本發(fā)明涉及生物工程領(lǐng)域的蛋白酶定向進化，特別涉及通過構(gòu)建高通量的篩選平臺，進化得到了金黃色葡萄球菌分選酶A的突變體，其可以高效的催化LPXTG與α-Gly或α-Gly_n之間的連接反應(yīng)。

背景技術(shù)：

金黃色葡萄球菌分選酶A(Sa-SrtA)是革蘭氏陽性菌中普遍存在的一類半胱氨酸轉(zhuǎn)肽酶，典型的，其可以催化底物LPXTG(X代表任意氨基酸)與α-Gly_n(寡聚甘氨酸)之間的連接反應(yīng)，這一反應(yīng)因此被命名為分選酶介導(dǎo)的連接反應(yīng)(Sortase-Mediated Ligation，SML)。同時，分選酶A還可以催化LPXTG與α-Gly之間的反應(yīng)，然而，相對于其催化α-Gly_n的反應(yīng)，反應(yīng)活性更低。

利用分選酶介導(dǎo)的連接反應(yīng)，可以實現(xiàn)各種蛋白質(zhì)的定點標記與偶合，進而應(yīng)用于生命科學的基礎(chǔ)研究以及制藥行業(yè)。然而，由于野生型分選酶A催化效率較低，基于高通量篩選的定向進化以及理性設(shè)計的方法提升分選酶A的活性成為一種必要。前人的研究中也發(fā)現(xiàn)了5個點突變P94R/D160N/D165A/K190E/K196T(Chen I.et al.ProcNatl AcadSci USA 2011,108,11399-11404)，可以在一定程度上提升其活性。

野生型金黃色葡萄球菌分選酶A是一個包含206個氨基酸殘基的蛋白酶，是在前人的研究中發(fā)現(xiàn)，截掉氮端25個氨基酸殘基的截短體可以在大腸桿菌中高水平、可溶性的表達(Ton-That H.et al.ProcNatl AcadSci USA 1999,96,12424–12429)，因此在研究中分選酶A基本上都以這種截短體的形式存在，本發(fā)明涉及的高效突變體描述的也是這種截短體的突變體。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的技術(shù)目的是提供催化LPXTG與α-Gly反應(yīng)活性更高的金黃色葡萄球菌分選酶A突變體，同時這些突變體也可以進一步提升LPXTG與α-Gly_n之間反應(yīng)的活性。本發(fā)明構(gòu)建了基于兩個熒光蛋白的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的篩選平臺，以野生型金黃色葡萄球菌分選酶A及其P94R/D160N/D165A/K190E/K196T突變體分別作為出發(fā)分選酶1和2，分別進行了定向進化和理性設(shè)計，最終構(gòu)建得到活性更高的分選酶A突變體，使其可以更好的催化LPXTG與α-Gly或α-Gly_n之間的連接反應(yīng)。

本發(fā)明得到的分選酶A突變體既可以提升已知分選酶A催化LPXTG與非典型底物α-Gly之間反應(yīng)的效率，同時又可以提升其催化LPXTG與典型底物α-Gly_n之間反應(yīng)的效率。

本發(fā)明所獲得的分選酶A突變體活性的提高，以測定的動力學常數(shù)K_cat，K_mLPETG和K_mGGG或K_mGAG進行表征，其中，K_cat代表反應(yīng)的速率，K_mLPETG、K_mGGG和K_mGAG分別代表酶對底物LPETG、GGG和GAG的識別效率。

具體的，本發(fā)明所提供的分選酶A突變體包含下述突變中的一種或多種：D124G、Y187L、E189R和F200L。

本發(fā)明提供的分選酶A突變體還可以包含下述突變中的一種或多種：P94R、D160N、D165A、K190E和K196T。

本發(fā)明優(yōu)選的分選酶A突變體是下述突變體之一：

突變體1：P94R/D124G/D160N/D165A/K190E/K196T

突變體2：P94R/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T

突變體3：P94R/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T

突變體4：D124G/Y187L/E189R/F200L

突變體5：P94R/D124G/D160N/D165A/Y187L/E189R/K190E/K196T/F200L

下面的表1給出了野生型分選酶A已知突變體P94R/D160N/D165A/K190E/K196T(出發(fā)分選酶2)及突變體4和5催化LPXTG與α-Gly的連接反應(yīng)的動力學常數(shù)K_cat，K_mLPETG和K_mGAG；表2給出了野生型分選酶A、出發(fā)分選酶2及上述五種突變體催化LPXTG與α-Gly_n的連接反應(yīng)的動力學常數(shù)K_cat，K_mLPETG和K_mGGG，以K_cat/K_mLPETG指示催化效率，可以看出各個突變體的效率都有大幅度的提升。

表1

表2

本發(fā)明通過定向進化和理性設(shè)計相結(jié)合的方法構(gòu)建得到催化活性提高的分選酶A突變體，由野生型金黃色葡萄球菌分選酶A的基因(GenBank登錄號：BA000018，ORFID:SA2316)及一種已知突變體(P94R/D160N/D165A/K190E/K196T)的基因出發(fā)，運用易錯PCR和位點飽和突變得到分選酶A突變文庫，再利用構(gòu)建的基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的篩選平臺，經(jīng)過多輪的篩選以及突變的整合得到一系列進化的分選酶A突變體，在突變的氨基酸序列中包含了D124G，Y187L，E189R，F(xiàn)200L和已知突變中的一個或多個突變。

本發(fā)明實施例在原核表達系統(tǒng)中表達的分選酶A及其突變體是其截去氮端25個氨基酸殘基的截短體形式，其中：包含有6個突變位點的分選酶A突變體1的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所示；包含有7個突變位點的分選酶A突變體2的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示；包含有8個突變位點的分選酶A突變體3的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.3所示；包含有4個突變位點的分選酶A突變體4的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.4所示；包含有9個突變位點的分選酶A突變體5的氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.5所示。序列表中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5均各自包含181個氨基酸殘基，對應(yīng)于野生型金黃色葡萄球菌分選酶A的第26至206位氨基酸殘基序列，上述突變位點也是相對于全長野生型金黃色葡萄球菌分選酶A而言。

序列表中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.5所示氨基酸序列對應(yīng)的基因序列依次可以分別如SEQ ID NO.6至SEQ ID NO.10所示，當然，根據(jù)密碼子的簡并性，也可以是利用同一氨基酸的不同密碼子而獲得的編碼相同蛋白質(zhì)的其他核苷酸序列。

含有這些基因序列的載體、細胞和宿主菌也在本發(fā)明的保護范圍內(nèi)。

本發(fā)明利用構(gòu)建的篩選平臺，對通過易錯PCR及位點飽和突變的方法構(gòu)建的金黃色葡萄球菌分選酶A的基因突變文庫進行了高通量篩選，得到了催化效率有很大提高的突變體，其催化LPXTG與典型底物α-Gly_n以及非典型底物α-Gly的效率都有了很大提升。

附圖說明

圖1顯示了基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理的分選酶A篩選平臺的構(gòu)建原理。

圖2顯示了篩選平臺指示分選酶A活性的效果。

圖3顯示了位點突變對于分選酶A活性的影響。

圖4顯示了野生型及突變體分選酶A催化LPXTG與α-Gly反應(yīng)的動力學常數(shù)K_cat，K_mLPETG與K_mGAG。

圖5顯示了野生型及突變體分選酶A催化LPXTG與α-Gly_n反應(yīng)的動力學常數(shù)K_cat與K_mLPETG。

圖6顯示了野生型及突變體分選酶A催化LPXTG與α-Gly_n反應(yīng)的動力學常數(shù)K_mGGG。

具體實施方式

實施例中涉及的培養(yǎng)基配方如下：

LB液體培養(yǎng)基：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.4。

實施例1、利用易錯PCR構(gòu)建金黃色葡萄球菌分選酶A隨機突變文庫

利用易錯PCR在體外向金黃色葡萄球菌分選酶A基因引入核苷酸突變，易錯PCR具體條件如下：

PCR模板是包含野生型金黃色葡萄球菌分選酶A基因的質(zhì)粒，本質(zhì)粒通過將野生型分選酶A的基因(Ton-That H.et al.ProcNatl AcadSci USA 1999,96,12424–12429)出發(fā)，利用亞克隆將第26位到206位的氨基酸序列對應(yīng)的核苷酸序列克隆入pet28a載體的NdeI和XhoI酶切位點之間得到。

上游引物：5’-GGAATTCCATATGAAACCACATATCGATAATTATC-3’(SEQ ID NO.11)

下游引物：5’-GGTAGGCACTCGAGTTATTTGACTTCTGTAGCTAC-3’(SEQ ID NO.12)

PCR擴增條件：95℃5min；95℃1min，55℃1min，72℃1min，30個循環(huán)；72℃10min。

易錯PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化，限制性內(nèi)切酶NdeI和XhoI分別對PCR產(chǎn)物和pet28a載體進行酶切，連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10B，涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)箱生長12小時后，收取全部克隆，稀釋至液體LB培養(yǎng)基中繼續(xù)生長，12小時后提取質(zhì)粒，得到突變文庫。將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，37℃培養(yǎng)箱生長12小時后，得到突變文庫的表達菌，待用。

實施例2、點突變PCR構(gòu)建金黃色葡萄球菌分選酶A位點飽和突變文庫

利用點突變PCR的方法向分選酶A的P94R/D160N/D165A/K190E/K196T突變體的兩個位點Tyr187和Glu189引入飽和突變，PCR條件如下：

PCR模板是出發(fā)分選酶2的基因，通過將實施例1中含有野生型分選酶A基因的pet28a質(zhì)粒突變所得到。

上游引物:5’-CATTAATTACTTGTGATGATNNKAATNNKGAGACAGGCGTTTGGG-3’(SEQ ID NO.13)

下游引物:5’-CCCAAACGCCTGTCTCMNNATTMNNATCATCACAAGTAATTAATG-3’(SEQ ID NO.14)

上述引物中，N代表A、C、G、T四種堿基中的一種，K代表G或T，M代表A或C。

PCR擴增條件：95℃5min；95℃45s，55℃45s，72℃7min，23個循環(huán)；72℃10min。

點突變PCR產(chǎn)物經(jīng)DpnI酶切，轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DMT菌株中，涂布于含有100μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃培養(yǎng)箱生長12小時后，收取全部克隆，稀釋至液體LB培養(yǎng)基中繼續(xù)生長，12小時后提取質(zhì)粒，得到雙位點的飽和突變文庫。將得到的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)，37℃培養(yǎng)箱生長12小時后，得到飽和突變文庫的表達菌，待用。

實施例3、基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的篩選系統(tǒng)構(gòu)建及驗證

利用亞克隆的方法分別在pet28a載體上融合表達eGFP-LPETG和G-cpV的熒光蛋白，利用6×His標簽進行純化，純化得到的蛋白進行分選酶介導(dǎo)的連接反應(yīng)，如圖1所示，EGFP和cpV蛋白是合適的熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)供體和受體，當分選酶A介導(dǎo)兩個蛋白之間的連接反應(yīng)時，由于兩個蛋白距離的拉近，兩個蛋白之間的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率提升，分選酶活性越高，則熒光功能能量轉(zhuǎn)移效率越高。利用野生型分選酶A和出發(fā)分選酶2對篩選平臺進行驗證，證明了分選酶A活性與熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率成正比，如圖2所示。

實施例4、高催化活性分選酶A突變體的篩選

挑取實施例1和2構(gòu)建的基因文庫，在含有1ml LB(含100μg/ml卡那霉素)培養(yǎng)基的深孔96孔板中，37℃搖床中過夜培養(yǎng)，1:100轉(zhuǎn)接到新的深孔96孔板中，37℃搖床培養(yǎng)至OD₆₀₀達0.6左右，加入1mM IPTG誘導(dǎo)，37℃繼續(xù)培養(yǎng)3小時。4700rmp離心10分鐘，棄上清，每孔加入200μL裂解液(30mM Tris，150mM NaCl，5mM CaCl₂，1％Triton X-100，0.15mg/mL溶菌酶)，37℃搖床裂解2小時，離心去除細胞碎片，得到細胞裂解液。200μL反應(yīng)體系中加入50μL細胞裂解液，100μM eGFP-LPETG-His6，200μM G-cpV，37℃反應(yīng)2小時。利用酶標儀，435nm激發(fā)，收取475nm和525nm熒光，通過525nm和475nm熒光強度比值代表不同的熒光共振能量轉(zhuǎn)移效率，從而得到不同催化效率的突變體。如圖3所示，本發(fā)明得到了四個可以提升分選酶A活性的突變，包含D124G,Y187L,E189R和F200L。將這四個突變中的一個或多個突變與出發(fā)分選酶2的五個突變進行整合，得到最終的突變體。

實施例5、金黃色葡萄球菌分選酶A活性測定

金黃色葡萄球菌分選酶A活性測定依據(jù)文獻的方法(Kruger R.G.；Dostal P；McCafferty D.G.Anal Biochem 2004,326:42–48)，不同的是，測定LPXTG與α-Gly_n反應(yīng)的動力學常數(shù)，以GGG作為反應(yīng)底物；測定LPXTG與α-Gly反應(yīng)的動力學常數(shù)，以GAG作為反應(yīng)底物。如圖4所示，以Abz-LPETGK(Dnp)-CONH₂和GAG作為底物進行測定，突變體分選酶A催化LPETG與α-Gly反應(yīng)的活性(K_cat/K_mLPETG)相對于野生型得到了約7～79倍不同的提升，最好的突變體相對于出發(fā)分選酶2也有大于5倍的提升，同時其對于GAG的識別(K_mGGG)也有1.3倍左右的提升。如圖5和6所示，以Abz-LPETGK(Dnp)-CONH₂和GGG作為底物進行測定，可以看出相對于野生型分選酶A，突變體分選酶A催化LPETG與α-Gly_n反應(yīng)的活性(K_cat/K_mLPETG)相對于野生型得到了20～245倍不同的提升，最好的突變體相對于出發(fā)分選酶2也有近11倍的提升，同時其對于GGG的識別(K_mGGG)也有2倍左右的提升。