本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種淡紫擬青霉發(fā)酵生產(chǎn)方法及淡紫擬青霉二級液體培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
線蟲可侵襲和寄生植物，被侵襲和寄生的植物因線蟲吸收體內(nèi)營養(yǎng)而影響正常的生長發(fā)育，并且線蟲代謝的分泌物會刺激寄主植物的細胞和組織，導(dǎo)致植株畸形。大多數(shù)植物線蟲侵害植物的地下部分，如根、塊莖等，根部可表現(xiàn)為結(jié)瘤、壞死、根短粗和叢生，導(dǎo)致農(nóng)作物大量減產(chǎn)或質(zhì)量嚴重下降。常見的植物線蟲病有根結(jié)線蟲病、大豆胞囊線蟲病、小麥粒線蟲病、甘薯莖線蟲病、水稻干尖線蟲病、柑橘半穿刺線蟲病等。
淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)屬于內(nèi)寄生性真菌，是一些植物寄生線蟲的重要天敵，能夠寄生于卵，也能侵染幼蟲和雌蟲，可有效防治多種作物根結(jié)線蟲、胞囊線蟲、莖線蟲等植物線蟲病的危害。淡紫擬青霉的寄主廣、易培養(yǎng)，而且功效高，特別是在控制植物病原線蟲方面具有顯著功效。半個多世紀以來，國內(nèi)外的研究學(xué)者對淡紫擬青霉進行了廣泛而深入的研究，在生物學(xué)、生態(tài)學(xué)、控害效能與田間應(yīng)用等方面取得了一系列的研究成果，在生物防治上表現(xiàn)出巨大的潛力，市場前景廣闊，雖然傳統(tǒng)的真菌發(fā)酵方法能夠?qū)崿F(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但是存在發(fā)酵時間長，成本高，收率低等問題。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
有鑒于此，本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，而提供一種淡紫擬青霉發(fā)酵生產(chǎn)方法及淡紫擬青霉二級液體培養(yǎng)基。
為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供了一種淡紫擬青霉發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟：
1)將淡紫擬青霉菌種活化；
2)將所述步驟1)得到的活化后的淡紫擬青霉接種于淡紫擬青霉一級液體培養(yǎng)基中進行一級液體培養(yǎng)，得到淡紫擬青霉一級種子液；
3)將所述步驟2)得到的一級種子液接種于淡紫擬青霉二級液體培養(yǎng)基中進行二級液體培養(yǎng)，得到淡紫擬青霉二級種子液；
所述二級液體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量含量的組分：蔗糖30～50g/L，黃豆粉15～25g/L，硝酸鈉1～8g/L，磷酸氫二鉀1.0～2.0g/L，硫酸鋅0.18～0.30g/L，硫酸鐵0.01～0.08g/L，余量為水；
4)將所述步驟3)得到的二級種子液接種于淡紫擬青霉固體培養(yǎng)基中，進行固體培養(yǎng)，得到淡紫擬青霉。
進一步，所述步驟2)中一級液體培養(yǎng)的條件為：
培養(yǎng)的時間為35～50h，培養(yǎng)的溫度為25～30℃，培養(yǎng)的初始pH值為6.0～7.0，接種量為0.5～1.5％；
培養(yǎng)的過程進行通氣，具體為：進入培養(yǎng)24h內(nèi)，通氣量為10～20m3/h，培養(yǎng)24h后，通氣量為15～24m3/h；
培養(yǎng)在黑暗中進行。
進一步，所述步驟3)中二級液體培養(yǎng)的條件為：
培養(yǎng)的時間為55～75h，培養(yǎng)的溫度為25～30℃，培養(yǎng)的初始pH值為6.0～7.0，培養(yǎng)的接種量為5～15％；
培養(yǎng)的過程需要通氣，具體為：進入培養(yǎng)24h內(nèi)，通氣量為130～170m3/h，培養(yǎng)24h后，通氣量為200～260m3/h；
培養(yǎng)在攪拌下進行，攪拌的頻率為1～2次/h，每次攪拌的時間為10～20min；
培養(yǎng)在黑暗中進行。
進一步，所述步驟4)中固體培養(yǎng)的條件為：
固體培養(yǎng)的過程進行溫度和濕度的控制，所述溫度和濕度的控制程序具體為：在進入固體培養(yǎng)1～3d之內(nèi)控制環(huán)境濕度為80～90％，環(huán)境溫度為24～28℃，菌料溫度控制為24～28℃，在進入固體培養(yǎng)4～5d之內(nèi)控制環(huán)境濕度為40～50％，環(huán)境溫度為26℃，6～7d之內(nèi)環(huán)境溫度為28～30℃；
所述固體培養(yǎng)28～32h時翻盤散熱；
所述固體培養(yǎng)45～55h時將營養(yǎng)液噴灑到菌料上。
進一步，所述營養(yǎng)液包括以下質(zhì)量含量的組分：5％葡萄糖，0.002％CaCl2和0.003％ZnSO4；
所述營養(yǎng)液的噴灑量為菌料體積的5～10％。
進一步，所述淡紫擬青霉一級液體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量含量的組分：葡萄糖30～50g/L，黃豆粉5～15g/L，硝酸鈉5～15g/L，磷酸氫二鉀1.8～2.2g/L，氯化鉀0.25～0.75g/L，硫酸鎂0.18～0.30g/L，硫酸鐵0.01～0.08g/L，余量為水。
進一步，所述淡紫擬青霉固體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量含量的組分：麥麩40～60％，玉米粉25～35％，黃豆粉5～15％，谷殼5～13％，硫酸銨0.5～1.5％。
本發(fā)明提供了上述方案所述的淡紫擬青霉二級液體培養(yǎng)基，包括以下質(zhì)量含量的組分：蔗糖10～80g/L，黃豆粉1～30g/L，硝酸鈉0.1～20g/L，磷酸氫二鉀0.05～5g/L，硫酸鋅0.03～3g/L，硫酸鐵0.01～1g/L，余量為水。
本發(fā)明提供了一種淡紫擬青霉發(fā)酵生產(chǎn)方法，將淡紫擬青霉菌種活化，一級種子液體培養(yǎng)基中含氮量高，促使菌體集中在菌體生產(chǎn)上，得到更加強健的菌體。在二級種子液培養(yǎng)基中，強健的菌體可以產(chǎn)生更多的孢子，同時淡紫擬青霉孢子可在二級液體培養(yǎng)基中萌發(fā)，進而在固體培養(yǎng)培養(yǎng)階段，快速產(chǎn)生大量的菌體，在3.0×1010cfu/g以上。
進一步的，本發(fā)明通過溫度與濕度梯度化管理來完成產(chǎn)孢子，在剛進行固體培養(yǎng)時，給予高溫高濕的環(huán)境，讓菌絲在固體培養(yǎng)基中迅速適應(yīng)環(huán)境；在密集發(fā)酵期即進入發(fā)酵第20h～40h時，物料溫度將會急速升高，應(yīng)降低環(huán)境溫度，防止燒盤，同時在30h左右將發(fā)酵料翻動，以便于扇熱的同時為菌種更好的提供空氣；在產(chǎn)孢階段，降低房間濕度和溫度，有利于促進菌絲產(chǎn)生孢子；在50h左右補液能夠給菌絲充足的葡萄糖和無機鹽以促進產(chǎn)孢子。
保藏說明
淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)，于2013年8月13日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學(xué)院微生物研究所，生物保藏編號為CGMCCNo.7994。
具體實施方式
本發(fā)明提供了一種淡紫擬青霉發(fā)酵生產(chǎn)方法，包括以下步驟：
1)將淡紫擬青霉菌種活化；
2)將所述步驟1)得到的活化后的淡紫擬青霉接種于淡紫擬青霉一級液體培養(yǎng)基中進行一級液體培養(yǎng)，得到淡紫擬青霉一級種子液；
3)將所述步驟2)得到的一級種子液接種于淡紫擬青霉二級液體培養(yǎng)基中進行二級液體培養(yǎng)，得到淡紫擬青霉二級種子液；
所述二級液體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量含量的組分：蔗糖10～80g/L，黃豆粉1～30g/L，硝酸鈉0.1～20g/L，磷酸氫二鉀0.05～5g/L，硫酸鋅0.03～3g/L，硫酸鐵0.01～1g/L，余量為水；
4)將所述步驟3)得到的二級種子液接種于淡紫擬青霉固體培養(yǎng)基中，進行固體培養(yǎng)，得到淡紫擬青霉。
在本發(fā)明中，所述淡紫擬青霉優(yōu)選為選自生物保藏編號為CGMCC No.7994的菌種活化培養(yǎng)得到。
本發(fā)明中淡紫擬青霉菌種的活化是將保藏的淡紫擬青霉菌種接種于裝有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄型瓶中，25～30℃培養(yǎng)10～14h進行活化培養(yǎng)。
得到活化的淡紫擬青霉，本發(fā)明將所述活化的淡紫擬青霉接種到淡紫擬青霉一級液體培養(yǎng)基中進行淡紫擬青霉一級液體培養(yǎng)，得到淡紫擬青霉一級種子液。
在本發(fā)明中，所述一級液體培養(yǎng)的時間優(yōu)選為35～50h，更優(yōu)選為40～48h，最有選為43h。所述一級液體培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為25～30℃，更優(yōu)選為26～29℃，最優(yōu)選為28℃。所述一級液體培養(yǎng)的初始pH值優(yōu)選6.0～7.0，更優(yōu)選為6.4～6.8，最優(yōu)選為6.5。所述一級液體培養(yǎng)的接種量優(yōu)選為0.5～1.5％，更優(yōu)選為0.8～1.2％，最優(yōu)選為1.0％。
在本發(fā)明中，在一級液體培養(yǎng)的過程進行通氣，具體優(yōu)選為：進入培養(yǎng)24h內(nèi)，通氣量為10～20m3/h，培養(yǎng)24h后，通氣量為15～24m3/h；更優(yōu)選為：進入培養(yǎng)24h內(nèi)，通氣量為12～18m3/h，培養(yǎng)24h后，通氣量為18～22m3/h；最優(yōu)選為：進入培養(yǎng)24h內(nèi)，通氣量為15m3/h，培養(yǎng)24h后，通氣量為20m3/h。本發(fā)明對所述通氣的設(shè)備沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的通氣設(shè)備即可，如通風(fēng)機。
在本發(fā)明中，所述一級液體培養(yǎng)在黑暗條件下進行培養(yǎng)。本發(fā)明對提供黑暗條件的方法沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選用的提供黑暗條件的方法即可。
在本發(fā)明中，所述淡紫擬青霉一級液體培養(yǎng)基優(yōu)選包括以下質(zhì)量含量的組分：葡萄糖30～50g/L，黃豆粉5～15g/L，硝酸鈉5～15g/L，磷酸氫二鉀1.8～2.2g/L，氯化鉀0.25～0.75g/L，硫酸鎂0.18～0.30g/L，硫酸鐵0.01～0.08g/L，余量為水；更優(yōu)選為葡萄糖35～45g/L，黃豆粉8～12g/L，硝酸鈉8～12g/L，磷酸氫二鉀1.9～2.15g/L，氯化鉀0.35～0.65g/L，硫酸鎂0.20～0.26g/L，硫酸鐵0.03～0.07g/L，余量為水；最優(yōu)選為葡萄糖40g/L，黃豆粉10g/L，硝酸鈉10g/L，磷酸氫二鉀2.06g/L，氯化鉀0.5g/L，硫酸鎂0.24g/L，硫酸鐵0.05g/L，余量為水。本發(fā)明對上述藥品的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)用于制備培養(yǎng)基的藥品即可。
得到淡紫擬青霉一級種子液后，本發(fā)明將所述一級淡紫擬青霉一級種子液接種于淡紫擬青霉二級液體培養(yǎng)基中進行淡紫擬青霉二級液體培養(yǎng)，得到淡紫擬青霉二級種子液。
在本發(fā)明中，所述淡紫擬青霉二級液體培養(yǎng)的時間優(yōu)選為55～75h，更優(yōu)選為60～70h，最優(yōu)選為65h；所述二級液體培養(yǎng)的溫度優(yōu)選為25～30℃，更優(yōu)選為26～29℃，最優(yōu)選為28℃；所述二級液體培養(yǎng)的初始pH值優(yōu)選為6.0～7.0，更優(yōu)選為6.3～6.7，最優(yōu)選為6.5；所述二級液體培養(yǎng)的接種量優(yōu)選為5～15％，更優(yōu)選為8～12％，最優(yōu)選為10％。
在本發(fā)明中，在二級液體培養(yǎng)過程通入空氣，具體優(yōu)選為進入培養(yǎng)24h內(nèi)，通氣量為130～170m3/h，培養(yǎng)24h后，通氣量為200～260m3/h；更優(yōu)選為進入培養(yǎng)24h內(nèi)，通氣量為140～160m3/h，培養(yǎng)24h后，通氣量為210～250m3/h；最優(yōu)選為進入培養(yǎng)24h內(nèi)，通氣量為150m3/h，培養(yǎng)24h后，通氣量為230m3/h。本發(fā)明對所述通氣的設(shè)備沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的通氣設(shè)備即可，如通風(fēng)機。
在本發(fā)明中，所述二級液體培養(yǎng)需要在攪拌下進行，攪拌的頻率優(yōu)選為1～2次/h，更優(yōu)選為2次/h；每次攪拌的時間優(yōu)選為10～20min，更優(yōu)選為12～18min，最優(yōu)選為15min。本發(fā)明對所述攪拌的設(shè)備沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的攪拌設(shè)備即可。
在本發(fā)明中，所述二級液體培養(yǎng)在黑暗條件下進行培養(yǎng)。本發(fā)明對提供黑暗條件的方法沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)選用的提供黑暗條件的方法即可。
在本發(fā)明中，所述二級液體培養(yǎng)基優(yōu)選包括以下質(zhì)量含量的組分：蔗糖10～80g/L，黃豆粉1～30g/L，硝酸鈉0.1～20g/L，磷酸氫二鉀0.05～5g/L，硫酸鋅0.03～3g/L，硫酸鐵0.01～1g/L，余量為水；更優(yōu)選為蔗糖25～60g/L，黃豆粉8～22g/L，硝酸鈉3～15g/L，磷酸氫二鉀0.5～3g/L，硫酸鋅0.1～2g/L，硫酸鐵0.03～0.07g/L，余量為水；最優(yōu)選為蔗糖40g/L，黃豆粉20g/L，硝酸鈉5g/L，磷酸氫二鉀1.5g/L，硫酸鋅0.24g/L，硫酸鐵0.05g/L，余量為水。本發(fā)明對上述藥品的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)用于制備培養(yǎng)基的藥品即可。
得到淡紫擬青霉二級種子液后，本發(fā)明將得到的淡紫擬青霉二級種子液接種于淡紫擬青霉固體培養(yǎng)基中，進行固體培養(yǎng)，得到淡紫擬青霉。
在本發(fā)明中，所述淡紫擬青霉固體培養(yǎng)的接種量優(yōu)選為5～15％，更優(yōu)選為8～12％，最優(yōu)選為10％。在本發(fā)明中，所述淡紫擬青霉固體培養(yǎng)基的初始含水量優(yōu)選為30～70％，更優(yōu)選為40～60％，最優(yōu)選為50％。在本發(fā)明中，所述固體培養(yǎng)的培養(yǎng)基厚度優(yōu)選為1～6cm，更優(yōu)選為2～4cm，最優(yōu)選為3cm。
在本發(fā)明中，所述淡紫擬青霉固體培養(yǎng)的過程溫度和濕度的控制，所述溫度和濕度的控制程序具體優(yōu)選為：在進入固體培養(yǎng)1～3d之內(nèi)控制環(huán)境濕度為80～90％，環(huán)境溫度為24～28℃，菌料溫度控制為24～28℃，在進入固體培養(yǎng)4～5d之內(nèi)控制環(huán)境濕度為40～50％，環(huán)境溫度為26℃，6～7d之內(nèi)環(huán)境溫度為28～30℃；更優(yōu)選為：在進入固體培養(yǎng)1～3d之內(nèi)控制環(huán)境濕度為85％，環(huán)境溫度為26℃，菌料溫度控制為26℃，在進入固體培養(yǎng)4～5d之內(nèi)控制環(huán)境濕度為45％，環(huán)境溫度為26℃，6～7d之內(nèi)環(huán)境溫度為29℃，環(huán)境濕度為自然條件下的濕度。
在本發(fā)明中，所述淡紫擬青霉固體培養(yǎng)優(yōu)選在28～32h時翻盤散熱，更優(yōu)選為29～31h，最優(yōu)選為30h。
在本發(fā)明中，所述淡紫擬青霉固體培養(yǎng)優(yōu)選在45～55h時將營養(yǎng)液噴灑到菌料上，更優(yōu)選為48～52h，最優(yōu)選為50h。所述營養(yǎng)液的噴灑量優(yōu)選為菌料體積的5～10％，更優(yōu)選為6～9％，最優(yōu)選為8％。本發(fā)明對噴灑營養(yǎng)液的設(shè)備沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的噴灑設(shè)備即可。
在本發(fā)明中，所述營養(yǎng)液優(yōu)選包括以下質(zhì)量含量的組分：5％葡萄糖，0.002％CaCl2和0.003％ZnSO4。本發(fā)明對上述藥品的來源沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)使用的藥品即可。
在本發(fā)明中，所述淡紫擬青霉固體培養(yǎng)基優(yōu)選包括以下質(zhì)量含量的組分：麥麩40～60％，玉米粉25～35％，黃豆粉5～15％，谷殼5～13％，硫酸銨0.5～1.5％；更優(yōu)選為麥麩45～55％，玉米粉27～32％，黃豆粉8～12％，谷殼7～11％，硫酸銨0.8～1.2％；最優(yōu)選為麥麩50％，玉米粉30％，黃豆粉10％，谷殼9％，硫酸銨1％。本發(fā)明對上述原料的來源沒有特殊的限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)配置培養(yǎng)基的原料即可。
所述固體培養(yǎng)后，本發(fā)明優(yōu)選對得到孢子粉的進行收集，得到淡紫擬青霉孢子。在本發(fā)明實施例中，所述孢子粉的收集具體采用微生物固態(tài)發(fā)酵真菌孢子分離設(shè)備的儀器進行。所述微生物固態(tài)發(fā)酵真菌孢子分離設(shè)備的儀器購自江西天人生態(tài)股份有限公司。
本發(fā)明提供了上述方案所述的淡紫擬青霉二級液體培養(yǎng)基，包括以下質(zhì)量含量的組分：蔗糖10～80g/L，黃豆粉1～30g/L，硝酸鈉0.1～20g/L，磷酸氫二鉀0.05～5g/L，硫酸鋅0.03～3g/L，硫酸鐵0.01～1g/L，余量為水；更優(yōu)選為蔗糖25～60g/L，黃豆粉8～22g/L，硝酸鈉3～15g/L，磷酸氫二鉀0.5～3g/L，硫酸鋅0.1～2g/L，硫酸鐵0.03～0.07g/L，余量為水；最優(yōu)選為蔗糖40g/L，黃豆粉20g/L，硝酸鈉5g/L，磷酸氫二鉀1.5g/L，硫酸鋅0.24g/L，硫酸鐵0.05g/L，余量為水。本發(fā)明對上述藥品的來源沒有特殊限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員常規(guī)用于制備培養(yǎng)基的藥品即可。
在本發(fā)明中，所述淡紫擬青霉二級液體培養(yǎng)基優(yōu)選經(jīng)120～130℃滅菌30～45min后使用。在本發(fā)明中，所述滅菌溫度更優(yōu)選為125℃；所述滅菌時間更優(yōu)選為40min。本發(fā)明對所述滅菌的設(shè)備沒有特殊限定，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的滅菌設(shè)備即可，如高壓蒸汽滅菌鍋。
在本發(fā)明中，所述淡紫擬青霉二級液體培養(yǎng)基中的碳氮比適宜，使一級液體培養(yǎng)基生長出的強健菌體產(chǎn)生更多的淡紫擬青霉孢子，同時淡紫擬青霉孢子可在二級液體培養(yǎng)基中萌發(fā)，進而可在固體培養(yǎng)階段產(chǎn)生大量的菌體。
下面將結(jié)合本發(fā)明中的實施例，對本發(fā)明中的技術(shù)方案進行清楚、完整地描述。顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。
實施例1
淡紫擬青霉一級種子液的制備：將保藏的淡紫擬青霉菌種接種于裝有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄型瓶中，28℃培養(yǎng)12h進行活化培養(yǎng)，完成菌種活化；活化后的淡紫擬青霉菌種按照1％的接種量接種于淡紫擬青霉一級液體培養(yǎng)基中，一級液體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量含量的組分：葡萄糖40g/L，黃豆粉10g/L，硝酸鈉10g/L，磷酸氫二鉀2.06g/L，氯化鉀0.5g/L，硫酸鎂0.24g/L，硫酸鐵0.05g/L，余量為水。淡紫擬青霉一級液體培養(yǎng)的溫度為28℃，初始pH值為6.8，進入培養(yǎng)24h內(nèi)按照15m3/h通氣量進行通氣培養(yǎng)，液體培養(yǎng)24h后按照20m3/h的通氣量進行通氣培養(yǎng)，黑暗培養(yǎng)43h后，停止培養(yǎng)，得到淡紫擬青霉一級種子液。
淡紫擬青霉二級種子液的制備：將得到的淡紫擬青霉一級種子液以10％接種量接種于淡紫擬青霉二級液體培養(yǎng)基中，二級液體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量含量的組分：蔗糖40g/L，黃豆粉20g/L，硝酸鈉5g/L，磷酸氫二鉀1.5g/L，硫酸鋅0.24g/L，硫酸鐵0.05g/L，余量為水。二級液體培養(yǎng)的溫度為28℃，pH值為6.5，進入培養(yǎng)24h內(nèi)，通氣量為150m3/h，培養(yǎng)24h后，通氣量為230m3/h，每小時攪拌2次，每次攪拌時間為15min，黑暗培養(yǎng)65h后，停止培養(yǎng)，得到淡紫擬青霉二級種子液。
淡紫擬青霉的固體培養(yǎng)：將得到的淡紫擬青霉二級種子液以10％的接種量接種于淡紫擬青霉固體培養(yǎng)基中，固體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量含量的組分：麥麩50％，玉米粉30％，黃豆粉10％，谷殼9％，硫酸銨1％。淡紫擬青霉固體培養(yǎng)基的初始含水量為50％，固體培養(yǎng)第1d環(huán)境溫度為28℃，物料溫度為24℃，環(huán)境濕度在90％下進行培養(yǎng)；固體培養(yǎng)第2d環(huán)境溫度為24℃，菌料溫度為28℃，環(huán)境濕度在85％下進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)30h時進行翻盤；固體培養(yǎng)第3d環(huán)境溫度為26℃，物料溫度為28℃，環(huán)境濕度在80％下進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)50h時將5％葡萄糖、0.002％CaCl2和0.003％ZnSO4的營養(yǎng)液噴灑到菌料上；固體培養(yǎng)第4d環(huán)境溫度為26℃，環(huán)境濕度在50％下進行培養(yǎng)；固體培養(yǎng)第5d環(huán)境溫度為26℃，環(huán)境濕度在40％下進行培養(yǎng)；固體培養(yǎng)第6d環(huán)境溫度為28℃，環(huán)境濕度在自然條件下進行培養(yǎng)；固體培養(yǎng)第7d環(huán)境溫度為30℃，環(huán)境濕度在自然條件下進行培養(yǎng)，固體培養(yǎng)7d后，停止培養(yǎng)，得到的淡紫擬青霉有效孢子量在3.0×1010cfu/g以上。
將固體培養(yǎng)后的菌料采用微生物固態(tài)培養(yǎng)真菌孢子分離設(shè)備收集淡紫擬青霉孢子，將收集的孢子在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)，以確定為淡紫擬青霉孢子。
實施例2
淡紫擬青霉一級種子液的制備：將保藏的淡紫擬青霉菌種接種于裝有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄型瓶中，28℃培養(yǎng)10h進行活化培養(yǎng)，完成菌種活化；活化后的淡紫擬青霉菌種按照0.5％的接種量接種于淡紫擬青霉一級液體培養(yǎng)基中，一級液體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量含量的組分：葡萄糖30g/L，黃豆粉15g/L，硝酸鈉15g/L，磷酸氫二鉀2.2g/L，氯化鉀0.25g/L，硫酸鎂0.18g/L，硫酸鐵0.05g/L，余量為水。淡紫擬青霉一級液體培養(yǎng)的溫度為28℃，初始pH值為7.0，進入培養(yǎng)24h內(nèi)按照15m3/h通氣量進行通氣培養(yǎng)，液體培養(yǎng)24h后按照20m3/h的通氣量進行通氣培養(yǎng)，黑暗培養(yǎng)45h后，停止培養(yǎng)，得到淡紫擬青霉一級種子液。
淡紫擬青霉二級種子液的制備：將得到的淡紫擬青霉一級種子液以5％接種量接種于淡紫擬青霉二級液體培養(yǎng)基中，二級液體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量含量的組分：蔗糖50g/L，黃豆粉20g/L，硝酸鈉5g/L，磷酸氫二鉀1.5g/L，硫酸鋅0.30g/L，硫酸鐵0.08g/L，余量為水。二級液體培養(yǎng)的溫度為28℃，pH值為6.8，進入培養(yǎng)24h內(nèi)，通氣量為150m3/h，培養(yǎng)24h后，通氣量為230m3/h，每小時攪拌1次，每次攪拌時間為10min，黑暗培養(yǎng)75h后，停止培養(yǎng)，得到淡紫擬青霉二級種子液。
淡紫擬青霉的固體培養(yǎng)：將得到的淡紫擬青霉二級種子液以15％的接種量接種于淡紫擬青霉固體培養(yǎng)基中，固體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量含量的組分：麥麩60％，玉米粉25％，黃豆粉15％，谷殼13％，硫酸銨1.5％。淡紫擬青霉固體培養(yǎng)基的初始含水量為50％，固體培養(yǎng)第1d環(huán)境溫度為28℃，菌料溫度為24℃，環(huán)境濕度在90％下進行培養(yǎng)；固體培養(yǎng)第2d環(huán)境溫度為24℃，物料溫度為28℃，環(huán)境濕度在85％下進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)30h時進行翻盤；固體培養(yǎng)第3d環(huán)境溫度為26℃，物料溫度為28℃，環(huán)境濕度在80％下進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)50h時將5％葡萄糖、0.002％CaCl2和0.003％ZnSO4的營養(yǎng)液噴灑到菌料上；固體培養(yǎng)第4d環(huán)境溫度為26℃，環(huán)境濕度在50％下進行培養(yǎng)；固體培養(yǎng)第5d環(huán)境溫度為26℃，環(huán)境濕度在40％下進行培養(yǎng)；固體培養(yǎng)第6d環(huán)境溫度為28℃，環(huán)境濕度在自然條件下進行培養(yǎng)；固體培養(yǎng)第7d環(huán)境溫度為30℃，環(huán)境濕度在自然條件下進行培養(yǎng)，固體培養(yǎng)7d后，停止培養(yǎng)，得到的淡紫擬青霉有效孢子量在3.0×1010cfu/g以上。
將固體培養(yǎng)后的菌料采用微生物固態(tài)培養(yǎng)真菌孢子分離設(shè)備收集淡紫擬青霉孢子，將收集的孢子在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)，以確定為淡紫擬青霉孢子。
實施例3
淡紫擬青霉一級種子液的制備：將保藏的淡紫擬青霉菌種接種于裝有營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基的茄型瓶中，28℃培養(yǎng)12h進行活化培養(yǎng)，完成菌種活化；活化后的淡紫擬青霉菌種按照1.5％的接種量接種于淡紫擬青霉一級液體培養(yǎng)基中，一級液體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量含量的組分：葡萄糖50g/L，黃豆粉15g/L，硝酸鈉5g/L，磷酸氫二鉀1.8g/L，氯化鉀0.75g/L，硫酸鎂0.18g/L，硫酸鐵0.05g/L，余量為水。淡紫擬青霉一級液體培養(yǎng)的溫度為28℃，初始pH值為6.5，進入培養(yǎng)24h內(nèi)按照15m3/h通氣量進行通氣培養(yǎng)，液體培養(yǎng)24h后按照20m3/h的通氣量進行通氣培養(yǎng)，黑暗培養(yǎng)45h后，停止培養(yǎng)，得到淡紫擬青霉一級種子液。
淡紫擬青霉二級種子液的制備：將得到的淡紫擬青霉一級種子液以15％接種量接種于淡紫擬青霉二級液體培養(yǎng)基中，二級液體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量含量的組分：蔗糖30g/L，黃豆粉25g/L，硝酸鈉8g/L，磷酸氫二鉀1.5g/L，硫酸鋅0.30g/L，硫酸鐵0.08g/L，余量為水。二級液體培養(yǎng)的溫度為28℃，pH值為6.5，進入培養(yǎng)24h內(nèi)，通氣量為150m3/h，培養(yǎng)24h后，通氣量為200m3/h，每小時攪拌2次，每次攪拌時間為10min，黑暗培養(yǎng)65h后，停止培養(yǎng)，得到淡紫擬青霉二級種子液。
淡紫擬青霉的固體培養(yǎng)：將得到的淡紫擬青霉二級種子液以20％的接種量接種于淡紫擬青霉固體培養(yǎng)基中，固體培養(yǎng)基包括以下質(zhì)量含量的組分：麥麩50％，玉米粉35％，黃豆粉15％，谷殼9％，硫酸銨0.5％。淡紫擬青霉固體培養(yǎng)基的初始含水量為50％，固體培養(yǎng)第1d環(huán)境溫度為28℃，菌料溫度為24℃，環(huán)境濕度在90％下進行培養(yǎng)；固體培養(yǎng)第2d環(huán)境溫度為24℃，物料溫度為28℃，環(huán)境濕度在85％下進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)31h時進行翻盤；固體培養(yǎng)第3d環(huán)境溫度為26℃，物料溫度為28℃，環(huán)境濕度在80％下進行培養(yǎng)，在培養(yǎng)52h時將5％葡萄糖、0.002％CaCl2和0.003％ZnSO4的營養(yǎng)液噴灑到菌料上；固體培養(yǎng)第4d環(huán)境溫度為26℃，環(huán)境濕度在50％下進行培養(yǎng)；固體培養(yǎng)第5d環(huán)境溫度為26℃，環(huán)境濕度在40％下進行培養(yǎng)；固體培養(yǎng)第6d環(huán)境溫度為28℃，環(huán)境濕度在自然條件下進行培養(yǎng)；固體培養(yǎng)第7d環(huán)境溫度為30℃，環(huán)境濕度在自然條件下進行培養(yǎng)，固體培養(yǎng)7d后，停止培養(yǎng)，得到的淡紫擬青霉有效孢子量在3.0×1010cfu/g以上。
將固體培養(yǎng)后的菌料采用微生物固態(tài)培養(yǎng)真菌孢子分離設(shè)備收集淡紫擬青霉孢子，將收集的孢子在顯微鏡下觀察孢子形態(tài)，以確定為淡紫擬青霉孢子。
由以上實施例可知，在淡紫擬青霉一級種子液制備中以高的含氮量，促使菌種集中在菌體生產(chǎn)上，生長出更加強健的菌體，在淡紫擬青霉二級種子液產(chǎn)生中，適宜的碳氮比產(chǎn)生強健的菌絲，可以產(chǎn)生更多的孢子，同時孢子可在菌液中萌發(fā)，使得在固體培養(yǎng)階段產(chǎn)生大量的菌體，最終得到的淡紫擬青霉有效孢子量在3.0×1010cfu/g以上。
以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護范圍。