，比較在用GBK處理過(guò)的腫瘤塊與未處理過(guò)的腫瘤塊中與細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白質(zhì)在組織中的表達(dá)差異，來(lái)進(jìn)一步證明GBK藥物是作用于細(xì)胞周期，通過(guò)阻斷細(xì)胞周期及促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)起作用的。

免疫組化的具體步驟如下：脫蠟：依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100％酒精-100％酒精-95％酒精-90％酒精-80％酒精-70％酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯，依據(jù)的是相似相溶的原理。一般在每個(gè)試劑中放10min，天氣熱可以少放幾分鐘，相反，天氣較冷的話，就要適當(dāng)延長(zhǎng)脫蠟時(shí)間，一般為12-15min.PBS洗3次各5分鐘，加入3％H₂O₂浸泡10min，從而除去內(nèi)源性的過(guò)氧化氫酶，然后倒掉H₂O₂在清水中洗兩次，再加入檸檬酸緩沖液，放入微波爐中蒸煮3min(中火)，一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫，然后再蒸煮一次，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點(diǎn)暴露出來(lái)。血清封閉：冷卻至室溫后，將檸檬酸緩沖液倒掉，水洗2次，并將載玻片置于PBS中5min，洗2次，擦干組織周圍的PBS液，5％BSA封閉，室溫孵育10min。加一抗：棄血清，滴加一抗(1：50稀釋抗體)1％BSA稀釋，4℃過(guò)夜。加二抗：將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦干組織周圍的PBS后加上二抗(山羊抗兔/抗鼠IgG-HRP)，然后置于37℃溫箱中30～60min。PBS洗3次，每次5min，每張切片加100μl新配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10分鐘，控染色，顯色完成后加入PBS終止顯色。復(fù)染：將顯色后的片子用清水沖洗一段時(shí)間后，浸泡于蘇木精中染色，一般動(dòng)物組織為半分鐘，植物組織3-5min。脫水：將復(fù)染后的片子置于水中沖洗后，依次將載玻片放入70％酒精-80％酒精-90％酒精-95％酒精-100％酒精-100％酒精-二甲苯-二甲苯。每個(gè)試劑中放置2min，最后浸泡在二甲苯中，搬到通風(fēng)柜中。封片：用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側(cè)，然后輕輕放下另一側(cè)，以免產(chǎn)生氣泡，封好片子后置于通風(fēng)柜中晾干。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證胡椒酸鉀注射對(duì)腫瘤組織形態(tài)的影響，進(jìn)行了HE染色以及免疫組化分析(參見圖8)。從圖8-A中可以看出，注射了生理鹽水組的小鼠腫瘤結(jié)構(gòu)致密，且腫瘤周圍壞死較少，而注射了胡椒酸鉀小鼠的腫瘤組織結(jié)構(gòu)較為疏松，且周圍壞死較多，胡椒酸鉀注射可以減少腫瘤組織的惡性化程度。圖8-B為通過(guò)免疫組化檢測(cè)血管內(nèi)皮生成因子VEGF在胡椒酸鉀注射前后的表達(dá)情況，從圖中可以看出，在注射生理鹽水組中VEGF表達(dá)陽(yáng)性，而在注射胡椒酸鉀組中VEGF呈現(xiàn)陰性，說(shuō)明胡椒酸鉀可以抑制腫瘤細(xì)胞周圍的血管形成。

實(shí)施例7：胡椒酸鉀與依托泊苷聯(lián)合用藥對(duì)細(xì)胞活性的的影響

依托泊苷為已應(yīng)用于臨床的成熟癌癥治療藥物。在臨床中依托泊苷與替吉奧膠囊聯(lián)合使用，用于乳腺癌的化療過(guò)程。但由于替吉奧膠囊本身為化學(xué)合成西藥，有一定的毒負(fù)作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證胡椒酸鉀的藥物作用，我們用胡椒酸鉀(GBK)與依托泊苷(VP-16)共同作用于MCF-7細(xì)胞，測(cè)定單獨(dú)及聯(lián)合作用后對(duì)細(xì)胞活性的影響。

將乳腺癌細(xì)胞MCF-7消化起來(lái)后，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為5×10³/100μl，在96孔板最外層每孔加入100μl 1×PBS，向第一列加入空白培養(yǎng)基，向96孔板的其余每個(gè)孔中各加100μl細(xì)胞懸液，分別設(shè)置1+1、1+10、5+5、5+10和10+10這5種GBK+VP-16的濃度組合測(cè)定細(xì)胞活性，每次實(shí)驗(yàn)相同濃度重復(fù)3次，且獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每種細(xì)胞均使用各自培養(yǎng)基作為調(diào)0孔，24h加入不同濃度的GBK+VP-16組合，在37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，48h后向每孔加入10μl CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)90min，用酶標(biāo)儀在OD＝450nm波長(zhǎng)下讀數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活性。

結(jié)果如圖9所示，當(dāng)單獨(dú)使用依托泊苷處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7的時(shí)候，達(dá)到59.72％的抑制率需要的依托泊苷濃度是10μg/ml；當(dāng)單獨(dú)使用胡椒酸鉀處理乳腺癌細(xì)胞MCF-7的時(shí)候，達(dá)到50.00％的抑制率需要的依托泊苷濃度是290μg/ml；當(dāng)將兩種藥物共同作用于MCF-7細(xì)胞后，達(dá)到45.96％的抑制率需要的組合濃度為依托泊苷5μg/ml+胡椒酸鉀5μg/ml，兩種藥物的使用量都明顯減少。所以兩種藥物共同作用后可以明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，并顯著減少依托泊苷的用量。

本發(fā)明所述的一種新型化學(xué)合成的乳腺癌靶向藥物胡椒酸鉀的藥理藥效鑒定方法，包括以下步驟:

(7)化學(xué)合成:胡椒酸鉀是以胡椒堿為原料合成的水溶性降脂胡椒堿衍生物，具體的合成過(guò)程如下：首先將3.5kg氫氧化鉀在15升95％乙醇中充分溶解，然后加入2kg胡椒堿攪拌充分溶解，回流反應(yīng)10h,此時(shí)要將溫度控制在88℃，抽濾，即可得到胡椒酸鉀鹽(為了簡(jiǎn)化，在說(shuō)明書的后續(xù)部分以GBK作為胡椒酸鉀的簡(jiǎn)寫)。

(8)腫瘤細(xì)胞系及正常對(duì)照細(xì)胞系的培養(yǎng)：

本發(fā)明實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用到的腫瘤細(xì)胞系及正常對(duì)照細(xì)胞系的名稱及培養(yǎng)方式如下：

三種培養(yǎng)基的不同成分購(gòu)自不同的生物公司，其中DMEM、RPMI-1640購(gòu)自HyClone公司，F(xiàn)12購(gòu)自gibco公司、青鏈霉素混合液Pen Strep(+10000Units/ml Penicillin、+10000μg/ml Streptomycin)、谷氨酰胺L-Glu(100×L-Glutamin)，胰島素(insulin)和地塞米松(dexamethasone)購(gòu)自SIGMA公司。

貼壁細(xì)胞在相應(yīng)培養(yǎng)基中置于37℃，5％(v/v)CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到培養(yǎng)器皿底面積的80％的時(shí)候，按照1：10的比例進(jìn)行細(xì)胞傳代。傳代時(shí)先用適量胰酶消化細(xì)胞，直至大多數(shù)的細(xì)胞從培養(yǎng)皿底部消化起來(lái)，之后用9倍于胰酶體積的完全培養(yǎng)基終止消化反應(yīng)。按照所需細(xì)胞濃度進(jìn)行細(xì)胞的傳代。

(9)胡椒酸鉀對(duì)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞毒性測(cè)定

通過(guò)測(cè)定胡椒酸鉀對(duì)正常細(xì)胞和癌細(xì)胞毒性，以便確定在后續(xù)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中藥物的使用濃度。

將多種正常細(xì)胞(GES-1，L132，HSF，COS-7)和癌細(xì)胞(MCF-7，SUM159，HepG2，A549，BGC-823，SGC-7901)從37℃，5％CO₂培養(yǎng)箱中拿出來(lái)，在超凈臺(tái)中去掉各自的培養(yǎng)基，加入10ml 1×PBS(Transgen Biotech)洗去殘留的培養(yǎng)基，在每個(gè)培養(yǎng)皿中加1ml 0.05％的胰酶，放回到細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃，5％CO₂中消化3min。3min后取出培養(yǎng)皿，在顯微鏡下觀察是否將細(xì)胞消化起來(lái)，在消化起來(lái)的細(xì)胞培養(yǎng)皿中加入適量相應(yīng)培養(yǎng)基終止消化，吹打均勻后，取10μl于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)1ml培養(yǎng)基中細(xì)胞的個(gè)數(shù)，之后調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的細(xì)胞個(gè)數(shù)，使其終濃度為5×10³/100μl。取出96孔板，在96孔板最外層每孔加入100μl 1×PBS，然后向96孔板的最左側(cè)一列加入100μl空白培養(yǎng)基，作為陰性對(duì)照組，在其余孔中各加入100μl相應(yīng)的細(xì)胞懸液，搖勻后重新放回培養(yǎng)箱中37℃，5％CO₂培養(yǎng)24h，用于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)。24h后除陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照外，從左向右依次加入0.2μg/ml、0.5μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、50μg/ml、100μg/ml、200μg/ml和400μg/ml濃度梯度的GBK作用于細(xì)胞中48h，48h后向每孔(包括陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組)均加入10μl CCK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)中繼續(xù)培養(yǎng)90min，在酶標(biāo)儀上OD＝450nm波長(zhǎng)下，測(cè)定細(xì)胞的存活率，預(yù)測(cè)GBK對(duì)不同細(xì)胞作用的IC₅₀值(參見圖1)。

(10)胡椒酸鉀的選擇性抑制作用實(shí)驗(yàn)

通過(guò)測(cè)定胡椒酸鉀對(duì)于不同的癌細(xì)胞系以及正常細(xì)胞系生長(zhǎng)的抑制作用，確定胡椒酸鉀是否對(duì)某些癌細(xì)胞的增殖具有選擇性的抑制作用。

將貼壁的正常細(xì)胞及癌細(xì)胞消化起來(lái)，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度，使其濃度為5×10³/100μl，在96孔板最外層每孔加入100μl 1×PBS，向第一列加入每種細(xì)胞相應(yīng)的空白培養(yǎng)基，向96孔板的其余每個(gè)孔中各加100μl細(xì)胞懸液，37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。24h后按照0μg/ml、50μg/ml、75μg/ml、100μg/ml、290μg/ml、400μg/ml的濃度向每孔中加入無(wú)菌無(wú)酶水或GBK溶液，每種細(xì)胞分別都設(shè)置這6個(gè)GBK的濃度梯度。每次實(shí)驗(yàn)相同濃度重復(fù)3次，且獨(dú)立實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，每種細(xì)胞均使用各自培養(yǎng)基作為調(diào)0孔，到相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)后向每孔加入10μl CCK-8溶液繼續(xù)培養(yǎng)90min，用酶標(biāo)儀在OD＝450nm波長(zhǎng)下讀數(shù)，計(jì)算細(xì)胞活性。

(11)胡椒酸鉀對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響

抗腫瘤藥物對(duì)于腫瘤細(xì)胞增殖的抑制作用一般是通過(guò)產(chǎn)生細(xì)胞壓力(cellular stress),比如氧化壓力、復(fù)制壓力、代謝和蛋白毒性壓力以及DNA損傷。DNA復(fù)制壓力作用于細(xì)胞周期進(jìn)程的不同階段，阻礙細(xì)胞周期進(jìn)程，最終達(dá)到抑制腫瘤細(xì)胞增殖的目的。因此檢測(cè)胡椒酸鉀對(duì)腫瘤細(xì)胞周期的影響，將有助于探究其抑制癌細(xì)胞增殖的機(jī)理。

取出MCF-7、HepG2、SGC-7901，消化細(xì)胞后，將細(xì)胞分別用6cm板，在細(xì)胞培養(yǎng)箱中37℃，5％CO₂培養(yǎng)24h。24h后以0μg/ml、1/2IC₅₀μg/ml、IC₅₀μg/ml、2IC₅₀μg/ml濃度加入GBK溶液處理細(xì)胞48h。48h后收集細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)：配制70％乙醇，放在-20℃預(yù)冷。倒掉培養(yǎng)基，向每個(gè)6cm板中加入少量1×PBS，洗去殘留的培養(yǎng)基，向每個(gè)6cm板中加入0.6ml 0.05％的胰酶，放回到37℃，5％CO₂細(xì)胞培養(yǎng)箱中消化細(xì)胞3min。3min后，取出6cm板，向每個(gè)6cm板中加入1.4ml 1×PBS吹打均勻，終止消化，并將其收集到2ml離心管中。500rpm，離心10min。取出離心管，棄上清液，重新加入1ml 1×PBS重懸細(xì)胞，洗去殘留胰酶，500rpm，離心10min。10min后，取出離心管，棄上清液，再次加入200μl 1×PBS重懸細(xì)胞。從冰箱中取出提前預(yù)冷的70％乙醇，取800μl加入到1.5ml離心管中，置于冰上繼續(xù)預(yù)冷。將200μl 1×PBS重懸的細(xì)胞懸液加到預(yù)冷的70％乙醇中，置于冰上固定30min。從-20℃中取出RNase A，取1μl 10mg/ml RNase+99μl去離子水配制成100μg/ml Ribonuclease A(RNase A)，備用。從4℃冰箱中取出1mg/ml PI，取62.5μl 1mg/ml PI+937.5μl去離子水將PI稀釋為62.5μg/ml，備用。30min后，從冰上取出離心管，置于離心機(jī)中500rpm，離心10min。10min后取出離心管，棄上清液，加入500μl 1×PBS重懸細(xì)胞，500rpm，離心10min，洗去殘留的乙醇。取出離心管，棄上清液，向每個(gè)離心管中各自加入100μl 100μg/ml Ribonuclease A(RNase A)，室溫下孵育5min。5min后，向每個(gè)離心管中加入400μl 62.5μg/ml的PI染料，工作濃度為50μg/ml，置于冰上，避光孵育染色30min。30min后，將細(xì)胞懸液用200目的篩子過(guò)濾到流式細(xì)胞上樣管中，每個(gè)上樣管都須置于冰上，上樣檢測(cè)，分析數(shù)據(jù)。

(12)胡椒酸鉀對(duì)腫瘤細(xì)胞信號(hào)通路的影響

首先從胡椒酸鉀處理過(guò)的癌細(xì)胞中提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA后進(jìn)行人類細(xì)胞全基因組轉(zhuǎn)錄芯片(global transcriptional microarray)篩選，篩選出胡椒酸鉀處理后乳腺瘤細(xì)胞(MCF-7)及胃癌細(xì)胞(SGC-7901)相對(duì)于不處理的相應(yīng)腫瘤細(xì)胞系的差異表達(dá)基因，篩選出GBK影響的細(xì)胞途徑。

提取總RNA的過(guò)程及反轉(zhuǎn)錄過(guò)程：將MCF-7及SGC-7901細(xì)胞從細(xì)胞培養(yǎng)箱中取出后，用胰蛋白酶消化起來(lái)，并以2×10⁶個(gè)/10ml的細(xì)胞量鋪板，并放于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h，24h后取出2個(gè)10cm板，按照1.5IC50μg/ml的濃度分別向兩個(gè)培養(yǎng)皿中加入GBK溶液和無(wú)菌無(wú)酶的水(對(duì)照組)，分別標(biāo)為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，繼續(xù)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，48h后提取總RNA，具體步驟如下：從培養(yǎng)箱中取出2個(gè)培養(yǎng)皿，去掉培養(yǎng)基，并用1×PBS洗一次，洗去殘留的培養(yǎng)基。向2個(gè)培養(yǎng)皿中分別加入1ml TransZol^TM Up，輕輕搖晃培養(yǎng)皿，吹打細(xì)胞，使裂解液能夠均勻的分布在培養(yǎng)皿表面，與細(xì)胞密切接觸。用細(xì)胞刮鏟充分刮鏟貼壁細(xì)胞，使得裂解液中無(wú)明顯沉淀。用無(wú)菌無(wú)酶的槍頭將細(xì)胞裂解液加入到1.5ml無(wú)菌無(wú)酶離心管中。在無(wú)菌無(wú)酶的條件下，室溫中靜置5min。向1.5ml無(wú)菌無(wú)酶離心管中加入200μl氯仿，劇烈振蕩30s，無(wú)菌無(wú)酶條件下室溫放置3min。將離心管置于提前預(yù)冷的低溫離心機(jī)中10000rpm，低溫(4℃)離心15min。取500μl上清液于一個(gè)新的1.5ml無(wú)菌無(wú)酶離心管中，然后加入500μl異丙醇，顛倒混勻，在室溫條件下放置10min。10000rpm，低溫(4℃)，離心10min。從離心機(jī)中取出離心管，棄上清。向1.5ml離心管中加入1ml提前配制好的75％乙醇溶液，渦旋1min。7500rpm，低溫(4℃)離心5min。棄上清，在無(wú)菌無(wú)酶條件下室溫干燥，使殘留的乙醇完全揮發(fā)掉。向1.5ml離心管中加入50μl RNA溶解液。在60℃烘箱中放置10min，在超凈臺(tái)中分裝3μl于小的無(wú)菌無(wú)酶PCR管中，用于凝膠電泳和濃度檢測(cè)，其余保存于-80℃冰箱中用于后續(xù)qRT-PCR。用無(wú)水乙醇處理電泳槽，并重新配置電泳用凝膠取少量樣品跑電泳。反轉(zhuǎn)錄的試劑購(gòu)自TransGen Biotech(貨號(hào)AT-311)，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

對(duì)人類細(xì)胞全基因組轉(zhuǎn)錄芯片篩選出的差異表達(dá)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證：實(shí)驗(yàn)所使用的熒光染料為Takara公司的 Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(貨號(hào)RR820A)。

如上說(shuō)明，本發(fā)明通過(guò)對(duì)化學(xué)合成藥物胡椒酸鉀對(duì)乳腺腫瘤細(xì)胞增殖的特異性抑制作用和內(nèi)在分子機(jī)理的研究，為胡椒酸鉀進(jìn)入治療乳腺癌的臨床階段奠定基礎(chǔ)。應(yīng)用本發(fā)明的相關(guān)研究方法，不僅適用于化學(xué)合成藥物的研究，也適用于天然產(chǎn)物活性提取物的研究，同時(shí)也適用于其他慢性病治療藥物的抗癌活性的研究。