本發(fā)明涉及一種生物制劑，尤其涉及一種抗衰老益生菌制劑及制備方法。

背景技術(shù)：

我國老齡化問題日漸嚴(yán)重，老年人口所占人口比重越來越大，尋找抗衰老活性物質(zhì)并對其機(jī)理的探索成為當(dāng)今應(yīng)對老齡化問題的研究熱點(diǎn)。目前，多種天然產(chǎn)物的抗衰老活性已被證實(shí)，但是由于其來源單一、分離純化困難、且成本昂貴，難以得到大范圍的應(yīng)用。益生菌作為一種潛在的抗衰老物質(zhì)，來源廣泛、安全性相對高、且價(jià)格便宜，逐漸受到大眾歡迎。

益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，大量報(bào)道證實(shí)益生菌具有多種生理功效，益生菌可以改善腸道環(huán)境、調(diào)節(jié)菌群平衡、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、緩解過敏癥狀等，目前有關(guān)益生菌的抗衰老功能的研究相對較少，主要集中在腸道菌群的調(diào)節(jié)、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)等方面。

研究發(fā)現(xiàn)，人體從出生到衰老的過程中，腸道菌群發(fā)生動(dòng)態(tài)變化，從幼兒到成年，乳桿菌、擬桿菌數(shù)量上升，雙歧桿菌數(shù)量略有下降，機(jī)體逐漸衰老進(jìn)入老年后，雙歧桿菌、擬桿菌等菌群種類及數(shù)量明顯下降，而一些產(chǎn)腐敗的梭狀芽孢桿菌等兼性厭氧菌數(shù)量顯著上升，益生菌作為腸道菌群中對宿主有益的菌群可以調(diào)節(jié)腸道菌群平衡。有學(xué)者研究表明，腸道中的腐敗菌分解蛋白質(zhì)及含硫化合物會(huì)產(chǎn)生硫化氫、生物胺等腐敗產(chǎn)物，這些腐敗產(chǎn)物被人體吸收后進(jìn)入血液對大腦、肝臟等重要器官產(chǎn)生毒害作用，加速機(jī)體的衰老，但是腸道中的雙歧桿菌、乳酸菌等可以分解糖類，生成乙酸、乳酸、丙酸、丁酸等短鏈脂肪酸，顯著降低腸道中pH值，抑制腐敗菌的生長，延緩機(jī)體衰老。

一般認(rèn)為隨著年齡的增長，自由基在機(jī)體中不斷積累，自由基使機(jī)體受到氧化損傷，人體的抗氧化防御系統(tǒng)的能力也逐漸下降，例如羥自由基與不飽和脂肪酸反應(yīng)改變細(xì)胞膜的完整性，也會(huì)使DNA脫氧核糖遭到破壞，導(dǎo)致DNA損傷及細(xì)胞死亡，加速機(jī)體的衰老，為彌補(bǔ)抗氧化能力的損失，可以強(qiáng)化體內(nèi)的抗氧化系統(tǒng)，同時(shí)也可以補(bǔ)充抗氧化物質(zhì)，有研究發(fā)現(xiàn)一些乳酸菌中存在抗氧 化酶類，例如超氧化物歧化酶(SOD)、NADH氧化酶、谷胱甘肽過氧化酶(GSH-Px)等從而使其具有抗氧化活性，同時(shí)一些非酶類菌體成分以及代謝產(chǎn)物也可能具有抗氧化功能。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供一種通過對腸道菌群的調(diào)節(jié)、維持腸道菌群平衡、抑制有害菌的生長、從而延緩機(jī)體衰老的抗衰老益生菌制劑及制備方法。

本發(fā)明第一方面提供一種抗衰老益生菌制劑，包括有效量的長雙歧桿菌BL21、植物乳桿菌Lp90以及輔料，其中：

所述長雙歧桿菌BL21，已于2015年1月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.10452，分類命名為長雙岐桿菌（Bifidobacterium longum），保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所；

所述植物乳桿菌Lp90，已于2015年1月27日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC NO.10453，分類命名為植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所。

本發(fā)明使用的術(shù)語“有效量”是指這樣的活性劑的量：其足夠高以遞送希望的益處，但是足夠低以避免在醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)的嚴(yán)重副作用。

具體的，所述輔料包括但不限于賦形劑、食品添加劑或益生元。

本發(fā)明第二方面提供一種如本發(fā)明第一方面提供的抗衰老益生菌制劑，在食品、保健品、以及藥品中的應(yīng)用。

具體的，所述藥品包括有效量的組合物以及適當(dāng)量的藥學(xué)上可接受的賦形劑，所述組合物包括長雙歧桿菌BL21和植物乳桿菌Lp90。

應(yīng)當(dāng)說明的是，所述藥品可以制備成任意合適的形式，所述形式不會(huì)不利地影響形成本發(fā)明的組合物的菌株的生物利用度。因而，本發(fā)明的組合物可以配制成以下述形式口服施用：例如，冷凍干燥的粉末、膠囊、片劑、液體制品等?？紤]到組合物的具體目的，賦形劑和最適當(dāng)?shù)呐渲品椒ǖ倪x擇是在藥物技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員的知識(shí)范圍內(nèi)。

本發(fā)明中所述的藥品，優(yōu)選為粉劑、片劑或膠囊。

本文使用的術(shù)語“藥學(xué)上可接受的”是指這樣的化合物、物質(zhì)、組合物和/ 或劑型：其在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)，適用于接觸受試者(例如人)的組織，沒有過度的毒性、刺激、變應(yīng)性應(yīng)答或其它問題或并發(fā)癥，與合理的收益/風(fēng)險(xiǎn)比相稱。每種載體、賦形劑等還必須是“可接受的”，其含義是，與制劑的其它成分相容。合適的載體、賦形劑等可以參見標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)教材。

本發(fā)明組合物中的菌株也可以被包含在多種食品中，諸如乳制品、酸乳、凝乳、干酪(例如quark、奶油、加工過的、軟的和硬的)、發(fā)酵乳、奶粉、基于奶的發(fā)酵的產(chǎn)品、冰淇淋、基于發(fā)酵的谷物的產(chǎn)品、基于奶的粉末、飲料、調(diào)味品和寵物食品。術(shù)語“食品”在本文中以它的最廣泛的含義使用，包括處于任意呈現(xiàn)形式的、可以被動(dòng)物攝入的任意類型的產(chǎn)品，但是不包括藥用的和獸藥用的產(chǎn)品。其它可食用的產(chǎn)品的實(shí)例是肉制品(例如肝糊、香腸和意大利臘腸或肉糊)、巧克力糊、填充物(例如松露、乳油)和霜白狀糖覆、巧克力、糖果(例如焦糖糖果、軟糖或太妃糖)、烘焙食品(蛋糕、餡餅)、調(diào)味料和湯、果汁和咖啡白化劑。特別令人感興趣的食品是飲食添加物和嬰兒配方。從本發(fā)明的意義上而言，飲食添加物也包括營養(yǎng)制品，所述營養(yǎng)制品已知是對人健康具有醫(yī)療效果的食品提取物。用于動(dòng)物食物的飼料也被包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明的組合物也可用作在其它食物產(chǎn)品中的成分。

具體的，所述食品或保健品包括組合物以及食品添加劑，所述組合物包括長雙歧桿菌BL21和植物乳桿菌Lp90，所述食品添加劑包括填充劑、矯味劑、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、抗酸劑、以及營養(yǎng)強(qiáng)化劑中的一種或多種。

具體的，所述填充劑包括淀粉、蔗糖、乳糖、微晶纖維素、三硅酸鎂、以及氫氧化鋁中的一種或多種；所述矯味劑為乳糖和/或蔗糖；所述崩解劑為淀粉；所述粘合劑為蔗糖；所述抗酸劑為三硅酸鎂和/或氫氧化鋁；所述潤滑劑為滑石粉；所述營養(yǎng)強(qiáng)化劑包括維生素、礦物質(zhì)、益生元和/或膳食纖維。

本發(fā)明第三方面提供一種抗衰老益生菌制劑的制備方法，包括以下步驟：

S1、將長雙歧桿菌BL21、植物乳桿菌Lp90分別于試管中活化，得到一級種子液，再將一級種子液分別轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中得到二級種子液，將二級種子液分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度發(fā)酵，待發(fā)酵液中菌體密度達(dá)到10⁹cfu/mL，分別收集所述發(fā)酵液；

S2、將所述發(fā)酵液分別離心，收集菌體后加入保護(hù)劑乳化，真空冷凍干燥制得菌粉；

S3、將菌粉與輔料復(fù)配，混合均勻得到所述抗衰老益生菌制劑。

具體的，所述輔料為低聚糖。

具體的，所述種子培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基，所述MRS液體培養(yǎng)基的pH值為6.5～6.8，所述MRS液體培養(yǎng)基以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)包括：2％的乳糖、1％的蛋白胨、0.5％的酵母膏、0.5％的乙酸鈉、0.2％的檸檬酸氫二銨、0.2％的磷酸氫二鉀、0.06％的七水硫酸鎂、0.02％的一水硫酸錳、0.1％的L-半胱氨酸鹽、0.1％的吐溫-80、余量為水。

具體的，所述長雙歧桿菌BL21的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為6.0～7.0，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)包括：1％的乳糖、1％的葡萄糖、1％的蛋白胨、0.5％的牛肉膏、1％的酵母膏、0.5％的乙酸鈉、0.2％的檸檬酸氫二銨、0.2％的磷酸氫二鉀、0.06％的七水硫酸鎂、0.02％的一水硫酸錳、0.1％的L-半胱氨酸鹽、余量為水。

具體的，所述植物乳桿菌Lp90發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為6.0～7.0，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)包括：2％的葡萄糖、1％的蛋白胨、1％的牛肉膏、0.5％的酵母膏、0.5％的乙酸鈉、0.2％的檸檬酸氫二銨、0.2％的磷酸氫二鉀、0.06％的七水硫酸鎂、0.02％的一水硫酸錳、0.1％的L-半胱氨酸鹽、余量為水。

具體的，所述二級種子液接至發(fā)酵培養(yǎng)基中的接種量為1％-5％。

具體的，所述種子的培養(yǎng)條件為28～40℃，厭氧培養(yǎng)8～24h，所述發(fā)酵培養(yǎng)條件為30～40℃，厭氧培養(yǎng)8～18h。

具體的，所述長雙歧桿菌BL21、植物乳桿菌Lp90二者比例為：2-5:2、或者2:1-4，所述抗衰老益生菌制劑中二者總活菌數(shù)不少于5×10⁹cfu/g。

借由上述方案，本發(fā)明至少具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的抗衰老益生菌制劑，其有效成分為長雙歧桿菌BL21、植物乳桿菌Lp90，研究結(jié)果表明該益生菌制劑耐受力強(qiáng)，抗氧化作用明顯，具有廣闊的市場前景，且本發(fā)明的益生菌制劑制備簡單，易于工業(yè)化生產(chǎn)。

上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚了解本發(fā)明的技術(shù) 手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實(shí)施，以下以本發(fā)明的較佳實(shí)施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。

附圖說明

圖1是本發(fā)明中兩種菌株經(jīng)酸化及膽鹽處理后的存活率結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合附圖和實(shí)施例，對本發(fā)明的具體實(shí)施方式作進(jìn)一步詳細(xì)描述。以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。

實(shí)施例一 抗衰老益生菌菌粉的制備

S1、將長雙歧桿菌BL21、植物乳桿菌Lp90分別于試管中活化，得到一級種子液，再將一級種子液分別轉(zhuǎn)接至種子培養(yǎng)基中得到二級種子液，培養(yǎng)條件為28～40℃，厭氧培養(yǎng)8～24h；將二級種子液分別接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度發(fā)酵，二級種子液接至發(fā)酵培養(yǎng)基中的接種量為1％-5％，培養(yǎng)條件為30～40℃，厭氧培養(yǎng)8～18h，待發(fā)酵液中菌體密度達(dá)到10⁹，分別收集發(fā)酵液；

其中，種子培養(yǎng)基為MRS液體培養(yǎng)基，MRS液體培養(yǎng)基的pH值為6.5～6.8，MRS液體培養(yǎng)基以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)包括：2％的乳糖、1％的蛋白胨、0.5％的酵母膏、0.5％的乙酸鈉、0.2％的檸檬酸氫二銨、0.2％的磷酸氫二鉀、0.06％的七水硫酸鎂、0.02％的一水硫酸錳、0.1％的L-半胱氨酸鹽、0.1％的吐溫-80、余量為水。

長雙歧桿菌BL21的發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為6.0～7.0，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)包括：1％的乳糖、1％的葡萄糖、1％的蛋白胨、0.5％的牛肉膏、1％的酵母膏、0.5％的乙酸鈉、0.2％的檸檬酸氫二銨、0.2％的磷酸氫二鉀、0.06％的七水硫酸鎂、0.02％的一水硫酸錳、0.1％的L-半胱氨酸鹽、余量為水。

植物乳桿菌Lp90發(fā)酵培養(yǎng)基的pH值為6.0～7.0，以質(zhì)量分?jǐn)?shù)計(jì)包括：2％的葡萄糖、1％的蛋白胨、1％的牛肉膏、0.5％的酵母膏、0.5％的乙酸鈉、0.2％的檸檬酸氫二銨、0.2％的磷酸氫二鉀、0.06％的七水硫酸鎂、0.02％的一水硫酸錳、0.1％的L-半胱氨酸鹽、余量為水。118℃滅菌20min。

S2、將所述發(fā)酵液分別離心，收集菌體后加入保護(hù)劑乳化，真空冷凍干燥制得菌粉。

實(shí)施例二 益生菌體外耐酸耐膽鹽能力測試

A、菌株耐酸能力測定

方法：將菌粉按照1％(w/v)的接種量接入模擬人工胃液中(pH＝2.5)處理3h，取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，以0時(shí)活菌數(shù)作為對照，計(jì)算菌株的存活率。

B、菌株耐膽鹽能力測定

方法：菌粉按照1％(w/v)的接種量接入模擬人工腸液中(膽鹽濃度0.3％)培養(yǎng)3h，取樣進(jìn)行平板菌落計(jì)數(shù)，以0時(shí)活菌數(shù)作為對照，計(jì)算菌株的存活率。

結(jié)果如圖1所示，長雙歧桿菌BL21、植物乳桿菌Lp90經(jīng)過酸化及膽鹽處理后，存活率均在60％以上，耐受能力較強(qiáng)。

實(shí)施例三 清除自由基能力與超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定

A、材料

SOD試劑盒，H₂O₂，F(xiàn)eSO₄，鄰苯三酚，O-菲羅啉及其他試劑均為分析純試劑。

B、方法

1)無細(xì)胞提取物的制備

2株菌株(長雙歧桿菌BL21、植物乳桿菌Lp90)在MRS培養(yǎng)基中37℃連續(xù)培養(yǎng)3代，8000r/min離心20min收集菌體，PBS緩沖液洗滌3次后重懸于PBS緩沖液中，活菌數(shù)調(diào)整在10¹⁰cfu/mL，冰浴并于超聲細(xì)胞破碎儀中破碎細(xì)胞，4℃條件下離心30min后收集上清液。

2)2株菌對超氧自由基(O₂^-)的清除能力的測定

采用鄰苯三酚自氧化比色分析法，將濃度為150mmol/L、pH＝8.0的Tris-HCl緩沖液，以及3mmol/L二乙三胺五乙酸，1.2mmol/L的鄰苯三酚加入到1mL收集的上清液中，25℃恒溫反應(yīng)10min，325nm下測定吸光值。

O₂^-清除率％＝(1-(A3-A1)/(A2-A0))×100％

其中，A3為含上清液及鄰苯三酚；A2為不含上清、含鄰苯三酚；A1為含上清、不含鄰苯三酚；A0為不含上清及鄰苯三酚

3)2株菌對羥自由基(HO·)清除能力的測定

2mL、pH為7.0的PBS緩沖液中加入2mLO-菲啰啉，以及2mL的濃度為2.5mmol/L的FeSO₄，20mmol/L的H₂O₂以及1mL的上清液，37℃恒溫反應(yīng)1.5h，536nm處測吸光值。

HO·清除率(％)＝〔(A2-A1)/(A0-A1)〕×100％

其中，A0為不含上清和H₂O₂；A1為不含上清、含H₂O₂；A2為含上清和H₂O₂。

4)2株菌的超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定

用SOD試劑盒，按產(chǎn)品說明操作，定義每毫克蛋白在1mL反應(yīng)液中SOD抑制率達(dá)50％時(shí)所對應(yīng)的SOD量為一個(gè)SOD活力單位。

C、結(jié)果與分析

清除自由基能力及SOD活性測定結(jié)果如表1所示：

表1自由基清除率及SOD活性測定結(jié)果統(tǒng)計(jì)表

由表1可知，長雙歧桿菌BL21對超氧自由基清除率及羥自由基清除率都較好，植物乳桿菌Lp90對羥自由基清除能力較好，其中植物乳桿菌Lp90超氧化物歧化酶具有較好的活力，總體來說兩株菌的抗氧化活性較強(qiáng)。

實(shí)施例四 抗衰老益生菌制劑的制備

實(shí)驗(yàn)步驟如下：

S1、長雙歧桿菌BL21、植物乳桿菌Lp90分別于種子培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)24h制備一代種子液。所得的一級種子液轉(zhuǎn)接入種子培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)16h制備二代種子液。

S2、二級種子液按照5％的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行高密度培養(yǎng)，37℃ 培養(yǎng)12h，發(fā)酵起始PH6.0-7.0，待發(fā)酵液活菌數(shù)達(dá)到10⁹cfu/mL，收集發(fā)酵液，離心獲得菌體。

S3、收集的菌體加入保護(hù)劑后凍干得到凍干菌粉，將長雙歧桿菌BL21：植物乳桿菌Lp90成比例進(jìn)行復(fù)配，加入低聚糖混合均勻，制得抗衰老益生菌制劑。所得抗衰老益生菌制劑成品中兩株菌菌落總數(shù)不少于5×10⁹cfu/g。

按照長雙歧桿菌BL21：植物乳桿菌Lp90＝2:3比例進(jìn)行復(fù)配，所得抗衰老益生菌制劑可以獲得較為均衡的清除超氧自由基能力、對羥自由基清除能力、以及超氧化物歧化酶活力。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。