本發(fā)明涉及生物發(fā)酵方法領域，尤其涉及一種綠僵菌高孢粉的制備方法。
背景技術：
20世紀中期以來，由于化學殺蟲劑無限制地使用，嚴重污染了環(huán)境和農(nóng)林牧產(chǎn)品，危害了人畜健康，同時使自然生態(tài)系統(tǒng)遭到破壞。生物防治日益被人們所重視，利用昆蟲病原微生物防治害蟲是生物防治的重要手段之一。真菌殺蟲劑由于具有良好的擴散效果、較長的宿存能力、獨特的體壁入侵方式，以及對害蟲不產(chǎn)生抗藥性和易大量生產(chǎn)等特點，使得真菌殺蟲劑在森林害蟲、土壤害蟲和刺吸式口器害蟲的生物防治中具有明顯的優(yōu)勢。
綠僵菌是最早應用于害蟲生物防治的一種蟲生真菌，能寄生8個目30個科昆蟲超過200余種昆蟲，利用綠僵菌防治害蟲的研究與實踐已逾百年，其具有致病力強、不污染環(huán)境、持效期長等特點，是一種可持續(xù)防治害蟲的優(yōu)良生物制劑，也是當今用于生物防治的主要真菌殺蟲劑之一，在生物防治中具有重要的應用價值。分生孢子是綠僵菌劑型的主要成分，而綠僵菌高孢粉(母粉)是指經(jīng)過提取、篩分得到的含孢量高的綠僵菌分生孢子粉，綠僵菌高孢粉可以作為可濕性粉劑、油劑、微膠囊劑等多種劑型的原料，用途十分廣泛。因此，如何大量、快速獲得綠僵菌孢子是綠僵菌高孢粉制備的基礎。
目前，國內(nèi)外綠僵菌分生孢子的獲得主要是采用液固雙相發(fā)酵的方式，即將液體種子接種于常規(guī)的大米、麥麩、玉米粉等營養(yǎng)基質(zhì)固體劑型固體發(fā)酵，但不足之處顯而易見：培養(yǎng)過程中環(huán)境因子調(diào)控復雜，不易干燥，發(fā)酵周期長，污染率高，產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定，接種量一般在10％，同時分生孢子與固體基質(zhì)混合在一起，不易分離，這些因素制約了綠僵菌高孢粉的生產(chǎn)應用和防治效果。
作為改進，公開號為CN 1212772 C的中國發(fā)明專利公開了金龜子綠僵菌無紡布菌條生產(chǎn)工藝方法，該方法包括五道生產(chǎn)工序，即菌種的取得，一級斜面菌種培養(yǎng)、液體種子培養(yǎng)、液體發(fā)酵罐生產(chǎn)和菌條的接種培養(yǎng)。將無菌布條作為金龜子綠僵菌的固定載體，最終將金龜子綠僵菌無紡布菌條直接用于害蟲防治，雖然一定程度上避免了孢子與基質(zhì)難分離的問題，但是其液體發(fā)酵采用三級發(fā)酵，發(fā)酵時間需要8-10天，發(fā)酵周期很長，影響了生產(chǎn)效率，且其制得的最產(chǎn)品僅僅只能作為菌條使用，限制了其使用形式，不能像分離的高孢粉可作為可濕性粉劑、油劑、微膠囊劑等的原料，同時，其菌條較大，表面積較小一定程度也限制了接種量，也不易操作。
因此，有必要發(fā)明一種生產(chǎn)效率高、易分離的綠僵菌高孢粉的制備方法。
技術實現(xiàn)要素：
本發(fā)明所要解決的技術問題是：一種生產(chǎn)效率高、易分離的綠僵菌高孢粉的制備方法。
為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案為：
本發(fā)明提供一種綠僵菌高孢粉的制備方法，包括：綠僵菌菌絲發(fā)酵液與經(jīng)蒸汽高溫滅菌并冷卻室溫的營養(yǎng)液按1：1-3的比例混合得混合液，將浸有混合液的布塊或浸有混合液的海綿塊裝入底部具有通孔且可堆疊的發(fā)酵容器中，置于溫度為25-28℃的發(fā)酵室中進行發(fā)酵5-6天；
所述營養(yǎng)液包括以下重量份原料制備而成：麥麩汁1000份、米粉20份和白砂糖40份；
所述麥麩汁的制備方法為：按每1000g水中加300g麥麩，煮沸10min過濾取濾液，所得濾液加水補至1000g得所述麥麩汁。
所述布塊可以是任意的織物纖維塊，優(yōu)選為的土工織物布塊，規(guī)格為700～1000g/m2，所述的海綿塊為PVA高密度吸水海綿。
本發(fā)明的有益效果在于：(1)通過采用浸有混合液的布塊或海綿塊作為綠僵菌生產(chǎn)和產(chǎn)孢的固定載體，與傳統(tǒng)大米、麥麩、玉米粉等營養(yǎng)基質(zhì)相比，干燥速度快、孢子易分離，且由于布塊或海綿塊的體積小，表面積大使得其接種量大(其接種量為傳統(tǒng)等體積培養(yǎng)基接種量的2.5-5倍)，平均發(fā)酵周期為5-6天，較傳統(tǒng)固體基質(zhì)培養(yǎng)的7-10天，大大縮短了培養(yǎng)時間，因此，大大提高了綠僵菌高孢粉的生產(chǎn)效率且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定；(2)由于綠僵菌分生孢子為氣生孢子，培養(yǎng)過程中，由于發(fā)酵容器中間層有通氣孔，保持中間層的通氣效果好，加之基質(zhì)高度≤3cm，有利于孢子產(chǎn)生，培養(yǎng)過程中整個發(fā)酵容器密閉，布塊或海綿塊內(nèi)的水分幾乎不會散失，所以無需調(diào)控環(huán)境濕度也能保證綠僵菌菌絲生長過程中所需的高濕度，簡化了生產(chǎn)工藝；(3)采用織物布或海綿塊作為綠僵菌生產(chǎn)和產(chǎn)孢的固定載體，方便收集孢子時操作；(4)在綠僵菌菌絲發(fā)酵液加入上述營養(yǎng)液，確保接種到布塊或海綿塊上的菌絲再生長和產(chǎn)孢的營養(yǎng)，同時增加繁殖系數(shù)，增加布塊或海綿塊上的綠僵菌分生孢子的產(chǎn)量。
具體實施方式
為詳細說明本發(fā)明的技術內(nèi)容、所實現(xiàn)目的及效果，以下結合實施方式予以說明。
本發(fā)明最關鍵的構思在于：將浸有綠僵菌液體培養(yǎng)基和營養(yǎng)液的布塊或海綿塊代替常規(guī)的大米、麥麩、玉米粉等營養(yǎng)基質(zhì)作為綠僵菌生產(chǎn)和產(chǎn)孢的固定載體，布塊或海綿塊的表面積大，綠僵菌在布塊或海綿塊快速生長和產(chǎn)孢，然后將綠僵菌孢子篩分制成綠僵菌高孢粉。
本發(fā)明提供一種綠僵菌高孢粉的制備方法，包括：綠僵菌菌絲發(fā)酵液與經(jīng)蒸汽高溫滅菌并冷卻室溫的營養(yǎng)液按1：1-3的比例混合得混合液，將浸有混合液的布塊或浸有混合液的海綿塊裝入底部具有通孔且可堆疊的發(fā)酵容器中，置于溫度為25-28℃的發(fā)酵室中進行發(fā)酵5-6天；所述營養(yǎng)液包括以下重量份原料制備而成：麥麩汁1000份、米粉20份和白砂糖40份；所述麥麩汁的制備方法為：按每1000g水中加300g麥麩，煮沸10min過濾取濾液，所得濾液加水補至1000g得所述麥麩汁。
所述布塊可以是任意的織物纖維塊，優(yōu)選為的土工織物布塊，規(guī)格為700～1000g/m2，所述的海綿塊為PVA高密度吸水海綿。
從上述描述可知，本發(fā)明的有益效果在于：通過采用浸有混合液的布塊或海綿塊作為綠僵菌生產(chǎn)和產(chǎn)孢的固定載體，與傳統(tǒng)大米、麥麩、玉米粉等營養(yǎng)基質(zhì)相比，干燥速度快、孢子易分離，且由于布塊或海綿塊的體積小，表面積大使得其接種量大(其接種量為傳統(tǒng)等體積培養(yǎng)基接種量的2.5-5倍)；平均發(fā)酵周期為5-6天，較傳統(tǒng)固體基質(zhì)培養(yǎng)的7-10天，大大縮短了培養(yǎng)時間。因此，大大提高了綠僵菌高孢粉的生產(chǎn)效率且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定；由于綠僵菌分生孢子為氣生孢子，培養(yǎng)過程中，由于發(fā)酵容器中間層有通孔，保持中間層的通氣效果好，加之基質(zhì)高度≤3cm，有利于孢子產(chǎn)生，培養(yǎng)過程中整個發(fā)酵容器密閉，布塊或海綿塊內(nèi)的水分幾乎不會散失，所以無需調(diào)控環(huán)境濕度也能保證綠僵菌菌絲生長過程中所需的高濕度，簡化了生產(chǎn)工藝；采用布塊或海綿塊作為綠僵菌生產(chǎn)和產(chǎn)孢的固定載體，方便收集孢子時操作；在綠僵菌菌絲發(fā)酵液加入上述營養(yǎng)液，確保接種到布塊或海綿塊上的菌絲再生長和產(chǎn)孢的營養(yǎng)，同時增加繁殖系數(shù)，增加布塊或海綿塊上的綠僵菌分生孢子的產(chǎn)量。
進一步的，所述綠僵菌菌絲發(fā)酵液的培養(yǎng)：將綠僵菌菌種用盛有斜面培養(yǎng)基的試管在24-26℃條件下傳代培養(yǎng)、活化，當所述斜面培養(yǎng)基的斜面表面長滿孢子時于無菌操作臺中，從所述斜面培養(yǎng)基的斜面挑取少量孢子及菌苔接入經(jīng)蒸汽高溫滅菌并冷卻至室溫的液體培養(yǎng)基中；接種后的液體培養(yǎng)基在振蕩箱25±1℃恒溫培養(yǎng)60-72h，待長成粘稠菌絲體后即得所述綠僵菌菌絲發(fā)酵液。
進一步的，所述液體培養(yǎng)基包括以下重量份原料制備而成：水1000份，玉米粉20份，米粉20份及白砂糖40份。
由上述描述可知，本發(fā)明的有益效果在于：將玉米粉、米粉及白砂糖作為液體培養(yǎng)基，配制簡單，原料價廉、來源廣泛，降低了生產(chǎn)成本。
進一步的，所述布塊或海綿塊的長度為4-6cm，寬度為2-4cm，高度為0.3-0.5cm。
由上述描述可知，本發(fā)明的有益效果在于：布塊或海綿塊的長、寬、高均較小，相對于簡單用長布條或長條海綿而言，表面積更大，可以在同一空間培養(yǎng)更多綠僵菌，提高空間利用率，從而產(chǎn)孢量增大，進而使得振動篩分獲得的孢子更多，即使得同樣的空間中綠僵菌分生孢子的產(chǎn)量提高。
進一步的，所述浸有混合液的布塊或所述浸有混合液的海綿塊的制備方法為：將10-15塊所述布塊或所述海綿塊放入于100mL所述混合液，20-60S后取出即得所述浸有混合液的布塊或所述浸有混合液的海綿塊。
由上述描述可知，本發(fā)明的有益效果在于：將所述布塊或海綿塊直接浸入混合液，快速簡單的完成接種，又將營養(yǎng)液吸附到了布塊或海綿塊上，滿足了綠僵菌生長和產(chǎn)孢的需要。
進一步的，所述布塊優(yōu)選為的土工織物布塊，規(guī)格為700～1000g/m2，所述的海綿塊為PVA高密度吸水海綿。
由上述描述可知，本發(fā)明的有益效果在于：所述土工織物布塊或所述高密度吸水海綿塊的保濕性好，加之發(fā)酵容器的密封，可以減少綠僵菌菌絲生長及產(chǎn)孢過程中濕度的調(diào)控。
本發(fā)明的具體實施方式有：
一種綠僵菌高孢粉的制備方法，包括如下步驟：
1綠僵菌菌絲發(fā)酵液的培養(yǎng)
1.1菌種：產(chǎn)孢良好的綠僵菌。一般以斜面4℃低溫保存。
1.2斜面菌種：預先將綠僵菌菌種用試管斜面在25±1℃條件下傳代培養(yǎng)，當斜面表面長滿孢子時即可使用。斜面培養(yǎng)基為微生物培養(yǎng)中所通用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。
1.3液體培養(yǎng)基：按重量份玉米粉20份，米粉20份及白砂糖40份，混合均勻后，加入水1000份，得液體培養(yǎng)基，每個500mL三角瓶中裝入200mL培養(yǎng)基，121℃下蒸汽高溫滅菌30min，冷卻后備用。
1.4接種：于無菌操作臺中，從菌種斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液體培養(yǎng)基中。
1.5搖床培養(yǎng)：25±1℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)60-72h，待長成粘稠菌絲體后即為綠僵菌菌絲發(fā)酵液。
2菌塊的接種培養(yǎng)
2.1營養(yǎng)液的制備方法：按每1000g水中加300g麥麩，煮沸10min過濾取濾液，所得濾液加水補至1000g得所述麥麩汁，將所述麥麩汁1000份、米粉20份和白砂糖40份混合得所述營養(yǎng)液，每個500mL的三角瓶裝入200mL所述營養(yǎng)液，于121℃下蒸汽高溫滅菌30min，冷卻后備用。
2.2布塊或海綿塊滅菌處理：將長度為4-6cm，寬度為2-4cm，高度為0.3-0.5cm的土工織物布塊(規(guī)格為700～1000g/m2)或PVA高密度吸水海綿塊裝入塑料袋，于121℃條件下蒸汽高溫滅菌30min。
2.3接種：在預先進行空間滅菌的密閉房間內(nèi)，將所述綠僵菌菌絲發(fā)酵液與經(jīng)蒸汽高溫滅菌并冷卻室溫的營養(yǎng)液按1：1-3的比例混合、攪拌得混合液，即接種量為25％-50％，將10-15塊上述經(jīng)蒸汽高溫滅菌處理的布塊或海綿塊放入100mL混合液，每5S翻動一次混合液中的布塊或海綿塊，20-60S后，待布塊或海綿塊吸收飽和后，取出得所述浸有混合液的布塊或所述浸有混合液的海綿塊。
2.4培養(yǎng)：將所述浸有混合液的布塊或所述浸有混合液的海綿塊裝入已經(jīng)過表面消毒的底部具有通孔且可堆疊的塑料發(fā)酵箱中(外尺寸：480×355×170mm，內(nèi)尺寸：445×320×165mm)，隨即轉入發(fā)酵室培養(yǎng)，置于溫度為25-28℃的發(fā)酵室中進行發(fā)酵5-6天。
步驟1.2中所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，具體配方為：含100g馬鈴薯(煮沸過濾)、10g葡萄糖、20g瓊脂及水1000g；
步驟2.3中所述的營養(yǎng)液，具體配方為：麥麩汁1000份、米粉20份和白砂糖40份，所述麥麩汁的制備方法為：按每1000g水中加300g麥麩，煮沸10min過濾取濾液，所得濾液加水補至1000g得所述麥麩汁；
步驟2.3中所述布塊或海綿塊的長度為4-6cm，寬度為2-4cm，高度為0.3-0.5cm。
實施例一
本實施例的綠僵菌高孢粉的制備方法，包括如下步驟：
1綠僵菌菌絲發(fā)酵液的培養(yǎng)
1.1菌種：綠僵菌(MaZPTR-01)菌株，福建省林業(yè)科學研究院森林保護研究所保存，為公知菌株。
1.2斜面菌種：預先將綠僵菌菌種用試管斜面在25±1℃條件下傳代培養(yǎng)、活化，當斜面表面長滿孢子時即可使用。斜面培養(yǎng)基為微生物培養(yǎng)中所通用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。
1.3液體培養(yǎng)基：按重量份玉米粉20份，米粉20份及白砂糖40份，混合均勻后，加入水1000份，得液體培養(yǎng)基，配制該液體培養(yǎng)基2L，每個500mL三角瓶中裝入200mL培養(yǎng)基，121℃下蒸汽高溫滅菌30min，冷卻后備用。
1.4接種：于無菌操作臺中，從菌種斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液體培養(yǎng)基中。
1.5搖床培養(yǎng)：25±1℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)60h，待長成粘稠菌絲體后即為綠僵菌菌絲發(fā)酵液。
2菌塊的接種培養(yǎng)
2.1營養(yǎng)液的制備方法：按每1000g水中加300g麥麩，煮沸10min過濾取濾液，所得濾液加水補至1000g得所述麥麩汁，將所述麥麩汁1000份、米粉20份和白砂糖40份混合得所述營養(yǎng)液，，每個500mL的三角瓶裝入200mL所述營養(yǎng)液，于121℃下蒸汽高溫滅菌30min，冷卻后備用。
2.2布塊或海綿塊滅菌處理：將長度為4cm，寬度為2cm，高度為0.3cm的土工織物布塊或高密度吸水海綿塊裝入聚丙烯塑料袋(可耐濕熱滅菌)，于121℃條件下蒸汽高溫滅菌30min。
2.3接種：在預先進行空間滅菌的密閉房間內(nèi)，將所述綠僵菌菌絲發(fā)酵液與經(jīng)蒸汽高溫滅菌并冷卻室溫的營養(yǎng)液按1：1的比例混合、攪拌得混合液，即接種量為50％，將10塊上述經(jīng)蒸汽高溫滅菌處理的布塊或海綿塊放入100mL混合液，每5S翻動一次混合液中的布塊或海綿塊，20S后，待布塊或海綿塊吸收飽和后，取出得所述浸有混合液的布塊或所述浸有混合液的海綿塊。
2.4培養(yǎng)：將所述浸有混合液的布塊或所述浸有混合液的海綿塊裝入已經(jīng)過表面消毒的底部具有通孔且可堆疊的塑料發(fā)酵箱中(外尺寸：480×355×170mm，內(nèi)尺寸：445×320×165mm)，隨即轉入發(fā)酵室培養(yǎng)，置于溫度為25-28℃的發(fā)酵室中進行發(fā)酵5天。
3培養(yǎng)結果
待所述浸有混合液的布塊或所述浸有混合液的海綿塊的表面長滿綠僵菌分生孢子，將發(fā)酵產(chǎn)物置于陰涼通風處自然晾干即成粗粉劑(或在28-30℃烘箱中烘12-24h，含水率≤10％)，然后使用200目振動篩進行篩分，篩分時將振動篩的出料口封閉，待培養(yǎng)基上的孢子粉篩分完后打開出料口，制得綠僵菌高孢粉；隨機稱取制得的綠僵菌高孢粉劑5g，用0.03％吐溫-80溶液進行稀釋，血球計數(shù)板計數(shù)，所述綠僵菌高孢粉的平均含孢量為5.0×1010孢子/g。
實施例二
本實施例的綠僵菌高孢粉的制備方法，包括如下步驟：
1綠僵菌菌絲發(fā)酵液的培養(yǎng)
1.1菌種：綠僵菌(MaYTTR-04)菌株，福建省林業(yè)科學研究院森林保護研究所保存，為公知菌株。
1.2斜面菌種：預先將綠僵菌菌種用試管斜面在25±1℃條件下傳代培養(yǎng)、活化，當斜面表面長滿孢子時即可使用。斜面培養(yǎng)基為微生物培養(yǎng)中所通用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。
1.3液體培養(yǎng)基：按重量份玉米粉20份，米粉20份及白砂糖40份，混合均勻后，加入水1000份，得液體培養(yǎng)基，配制該液體培養(yǎng)基4L，每個500mL三角瓶中裝入200mL培養(yǎng)基，121℃下蒸汽高溫滅菌50min，冷卻后備用。
1.4接種：于無菌操作臺中，從菌種斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液體培養(yǎng)基中。
1.5搖床培養(yǎng)：25±1℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)72h，待長成粘稠菌絲體后即為綠僵菌菌絲發(fā)酵液。
2菌塊的接種培養(yǎng)
2.1營養(yǎng)液的制備方法：按每1000g水中加300g麥麩，煮沸10min過濾取濾液，所得濾液加水補至1000g得所述麥麩汁，將所述麥麩汁1000份、米粉20份和白砂糖40份混合得所述營養(yǎng)液，每個500mL的三角瓶裝入200mL所述營養(yǎng)液，于121℃下蒸汽高溫滅菌50min，冷卻后備用。
2.2布塊或海綿塊滅菌處理：將長度為6cm，寬度為4cm，高度為0.5cm的土工織物布塊或高密度吸水海綿塊裝入聚丙烯塑料袋(可耐濕熱滅菌)，于121℃條件下蒸汽高溫滅菌50min。
2.3接種：在預先進行空間滅菌的密閉房間內(nèi)，將所述綠僵菌菌絲發(fā)酵液與經(jīng)蒸汽高溫滅菌并冷卻室溫的營養(yǎng)液按1：3的比例混合、攪拌得混合液，即接種量為25％，將15塊上述經(jīng)蒸汽高溫滅菌處理的布塊或海綿塊放入100mL混合液，每5S翻動一次混合液中的布塊或海綿塊，60S后，待布塊或海綿塊吸收飽和后，取出得所述浸有混合液的布塊或所述浸有混合液的海綿塊，
2.4培養(yǎng)：將所述浸有混合液的布塊或所述浸有混合液的海綿塊裝入已經(jīng)過表面消毒的底部具有通孔且可堆疊的塑料發(fā)酵箱中(外尺寸：480×355×170mm，內(nèi)尺寸：445×320×165mm)，隨即轉入發(fā)酵室培養(yǎng)，置于溫度為25-28℃的發(fā)酵室中進行發(fā)酵6天。
3培養(yǎng)結果
待所述浸有混合液的布塊或所述浸有混合液的海綿塊的表面長滿綠僵菌分生孢子，將發(fā)酵產(chǎn)物置于陰涼通風處自然晾干即成粗粉劑(或在28-30℃烘箱中烘12-24h，含水率≤10％)，然后使用200目振動篩進行篩分，篩分時將振動篩的出料口封閉，待培養(yǎng)基上的孢子粉篩分完后打開出料口，制得綠僵菌高孢粉；隨機稱取制得的綠僵菌高孢粉劑5g，用0.03％吐溫-80溶液進行稀釋，血球計數(shù)板計數(shù)，所述綠僵菌高孢粉的平均含孢量為4.5×1010孢子/g。
實施例三
本實施例的綠僵菌高孢粉的制備方法，包括如下步驟：
1綠僵菌菌絲發(fā)酵液的培養(yǎng)
1.1菌種：綠僵菌(MaFZ-01)菌株，福建省林業(yè)科學研究院森林保護研究所保存，為公知菌株。
1.2斜面菌種：預先將綠僵菌菌種用試管斜面在25±1℃條件下傳代培養(yǎng)、活化，當斜面表面長滿孢子時即可使用。斜面培養(yǎng)基為微生物培養(yǎng)中所通用的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基。
1.3液體培養(yǎng)基：按重量份玉米粉20份，米粉20份及白砂糖40份，混合均勻后，加入水1000份，得液體培養(yǎng)基，配制該液體培養(yǎng)基3L，每個500mL三角瓶中裝入200mL培養(yǎng)基，121℃下蒸汽高溫滅菌40min，冷卻后備用。
1.4接種：于無菌操作臺中，從菌種斜面上挑取少量孢子及菌苔接入上述液體培養(yǎng)基中。
1.5搖床培養(yǎng)：25±1℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱中振蕩培養(yǎng)66h，待長成粘稠菌絲體后即為綠僵菌菌絲發(fā)酵液。
2菌塊的接種培養(yǎng)
2.1營養(yǎng)液的制備方法：按每1000g水中加300g麥麩，煮沸10min過濾取濾液，所得濾液加水補至1000g得所述麥麩汁，將所述麥麩汁1000份、米粉20份和白砂糖40份混合得所述營養(yǎng)液，每個500mL的三角瓶裝入200mL所述營養(yǎng)液，于121℃下蒸汽高溫滅菌40min，冷卻后備用。
2.2布塊或海綿塊滅菌處理：將長度為5cm，寬度為3cm，高度為0.4cm的土工織物布塊或高密度吸水海綿塊裝入聚丙烯塑料袋(可耐濕熱滅菌)，于121℃條件下蒸汽高溫滅菌40min。
2.3接種：在預先進行空間滅菌的密閉房間內(nèi)，將所述綠僵菌菌絲發(fā)酵液與經(jīng)蒸汽高溫滅菌并冷卻室溫的營養(yǎng)液按1：2的比例混合、攪拌得混合液，即接種量為33.3％，將12塊上述經(jīng)蒸汽高溫滅菌處理的布塊或海綿塊放入100mL混合液，每5S翻動一次混合液中的布塊或海綿塊，40S后，待布塊或海綿塊吸收飽和后，取出得所述浸有混合液的布塊或所述浸有混合液的海綿塊，
2.4培養(yǎng)：將所述浸有混合液的布塊或所述浸有混合液的海綿塊裝入已經(jīng)過表面消毒的底部具有通孔且可堆疊的塑料發(fā)酵箱中(外尺寸：480×355×170mm，內(nèi)尺寸：445×320×165mm)，隨即轉入發(fā)酵室培養(yǎng)，置于溫度為25-28℃的發(fā)酵室中進行發(fā)酵5.5天。
3培養(yǎng)結果
待所述浸有混合液的布塊或所述浸有混合液的海綿塊的表面長滿綠僵菌分生孢子，將發(fā)酵產(chǎn)物置于陰涼通風處自然晾干即成粗粉劑(或在30-35℃烘箱中烘12-24h，含水率≤10％)，然后使用200目振動篩進行篩分，篩分時將振動篩的出料口封閉，待培養(yǎng)基上的孢子粉篩分完后打開出料口，制得綠僵菌高孢粉；隨機稱取制得的綠僵菌高孢粉劑5g，用0.03％吐溫-80溶液進行稀釋，血球計數(shù)板計數(shù)，所述綠僵菌高孢粉的平均含孢量為4.8×1010孢子/g。
綜上所述，本發(fā)明提供的綠僵菌高孢粉的制備方法，通過采用浸有混合液的布塊或海綿塊作為綠僵菌生產(chǎn)和產(chǎn)孢的固定載體，與傳統(tǒng)大米、麥麩、玉米粉等營養(yǎng)基質(zhì)相比，干燥速度快、孢子易分離，且由于布塊或海綿塊的體積小，表面積大使得其接種量大(其接種量為傳統(tǒng)等體積培養(yǎng)基接種量的2.5-5倍)，平均發(fā)酵周期為5-6天，較傳統(tǒng)固體基質(zhì)培養(yǎng)的7-10天，大大縮短了培養(yǎng)時間，因此，大大提高了綠僵菌高孢粉的生產(chǎn)效率且產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定；由于綠僵菌分生孢子為氣生孢子，培養(yǎng)過程中，由于發(fā)酵容器中間層有通孔，保持中間層的通氣效果好，加之基質(zhì)高度≤3cm，有利于孢子產(chǎn)生，培養(yǎng)過程中整個發(fā)酵容器密閉，布塊或海綿塊內(nèi)的水分幾乎不會散失，所以無需調(diào)控環(huán)境濕度也能保證綠僵菌菌絲生長過程中所需的高濕度，簡化了生產(chǎn)工藝；采用布塊或海綿塊作為綠僵菌生產(chǎn)和產(chǎn)孢的固定載體，方便收集孢子時操作；在綠僵菌菌絲發(fā)酵液加入上述營養(yǎng)液，確保接種到布塊或海綿塊上的菌絲再生長和產(chǎn)孢的營養(yǎng)，同時增加布塊或海綿塊上的綠僵菌分生孢子的產(chǎn)量。
以上所述僅為本發(fā)明的實施例，并非因此限制本發(fā)明的專利范圍，凡是利用本發(fā)明說明書內(nèi)容所作的等同變換，或直接或間接運用在相關的技術領域，均同理包括在本發(fā)明的專利保護范圍內(nèi)。