本發(fā)明涉及一種工業(yè)化生產(chǎn)含有穿膜肽的寡肽-1，即PHPV基因蛋白的制備方法，屬生物工程領(lǐng)域。

發(fā)明背景

細胞穿膜肽(CPP)是具有穿透多種細胞膜功能的小分子多臺，能攜帶生物活性大分子物質(zhì)進入細胞。近些年發(fā)現(xiàn)的一些具有細胞穿透功能的短肽，少于30個氨基酸，即細胞穿膜肽CPPs，能夠有效地將蛋白質(zhì)、多肽、核酸片段等以多種方式導(dǎo)入哺乳動物細胞，其具有轉(zhuǎn)導(dǎo)效率高且不會造成細胞損傷的特點。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多種穿膜肽，它們共同具有如下特點：①具有凈正電荷性和兩親性；②穿膜轉(zhuǎn)運效率高；③可以導(dǎo)入近乎所有的細胞；④可以攜帶多種活性物質(zhì)進入細胞；⑤可靶向穿透細胞膜，達到滅活多種病毒且不造成細胞損傷。據(jù)文獻報道，WENDER P A，等(WENDE P A,ROTHBARD J B,JESSOP T C,et al.Oligocarbamate molecular transporters:Design,synthesis,and biological evaluation of a new class of transporters for drug delivery.JAme Chem Soc,2002,124(45):13382-13383)設(shè)計了一種含有穿膜肽、彈性蛋白類似多肽ELP(Val-Pro-Gly-Xaa-Gly)和一種衍生于細胞周期蛋白依賴激酶抑制劑P21的結(jié)合多肽，這種多肽能夠使SKOV-3卵巢癌細胞和Hela宮頸癌細胞的生長速率減慢而抑制它們的增殖。

連接肽是蛋白質(zhì)中連接各功能結(jié)構(gòu)域組分，使得組成該蛋白質(zhì)分子的各功能結(jié)構(gòu)域保持其活性構(gòu)象，發(fā)揮其各自的生物學(xué)功能，為各功能結(jié)構(gòu)域生物學(xué)活性的發(fā)揮提供協(xié)同、調(diào)節(jié)和變構(gòu)作用，避免因電荷/空間位障等因素導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子生物活性的喪失。通常把連接肽分為彈性、剛性、可切割性三種形式。連接肽一般具有多種二級結(jié)構(gòu)狀態(tài)來發(fā)揮其生物學(xué)功能，如α螺旋、β折疊鏈、卷曲、彎曲和轉(zhuǎn)角。

寡肽-1又名表皮細胞生長因子)是人體內(nèi)的一種活性物質(zhì)，由53個氨基組成的活性多肽。寡肽-1是美國生化學(xué)家Stanley Cohen博士于1962年最先在小鼠下頜腺的提取液中發(fā)現(xiàn)，并提出該因子有直接促進皮膚粘膜的修復(fù)和表皮細胞的生長，并能使衰老的細胞逆分化為年輕細胞，有促進膠原蛋白和彈力蛋白的合成，能促進肉芽組織再生，延緩細胞衰老、滋養(yǎng)女性生殖器官、淡化皺紋與色斑的作用，它是人類醫(yī)學(xué)與美學(xué)史上最偉大的發(fā)現(xiàn)之一。Stanley Cohen博士發(fā)現(xiàn)的EGF生長因子于1986年獲國際諾貝爾生理醫(yī)學(xué)獎。寡肽-1藉由刺激寡肽-1受體之酪氨酸磷酸化，達到修補增生肌膚表層細胞，對創(chuàng)傷、潰瘍等受損之表皮肌膚擁有絕佳之療效，對腔道粘膜有保濕、緊致、自凈的作用。其最大特點是能夠促進細胞的增殖逆分化，從而以新生的細胞代替衰老和死亡的細胞。最初的寡肽-1主要被運用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，以促進受損表皮的修復(fù)與再生，如治療燒傷、燙傷、潰瘍、促進傷口愈合、修復(fù)腸胃道、肝臟和眼角膜的損傷等，功效十分顯著。現(xiàn)代臨床早已將寡肽-1擴大應(yīng)用于醫(yī)療耗材、人體保健及抗衰老的化妝品領(lǐng)域。因而，寡肽-1的制備合成面臨全球市場需求量大，產(chǎn)品資源十分稀缺的問題，為了解決全球市場對寡肽-1EGF敷料的需求供給，我公司聯(lián)合美國哈佛大學(xué)魏博士、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)于博士、中華生物醫(yī)藥研究院、廣東醫(yī)保藥業(yè)有限公司共同研究，首先采用WENDER P A等公開的穿膜肽ELP結(jié)構(gòu)，構(gòu)建了一種用酵母菌表達含ELP的寡肽-1EGF制備方法，其所制備獲得的高純度融合新蛋白，即，PHPV基因蛋白，不僅具有穿膜肽ELP與寡肽的多效功能，而且其交聯(lián)融合后的新蛋白表面的負電荷(陰離子)C端與人乳頭瘤病毒HPV顆粒上的N端正電荷(陽離子)相互絡(luò)合，通過其表面所帶正電荷的N端與中間的疏水區(qū)及含有肽酶的識別區(qū)位點的C端負電荷相結(jié)合，將膜轉(zhuǎn)位信號與核定位信號的NLS偶聯(lián)，從而阻斷人乳頭瘤病毒侵入宿主細胞內(nèi)，再通過細胞膜的相互作用而穿透細胞膜這一天然屏障，起到破壞病毒胞膜外殼來滅活細菌病毒，達到預(yù)防宮頸癌前病變并實現(xiàn)治療HPV感染的目的。目前世界上尚未有含穿膜肽的寡肽-1融合新蛋白在大腸桿菌中的基因工程工業(yè)化生產(chǎn)方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是解決工業(yè)用基因工程大腸桿菌生產(chǎn)含穿膜肽的寡肽-1(EGF)的融合新蛋白的方法。

為了達到上述目的，本發(fā)明提供了如下發(fā)明構(gòu)思。

本發(fā)明首先提供一種包含有穿膜肽ELP的寡肽-1融合新蛋白，即PHPV基因蛋白。

其中，穿膜肽ELP位于寡肽-1的C-端；

優(yōu)選地，穿膜肽ELP通過連接肽與寡肽-1的C-端相連；

其中，連接肽優(yōu)選卷曲連接肽，包括(GGGGS)N，其中N是大于或等于1的整數(shù)；

優(yōu)選地，穿膜肽ELP緊鄰寡肽-1的C-端；

其中，穿膜肽ELP的序列為：Val-Pro-Gly-Xaa-Gly；

優(yōu)選地，Xaa為S、E、V、A、V中之一，優(yōu)選為A。

本發(fā)明還提供了一種靶向選擇性給藥組合物，該組合物包括穿膜肽ELP和寡肽-1的融合蛋白；

任選的，該組合物還包括賦形劑、穩(wěn)定劑或稀釋劑。

本發(fā)明還涉及一種工業(yè)化生產(chǎn)含有穿膜肽ELP的寡肽-1的融合蛋白的制備方法，其包括如下步驟：

(1)種子液制備；

(2)大腸桿菌發(fā)酵；

(3)菌體收集破碎；

(4)含穿膜肽ELP的寡肽-1融合蛋白純化；

(5)復(fù)配靶向選擇性給藥組合物。

其中，所述菌體收集破碎步驟中采用的裂解液為20mM三羥甲基氨基甲烷、8M尿素所組成的緩沖液；

其中，所述融合蛋白的純化是采用緩沖液洗滌、離子交換、凝膠層析的組合方式。

本發(fā)明中所使用的穿膜肽ELP采用WENDE P A等(WENDE P A,ROTHBARD J B,JESSOP T C,et al.Oligocarbamate molecular trans porters:Design,synthesis,and biological evaluation of a new cla ss of transporters for drug delivery.JAme Chem Soc,2002,124(45):13382-13383)公開的方法設(shè)計獲得，并結(jié)合寡肽-1多肽片段的特點，對ELP第4位氨基酸殘基的種類進行了驗證選擇，發(fā)現(xiàn)當(dāng)Xaa為S、E、V、A、V時，或得的融合蛋白具有較強的靶向性，特別是當(dāng)Xaa為A時，其獲得的融合蛋白的效能最優(yōu)，該融合蛋白含有較多的正電荷的肽片段，利用正負電荷非特異性相互作用的原理與細胞膜結(jié)合，打開皮膚細胞膜從而將目的蛋白靶向?qū)肫つw基底層受體。

具體實施方式

以下結(jié)合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例近用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建議的條件。比例和百分比基于重量，除非特別說明。

實施例1：含穿膜肽ELP的寡肽-1(EGF)的融合蛋白制備

⑴種子液制備：

從-70℃保存的菌種管中挑取單菌落接入5-15ml種子培養(yǎng)基中，同時加入氨芐青霉素，使其在培養(yǎng)基中的濃度達到50-200mg/ml，22—32℃，150—250rpm搖床培養(yǎng)8—12小時，按1—10％接種量將前面的培養(yǎng)液再次接入種子培養(yǎng)基中，同時加入氨芐青霉素，使其在27—32℃，150—250rpm搖床培養(yǎng)8—12小時。

(2)大腸桿菌發(fā)酵

在無菌條件下，將上述培養(yǎng)好的種子液再按30ml接種量接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中；發(fā)酵培養(yǎng)基成分(g/L)：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，氨芐青霉素0.1g用去離子水溶解定容，高壓滅菌；發(fā)酵條件：溫度30-32℃，發(fā)酵至OD600達到0.8左右加入誘導(dǎo)劑100mM的異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)0.1％誘導(dǎo)，3—4小時后收集菌體。

(3)菌體收集破碎：

將發(fā)酵液以6000—12000rpm的速度用離心機離心20—30min，棄上清液保留沉淀。取沉淀，用磷酸緩沖液(pH8.0)沖洗1—2次，用5倍Tris-Hcl緩沖液溶解，1800w超聲處理破碎，再用冷凍離心機將緩沖液在2—18℃條件下以6000—12000rpm的速度離心棄上清液，取沉淀用15—45倍裂解液溶解，所用裂解液為20mM三羥甲基氨基甲烷、8M尿素所組成的緩沖液，在2—18℃條件下離心30min收集上清液。

(4)含穿膜肽寡肽-1(EGF)融合新蛋白純化

將上清液用層析系統(tǒng)以1.5—8.5ml/min速度加入source 30S擴張床中，用80mMTris緩沖液速度洗滌至波長為280nm時紫外吸收峰值為零，再用含1M氯化鈉80mMTris緩沖液以13％比例洗脫，收集含穿膜肽寡肽-1(EGF)融合新蛋白的洗脫峰。

用層析系統(tǒng)將15—30ml上面洗脫液以4—8ml/min的速度加到Superdex75凝膠層析柱中，然后將15mM精氨酸緩沖液以4—8ml/min的速度洗脫直至出峰完畢，用紫外檢測檢測儀在波長280nm下進行檢測，收集保留吸收峰，收集體積為300—500ml，將收集液于-20℃冷凍保存。

(5)復(fù)配組合物

將含有穿膜肽和寡肽-1的冷凍原液復(fù)溶后，添加賦形劑甘露醇，穩(wěn)定劑精氨酸、海藻糖，稀釋劑去離子水，復(fù)配組合物。所述組合物是醫(yī)療器械組合物、保健品組合物、化妝品組合物。

實施例二：含穿膜肽ELP的寡肽-1(EGF)的融合蛋白制備

⑴大腸桿菌擴培發(fā)酵：

從-70℃保存的菌種管中挑取單菌落接入10ml種子培養(yǎng)基中，同時加入氨芐青霉素，使其在培養(yǎng)基中的濃度達到100mg/ml，30℃，200rpm搖床培養(yǎng)10小時，按5％接種量將前面的培養(yǎng)液再次接入種子培養(yǎng)基中，同時加入氨芐青霉素，使其在100mg/ml，32℃，200rpm搖床培養(yǎng)10小時，再按5％接種量將活化的種子液加入到發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)基成分(g/L)：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化鈉10g，氨芐青霉素0.1g用去離子水溶解定容，高壓滅菌；35℃，200rpm，采用Tris-Hcl緩沖液使PH值維持9.0，培養(yǎng)10小時，然后將發(fā)酵溫度提高到40℃誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)4小時。穿膜肽的寡肽-1(EGF)表達于菌種中。

⑵菌體收集破碎：

用冷凍離心機將發(fā)酵液與4℃條件下以10000rpm的速度離心30min，棄上清液保留沉淀于4℃條件下保存?zhèn)溆谩Ｈ∵m量沉淀，用10倍量Tris-Hcl緩沖液溶解，900w超聲處理25個循環(huán)，每個循環(huán)35min，再用冷凍離心機將緩沖液與4℃條件下以10000rpm的速度離心

30min，棄上清液，取沉淀用20倍裂解液溶解，所用裂解液為20mM三羥甲基氨基甲烷、8M尿素所組成的緩沖液，10000rpm的速度離心30min，收集上清液。

(3)含穿膜肽寡肽-1(EGF)融合新蛋白純化

用層析系統(tǒng)將200ml的該上清液以3ml/min速度加入source 30S擴張床中，用80mMTris緩沖液以相同速度洗滌至波長為280nm時紫外吸收峰值為零，再用含1M氯化鈉80mMTris緩沖液以7％比例洗脫，收集含穿膜肽寡肽-1(EGF)融合新蛋白的洗脫峰。

(4)凝膠分離：

用層析系統(tǒng)將25ml上面洗脫液以6.5ml/min的速度加到Superdex75凝膠層析柱中，然后將15mM精氨酸緩沖液以6.5ml/min的速度洗脫直至出峰完畢，用紫外檢測檢測儀在波長280nm下進行檢測，收集保留吸收峰，收集體積為350ml，將收集液于-20℃冷凍保存。

(5)復(fù)配組合物

將含有穿膜肽和寡肽-1的冷凍原液復(fù)溶后，添加賦形劑甘露醇，穩(wěn)定劑精氨酸、海藻糖，稀釋劑去離子水，復(fù)配組合物。所述組合物是醫(yī)療器械組合物、保健品組合物、化妝品組合物。

實施例3：含穿膜肽ELP的寡肽-1融合蛋白的穿膜活性驗證

利用上述方法制得的含穿膜肽的寡肽-1即：PHPV基因蛋白，創(chuàng)新點是：(1)具有發(fā)酵液中產(chǎn)物濃度高，大于100mg/L，改變了菌種表達含穿膜肽的寡肽的重組方法、使產(chǎn)品表達濃度較以往提高了1-2倍；(2)優(yōu)化了制備工藝：使工藝提取技術(shù)更簡單(只需要2步層析操作，較之前工藝簡化一半)；(3)操作成本更低、純度更高(97％以上)。本發(fā)明是一個較為成熟的工業(yè)化創(chuàng)新發(fā)酵生產(chǎn)工藝，經(jīng)濟效益十分顯著。

所有上述的首要實施這一知識產(chǎn)權(quán)，并沒有設(shè)定限制其他形式的實施這種新產(chǎn)品和/或新方法。本領(lǐng)域技術(shù)人員將利用這一重要信息，上述內(nèi)容修改，以實現(xiàn)類似的執(zhí)行情況。但是，所有修改或改造基于本發(fā)明新產(chǎn)品屬于保留的權(quán)利。