專利名稱：溶葡萄球菌復(fù)合酶洗液及制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及消毒類生物制劑，具體涉及一種溶葡萄球菌復(fù)合酶洗液(高科復(fù)合酶洗液)及制備方法。
洗液是一類作用于皮膚粘膜及外陰的消毒保健洗滌用品，根據(jù)其配方的不同，其對(duì)引起感染或病原革蘭氏陽性或陰性菌，真菌、酵母及病毒有不同程度的殺滅及抑制作用?，F(xiàn)用的洗液有以下幾類(1)普通化學(xué)類洗液僅屬于普通洗滌用品，pH值為弱酸性，能起到一定的清潔作用，但對(duì)病原菌無殺滅作用。(2)氧化蛋白類洗液是通過氧化劑的氧化作用把病原體殺死，如碘。但其對(duì)粘膜有一定程度的刺激和損傷。(3)中藥類洗液其主要功能成分為傳統(tǒng)中藥，其作用機(jī)理為清熱燥濕、殺蟲止癢。如蛇床子、黃柏、苦參等。對(duì)粘膜無刺激，但見效較慢，療程較長。
本發(fā)明的目的在于克服上述不足之處，提供一種無毒副作用，無刺激，不易產(chǎn)生耐藥性，高效的生物型洗液。
本發(fā)明公開了一種溶葡萄球菌復(fù)合酶洗液(高科復(fù)合酶洗液)，該洗液是由溶葡萄球菌酶(Lysostaphin)0.001～0.002％和溶菌酶(Lysozyme)0.02～0.05％、洗必泰0.1-0.2％作為主要成份與甘油(glycerol)0.2～0.3％和蒸餾水作為輔料組成100％的組成。
由于溶葡萄球菌復(fù)合酶中的一種成分溶葡萄球菌酶是一種革蘭氏陽性菌的溶菌素。組成該類革蘭氏陽性菌(例如金黃色葡萄球菌)細(xì)胞壁肽聚糖的四肽側(cè)鏈的氨基酸，依次為L-丙氨酸，D-谷氨酸，L-賴氨酸，D-丙氨酸；而首位的L-丙氨酸通過一個(gè)酰胺鍵與胞壁酸相連，該聚糖鏈四肽側(cè)鏈第3位的L-賴氨酸，通過五肽(五個(gè)甘氨酸)交聯(lián)橋聯(lián)結(jié)到相鄰聚糖鏈四肽側(cè)鏈D-丙氨酸羧基上。由此縱橫交叉，左右聯(lián)結(jié)構(gòu)成十分堅(jiān)韌的三維立體多孔結(jié)構(gòu)，并聚合成較厚的肽聚糖層。溶葡萄球菌酶可切斷肽聚糖中的Gly-Gly鍵，而高科復(fù)合溶菌酶中另一種生物酶可切斷N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡萄糖胺之間的鍵，從而使殺菌活性更強(qiáng)，達(dá)到溶解并殺死細(xì)菌的目的，并可避免細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。
由于溶葡萄球菌復(fù)合酶的殺菌機(jī)理，使其不同于一般抗生素，常用抗生素是抑制細(xì)菌生長，而該酶則是裂解細(xì)菌殺死細(xì)菌。上海市華山醫(yī)院抗生素研究所、第二軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院檢驗(yàn)科、上海市第六人民醫(yī)院檢驗(yàn)科、上海市第九人民醫(yī)院檢驗(yàn)科等單位曾將臨床各科收集到的400多株細(xì)菌進(jìn)行了高科復(fù)合溶菌酶的抑殺菌實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明溶葡萄球菌復(fù)合酶對(duì)臨床上常見的金黃色葡萄球菌，表皮葡萄球菌、肺炎雙球菌、D群腸球菌、四聯(lián)球菌、產(chǎn)單核李斯特菌、鏈球菌以及胃幽門螺旋桿菌、大腸桿菌、綠膿桿菌等均有明顯的抑殺作用。
經(jīng)上海市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)證明溶葡萄球菌復(fù)合酶洗液對(duì)淋病奈瑟菌有很強(qiáng)的殺滅作用。又經(jīng)上海市黃浦區(qū)疾病預(yù)防控制中心在復(fù)旦大學(xué)婦產(chǎn)科醫(yī)院的60例現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)的結(jié)果證明，溶葡萄球菌復(fù)合酶洗液對(duì)會(huì)陰部作用1分鐘，對(duì)細(xì)菌的殺滅率達(dá)90％以上。
實(shí)驗(yàn)還證明溶葡萄球菌酶對(duì)耐藥性菌株，如目前醫(yī)學(xué)臨床上最感棘手的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌，耐藥性肺炎雙球菌、嗜麥芽窄食單孢菌的效果更優(yōu)于常用抗生素。
本發(fā)明的另一目的是提供了上述溶葡萄球菌復(fù)合酶洗液的制備方法，該方法是在無菌室或超凈工作臺(tái)中，按處方量將溶葡萄球菌酶(從美國Sigma公司購買，)，溶菌酶，洗必泰按比例依次加入潔凈的玻璃或不銹鋼盛具中，輕輕攪拌，充分混和均勻后，再加入所示比例的甘油和蒸餾水，充分混勻，灌裝于塑料或玻璃瓶中，入庫，室溫保存即可。
本發(fā)明的溶葡萄球菌復(fù)合酶洗液(高科復(fù)合酶洗液)經(jīng)上海市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院檢測(cè)結(jié)果如下I PH測(cè)定試驗(yàn)一、材料消毒劑高科復(fù)合酶洗液PH測(cè)定儀PYS-3C型數(shù)字酸度計(jì)。二、方法用PHS-3C型數(shù)字酸度計(jì)測(cè)定該樣品原液，測(cè)定三份樣品，每份重復(fù)測(cè)定3次，取其平均值。三、結(jié)果PH值測(cè)定結(jié)果
四、結(jié)論該樣品的PH值平均為6.90。II醋酸洗必泰含量測(cè)定一、材料1、消毒劑高科復(fù)合酶洗液2、試劑0.0956mol/L高氯本標(biāo)準(zhǔn)溶液丙酮冰醋酸甲基橙的飽和丙酮溶液二、方法取醋酸洗必泰30.0ml，于100ml碘量瓶中加丙酮30ml與冰醋酸2ml，振搖使溶解后，加甲基橙的飽和丙酮溶液1.0ml，用高氯酸標(biāo)準(zhǔn)液滴定。待溶液顯橙色，記錄高氯酸溶液用量。同時(shí)以不含醋酸洗必泰的丙酮與冰醋酸溶液重復(fù)上述操作(空白對(duì)照)。重復(fù)測(cè)三次，取其平均值進(jìn)行以下計(jì)算。
三、結(jié)果
四、結(jié)論該樣品的醋酸洗必泰含量為0.1047％。III穩(wěn)定性試驗(yàn)(有效成份含量)一、材料1、消毒劑高科復(fù)合酶洗液2、試劑0.0956mol/L高氯酸標(biāo)準(zhǔn)溶液丙酮冰醋酸甲基橙的飽和丙酮溶液二、方法取消毒劑三份置37℃溫箱(相對(duì)濕度＞75％)三個(gè)月于放置前、后分別測(cè)定醋酸洗必泰含量。(方法同醋酸洗必泰含量測(cè)定)，每份樣品重復(fù)3次，取其平均其，計(jì)算下降率。三、結(jié)果穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果
注試驗(yàn)條件為37℃放置三個(gè)月。四、結(jié)論本樣品經(jīng)37℃放置三個(gè)月，醋酸洗必泰含量平均下降率為4.78％。IV大腸桿菌載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)一、材料1、菌株大腸桿菌(8099)2、消毒劑高科復(fù)合酶洗液3、中和劑0.5％硫代硫酸鈉、2％吐溫-80、0.5％卵磷脂的PBS。二、方法1、大腸桿菌懸液制備打開大腸桿菌(8099)凍干菌種管，經(jīng)分離培養(yǎng)后，取4-14代經(jīng)37℃培養(yǎng)24h的新鮮斜面培養(yǎng)物，用5mlPBS洗下菌苔，然后用含1％蛋白胨的PBS作適當(dāng)稀釋后備用。2、菌片制備經(jīng)脫脂、清洗的1×1cm滅菌布片滴加0.02ml適當(dāng)菌量的菌懸液，37℃干燥30min后備用。3、載體定量法中和劑鑒定試驗(yàn)試驗(yàn)用消毒液濃度為原液、中和劑為含0.5％硫代硫酸鈉、2％吐溫-80、0.5％卵磷脂的PBS，中和劑試驗(yàn)分8組進(jìn)行。(1)5.0ml消毒液加1片染菌片，作用1min，取出菌片移入5.0mlPBS中。(2)5.0ml消毒液加1片染菌片作用1min，取出菌片移入5.0ml中和劑中，作用10min。(3)5.0ml中和劑加1片染菌片，作用10min。取出菌片移入5.0ml中和劑中，用中和劑稀釋后接種。(4)5.0ml中和產(chǎn)物溶液(將浸有消毒劑的載體置5.0ml中和劑內(nèi)作用10min)加染菌片1片，作用10min。取出菌片移入5.0ml中和產(chǎn)物中，以中和產(chǎn)物溶液稀釋后接種。(5)5.0mlPBS加入1片染菌片，作用10分鐘，取出菌片移入5.0mlPBS中，以PBS稀釋后接種。(6)(7)(8)組分別為PBS、中和劑、培養(yǎng)基陰性對(duì)照組。37℃培養(yǎng)48h觀察結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)溫度20℃±2℃(試驗(yàn)前預(yù)溫5min)。4、載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)分別取三個(gè)不同濃度的消毒液，以每片5.0ml的量注入滅菌平皿中，于20℃±2℃)水浴5min后，加入大腸桿菌菌片，作用至規(guī)定時(shí)間時(shí)，分別取出菌片移入5.0ml中和劑中，作用10min后充分振搖洗下菌片上細(xì)菌，吸取0.5ml洗液進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)37℃培養(yǎng)48h觀察結(jié)果，同時(shí)以PBS代替消毒劑作陽性對(duì)照組。接種中和劑、PBS并以同批培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算殺滅率與平均殺滅率。三、結(jié)果1、載體定量法中和劑鑒定試驗(yàn)表1 中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果
2、載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)(布片載體)表2 對(duì)大腸桿菌的殺滅效果
注陽性對(duì)照組平均菌數(shù)為1.30×106cfu/片(1.28-1.33×106cfu/片)陰性對(duì)照組中和劑、PBS、培養(yǎng)基無細(xì)胞生長。四、結(jié)論1、經(jīng)3次重復(fù)中和劑鑒定試驗(yàn)表明，含0.5％硫代硫酸鈉、2％吐溫-80、0.5％卵磷脂的PBS可中和試驗(yàn)濃度的消毒劑對(duì)對(duì)大腸桿菌的殘余作用，且中和產(chǎn)物對(duì)受試菌的生長無影響。2、經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)，該樣品原液的消毒液作用10分鐘對(duì)大腸桿菌的殺滅率為99.98％。V金黃色葡萄球菌載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)一、材料1、菌株金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)2、消毒劑高科復(fù)合酶洗液3、中和劑0.5％硫代硫酸鈉、2％吐溫-80、0.5％卵磷脂的PBS。二、方法1、金黃色葡萄球菌懸液制備打開金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)凍干菌種管，經(jīng)分離培養(yǎng)后，取4-14代經(jīng)37℃培養(yǎng)24h的新鮮斜面培養(yǎng)物，用5mlPBS洗下菌苔，然后用含1％蛋白胨的PBS作適當(dāng)稀釋后備用。2、菌片制備經(jīng)脫脂、清洗的1×1cm滅菌布片滴加0.02ml適當(dāng)菌量的菌懸液，37℃干燥30min后備用。3、載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)；分別取三個(gè)不同濃度的消毒液，以每片5.0ml的量注入滅菌平皿中，于20℃±2℃水浴5min后，加入金黃色葡萄球菌菌片，作用至規(guī)定時(shí)間分別取出菌片移入5.0ml中和劑中，作用10min后充分振搖洗下菌片上細(xì)菌，吸取0.5ml洗液進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。37℃培養(yǎng)48h觀察結(jié)果，同時(shí)以PBS代替消毒劑作陽性對(duì)照組，接種中和劑、PBS并以同批培養(yǎng)基為陰性對(duì)照。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算殺滅率與平均殺滅率。三、結(jié)果對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅結(jié)果
注陽性對(duì)照組平均菌數(shù)為1.12×106cfu/片(1.28-1.33×106cfu/片)陰性對(duì)照組中和劑、PBS、培養(yǎng)基無細(xì)胞生長。四、結(jié)論1、經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)，該樣品原液的消毒液作用10分鐘對(duì)金黃色葡萄球菌的殺滅率為99.93％。VI白色念珠菌載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)一、材料1、菌株白色念珠菌(ATCC 10231)2、消毒劑高科復(fù)合酶洗液3、中和劑0.5％硫代硫酸鈉、2％吐溫-80、0.5％卵磷脂的PBS。二、方法1、白色念珠菌懸液制備打開白色念珠菌(ATCC 10231)凍干菌種管，經(jīng)分離培養(yǎng)后，取4-14代經(jīng)37℃培養(yǎng)24h的新鮮斜面培養(yǎng)物，用5mlPBS洗下菌苔，然后用含1％蛋白胨的PBS作適當(dāng)稀釋后備用。2、菌片制備經(jīng)脫脂、清洗的1×1cm滅菌布片滴加0.02ml適當(dāng)菌量的菌懸液，37℃干燥30min后備用。3、載體定量法中和劑鑒定試驗(yàn)試驗(yàn)用消毒液濃度為原液、中和劑為含0.5％硫代硫酸鈉、2％吐溫-80、0.5％卵磷脂的PBS，中和劑試驗(yàn)分8組進(jìn)行。(1)5.0ml消毒液加1片染菌片，作用1min，取出菌片移入5.0mlPBS中。(2)5.0ml消毒液加1片染菌片作用1min，取出菌片移入5.0ml中和劑中，作用10min。(3)5.0ml中和劑加1片染菌片，作用10min。取出菌片移入5.0ml中和劑中，用中和劑稀釋后接種。(4)5.0ml中和產(chǎn)物溶液(將浸有消毒劑的載體置5.0ml中和劑內(nèi)作用10min)加染菌片1片，作用10min。取出菌片移入5.0ml中和產(chǎn)物中，以中和產(chǎn)物溶液釋后接種。(5)5.0mlPBS加入1片染菌片，作用10分鐘，取出菌片移入5.0mlPBS中，以PBS稀釋后接種。(6)(7)(8)組分別為PBS、中和劑、培養(yǎng)基陰性對(duì)照組。37℃培養(yǎng)72h觀察結(jié)果。試驗(yàn)重復(fù)3次，試驗(yàn)溫度20℃±2℃(試驗(yàn)前預(yù)溫5min)。4、載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)分別取三個(gè)不同濃度的消毒液，以每片5.0ml的量注入滅菌平皿中，于20℃±2℃)水浴5min后，加入大腸桿菌菌片，作用至規(guī)定時(shí)間時(shí)，分別取出菌片移入5.0ml中和劑中，作用10min后充分振搖洗下菌片上細(xì)菌，吸取0.5ml洗液進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)37℃培養(yǎng)72h觀察結(jié)果，同時(shí)以PBS代替消毒劑作陽性對(duì)照組。接種中和劑、PBS并以同批培養(yǎng)基為陰性對(duì)照，試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算殺滅率與平均殺滅率。三、結(jié)果1、載體定量法中和劑鑒定試驗(yàn)表1 中和劑鑒定試驗(yàn)結(jié)果
2、載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)(布片載體)表2 對(duì)白色念珠菌的殺滅效果稀釋濃度 作用不同時(shí)間(min)的平均殺滅率(％)(％) 2 5 102097.11 99.55 99.90 99.98原液 (95.37-98.58) (99.33-99.81) (99.90-99.91) (99.97-99.98)82.48 84.93 89.44 99.4150(81.79-82.96) (84.50-85.61) (88.64-90.00) (99.33-99.46)50.00 56.68 78.61 94.5325(45.29-53.08) (53.70-59.25) (72.22-79.62) (94.07-94.87)注陽性對(duì)照組平均菌數(shù)為8.10×105fu/片(7.80-1.33×105fu/片)陰性對(duì)照組中和劑、PBS、培養(yǎng)基無細(xì)胞生長。四、結(jié)論1、經(jīng)3次重復(fù)中和劑鑒定試驗(yàn)表明，含0.5％硫代硫酸鈉、2％吐溫-80、0.5％卵磷脂的PBS可中和試驗(yàn)濃度的消毒劑對(duì)白色念珠菌的殘余作用，且中和產(chǎn)物對(duì)受試菌的生長無影響。2、經(jīng)3次重復(fù)試驗(yàn)，該樣品原液的消毒液作用10分鐘對(duì)白色念珠菌的殺滅率為99.90％。
本發(fā)明的溶葡萄球菌復(fù)合酶(高科復(fù)合溶菌酶)洗液對(duì)會(huì)陰部細(xì)菌及淋病的殺菌試驗(yàn)經(jīng)上海市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院檢驗(yàn)結(jié)果如下檢驗(yàn)情況樣品名稱高科復(fù)合酶洗液樣品編號(hào)黃疾控20004345消現(xiàn)60/1-60送檢單位上海高科生物工程有限公司請(qǐng)驗(yàn)項(xiàng)目殺菌率測(cè)試依據(jù)GB15981-1995《消毒技術(shù)規(guī)范》-2000檢驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)對(duì)象及數(shù)量會(huì)陰部，共60件。消毒用濃度(劑量)原液，作用時(shí)間1分鐘中和劑名稱濃度(或用量)0.5％硫代硫酸鈉，2％吐溫-80，0.5％卵磷脂PBS試驗(yàn)環(huán)境溫度(℃)22，相對(duì)濕度(％)79。采樣方法將浸有上述中和劑采樣液的無菌棉拭子均勻在會(huì)陰部左側(cè)來回涂若干次，然后將棉拭子插回試管中作為消毒前采樣。再將浸有高科復(fù)合酶洗液的棉拭子均勻在會(huì)陰部右側(cè)來回涂若干次，1分鐘后用上述方法再涂擦，作為消毒后采樣。然后將棉花端插入度管內(nèi)洗脫。消毒前后采樣共60件。檢驗(yàn)方法洗液傾注瓊脂平板37℃，培養(yǎng)48小時(shí)，活菌計(jì)數(shù)，計(jì)算殺菌率。試驗(yàn)對(duì)象名稱 件數(shù)檢驗(yàn)項(xiàng)目時(shí)間(分) 消毒前菌數(shù)(數(shù)) 消毒后菌數(shù)(數(shù))殺菌率(％)會(huì)陰部1 細(xì)菌總數(shù)1 2900 9096.90會(huì)陰部2 細(xì)菌總數(shù)1110010 99.09會(huì)陰部3 細(xì)菌總數(shù)1260020 99.23會(huì)陰部4 細(xì)菌總數(shù)1340050 98.53會(huì)陰部5 細(xì)菌總數(shù)1470025094.68會(huì)陰部6 細(xì)菌總數(shù)1340021093.82會(huì)陰部7 細(xì)菌總數(shù)1880063092.84會(huì)陰部8 細(xì)菌總數(shù)1870049094.37會(huì)陰部9 細(xì)菌總數(shù)1290019093.45會(huì)陰部10 細(xì)菌總數(shù)1370029092.16會(huì)陰部11 細(xì)菌總數(shù)1650057091.23會(huì)陰部12 細(xì)菌總數(shù)1420017095.95會(huì)陰部13 細(xì)菌總數(shù)1150030 98.00會(huì)陰部14 細(xì)菌總數(shù)1240040 98.33會(huì)陰部15 細(xì)菌總數(shù)1470022095.32會(huì)陰部16 細(xì)菌總數(shù)1270020095.59會(huì)陰部17 細(xì)菌總數(shù)1350021094.00會(huì)陰部18 細(xì)菌總數(shù)1460020095.65會(huì)陰部19 細(xì)菌總數(shù)1320020093.75會(huì)陰部20 細(xì)菌總數(shù)1170060 96.47會(huì)陰部21 細(xì)菌總數(shù)1330029091.21會(huì)陰部22 細(xì)菌總數(shù)1880 20 97.73會(huì)陰部23 細(xì)菌總數(shù)1690052092.46會(huì)陰部24 細(xì)菌總數(shù)1290021092.76會(huì)陰部25 細(xì)菌總數(shù)1110070 93.64會(huì)陰部26 細(xì)菌總數(shù)1280028090.00會(huì)陰部27 細(xì)菌總數(shù)1370037090.00會(huì)陰部28 細(xì)菌總數(shù)1470042091.06會(huì)陰部29 細(xì)菌總數(shù)1490029094.08會(huì)陰部30 細(xì)菌總數(shù)1420032092.38檢驗(yàn)結(jié)果與評(píng)價(jià)
高科復(fù)合酶洗液對(duì)淋病奈瑟菌的最小殺菌濃度為3.9×10-5u/ml。
不同濃度(0.5u/ml、1u/ml、2u/ml)的高科復(fù)合酶洗液在不同作用溫度(10℃、20℃、37℃)，不同作用時(shí)間(2’、5’、10’、15’、30’、45’)的條件下對(duì)淋病奈瑟菌均有殺滅作用。VII有機(jī)物影響試驗(yàn)一、材料1、菌株金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)2、消毒劑高科復(fù)合酶洗液3、中和劑0.5％硫代硫酸鈉、2％吐溫-80、0.5％卵磷脂的PBS。二、方法1、金黃色葡萄球菌懸液制備將金黃色葡萄球菌懸液與無菌小牛血清配成含50％小牛血清組、含25％小牛血清組和不含小牛血清三組，分別滴染滅菌布片制備染菌片，菌量達(dá)5×105-5×106cfu/片。37℃干燥30min后用原液濃度消毒液進(jìn)行載體浸泡定量殺菌試驗(yàn)。試驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算殺滅率與平均殺滅率。三、結(jié)果有機(jī)物影響試驗(yàn)結(jié)果
四、結(jié)論經(jīng)3次重復(fù)有機(jī)物影響試驗(yàn)，在菌懸液中含有50％小牛血清時(shí)，對(duì)該樣品殺滅金黃色葡萄球菌的作用有中度影響；在菌懸液中含有25％小牛血清時(shí)，對(duì)該樣品殺滅金黃色葡萄球菌的作用有輕度影響。結(jié)論高科復(fù)合酶洗液PH值為6.69。醋酸洗必泰含量為0.1047％。樣品經(jīng)37℃放置三個(gè)月，醋酸洗必泰含量下降率為4.78％。該樣品原液作用10分鐘對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和白色念珠菌的殺滅率分別為99.98％、99.93％和99.90％。在50％小牛血清存在時(shí)，對(duì)該樣品殺滅金黃色葡萄球菌的作用有中度影響；在25％小牛血清存在時(shí)有輕度影響。
本發(fā)明的溶葡萄球菌洗液(高科復(fù)合酶洗液)經(jīng)上海市預(yù)防醫(yī)學(xué)研究院檢測(cè)急性毒性等試驗(yàn)結(jié)果如下I急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)一、試驗(yàn)?zāi)康臋z測(cè)受試物在短時(shí)間經(jīng)口染毒時(shí)的毒性，其結(jié)果可作為毒性分級(jí)和確定亞慢性毒性等試驗(yàn)劑量的依據(jù)。二、材料和動(dòng)物受試物性狀送檢樣品為無色液體配制方法準(zhǔn)確稱取樣品，加入蒸餾水配成0.25g，ml，供試。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，清潔級(jí)，體重18-22克，由上海醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，合格證號(hào)02-22-1。
飼養(yǎng)室溫度22±2℃，相對(duì)濕度50-80克，動(dòng)物室合格號(hào)02-28。小鼠飼養(yǎng)料，由蘇杭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技發(fā)展公司提供，合格證號(hào)9905084。三、試驗(yàn)方法1、檢驗(yàn)依據(jù)消毒技術(shù)規(guī)范(第三版)1999.11中3.4條。2、劑量和分組動(dòng)物禁食過夜后，按體重隨機(jī)分雌雄二組，每組10只。劑量為5.0g/kg。3、試驗(yàn)步驟采用一次經(jīng)口灌胃染毒法，按0.2ml/10g體重，計(jì)算染毒量。觀察期為二周。對(duì)到期處死動(dòng)物進(jìn)行解剖，肉眼觀察動(dòng)物大體病理改變。4、計(jì)算用一次最大限度法計(jì)算LD50值，并根據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行毒性分級(jí)。四、試驗(yàn)結(jié)果不同劑量組動(dòng)物體重變化，死亡情況見表。
染毒后未見明顯中毒癥狀大體解剖到期處死動(dòng)物，各臟器未見異常。
小鼠急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果性劑量組動(dòng)物數(shù)體重X±SD(g) 死亡動(dòng)物死亡別g/kg (只) 0714(d)數(shù)(只) 率(％)♂5.0 1020.0±1.324.1±1.227.5±1.40 00♀ 5.0 1019.5±1.423.7±1.126.9±1.20 0五、結(jié)論小鼠急性經(jīng)口LD50雌性＞5.0g/kg雄性＞5.0g/kgII皮膚刺激試驗(yàn)一、試驗(yàn)?zāi)康臋z測(cè)受試物對(duì)動(dòng)物皮膚接觸后是否產(chǎn)生局部刺激反應(yīng)及其程度。二、材料和動(dòng)物受試物性狀送檢樣品為無色液體配制方法原液直接測(cè)試。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新西蘭家兔，普通級(jí)，四只，體重2.4～2.8kg，由上海醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，合格證號(hào)05-52-1。飼養(yǎng)室溫度20±2℃，相對(duì)濕度50-70％，動(dòng)物房合格證號(hào)02-28，家兔飼料由蘇杭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技發(fā)展公司提供，合格證號(hào)9905084。三、試驗(yàn)方法1、檢測(cè)依據(jù)消毒技術(shù)規(guī)范(第三版)1999.11中3.6條。2、試驗(yàn)前24小時(shí)將動(dòng)物背部脊柱兩側(cè)毛剪掉，去毛范圍各約3×3cm2。3、第二天，在左側(cè)完好去毛皮膚上劃出2.5×2.5cm2試驗(yàn)區(qū)，將受試物0.2ml均勻涂在試驗(yàn)區(qū)皮膚上，并用一層玻璃覆蓋，再用無刺激膠布固定，使受試物與皮膚直接接觸4h，右側(cè)去毛皮膚作對(duì)照。4、試驗(yàn)結(jié)束后除去覆蓋物，并用溫水清洗除去殘留受試物后。分別于除去殘留受試物后1、24和48h觀察涂抹部位皮膚反應(yīng)，按皮膚刺激反應(yīng)強(qiáng)度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)分和對(duì)皮膚刺激反應(yīng)強(qiáng)度分級(jí)。四、試驗(yàn)結(jié)果受試物與皮膚接觸后局部皮膚未見紅斑、水腫，未見其它毒性作用。家兔皮膚一次刺激反應(yīng)評(píng)分見表。
對(duì)動(dòng)物皮膚一次刺激反應(yīng)評(píng)分表動(dòng) 性 體 1h 24h 48h物 別 重 樣品 對(duì)照 樣品 對(duì)照 樣品 對(duì)照編 (kg)紅 水 總 紅 水 總 紅 水 總 紅 水 總 紅 水 總 紅 水 總斑 腫 分 斑 腫 分 斑 腫 分 斑 腫 分 斑 腫 分 斑 腫 分1 雌 2.40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 02 雄 2.40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 03 雌 2.40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 04 雄 2.40 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0總積分均值 0 0 0 0 0 0五、結(jié)論受試物對(duì)家兔皮膚刺激(最高)總積分均值為0，屬無刺激性。III小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)一、試驗(yàn)?zāi)康臋z測(cè)受試物對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核形成的影響，評(píng)價(jià)其體內(nèi)遺傳毒性。二、材料和動(dòng)物受試物性狀送檢樣品為無色液體配制方法稱取樣品5.0、2.5、1.0g，分別加蒸餾水至20ml，充分混勻后作為受試樣品。陽性對(duì)照物環(huán)磷酰胺由上海華聯(lián)制藥有限公司生產(chǎn)。配制方法稱取環(huán)磷酰胺40mg加蒸餾水至20ml，充分混勻后備用。
實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，普通級(jí)，體重25-30克，由上海醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，合格證號(hào)02-22-1。飼養(yǎng)室溫度20±2℃，相對(duì)濕度50-70％，動(dòng)物房合格證號(hào)02-28，小鼠飼養(yǎng)料由蘇杭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技發(fā)展公司提供，合格證號(hào)9905084。三、試驗(yàn)方法1、檢測(cè)依據(jù)消毒技術(shù)規(guī)范(第三版)1999.11中3.11.4條。2、將動(dòng)物隨機(jī)分為5組，每組10只，雌雄各半，分別為樣品三個(gè)劑量組及陰性對(duì)照組和環(huán)磷酰胺陽性對(duì)照組。3、采用30h二次灌胃法，將配制的不同濃度樣品0.4mg/20g體重，分別對(duì)各組動(dòng)物灌胃，陽性對(duì)照組采用灌胃，陰性對(duì)照組采用灌胃。4、于第二次灌胃后6小時(shí)，頸椎脫臼處死動(dòng)物，取股骨骨髓加小牛血清混勻，常規(guī)涂片、固定Giemsa染色制片。5、鏡檢觀察，每鼠計(jì)數(shù)1000嗜多染紅細(xì)胞(PCE)，并計(jì)算其中含微核細(xì)胞數(shù)，以千分率‰來表示。同時(shí)還觀察PCE/NCE(成熟紅細(xì)胞)之比例。6、各組微核細(xì)胞率與陰性對(duì)照組相比用泊松分布U檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理。四、試驗(yàn)結(jié)果小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核發(fā)生率組別 劑量動(dòng)物數(shù)受檢PCE 含微核 微核細(xì)胞 PCE/ 統(tǒng)計(jì)學(xué)(mg/kg) (只) 數(shù)(個(gè)) PCE(個(gè)) 率‰ NCE 檢驗(yàn)受試 50001010000 10 1.01.07 ＞0.05物組 25001010000 9 0.91.06 ＞0.0510001010000 8 0.81.08 ＞0.05陰性 蒸餾水1010000 9 0.9 1.06對(duì)照組 20000mg/kg陽性 環(huán)磷棧酰胺1010000 28.2 28.2 0.96 ＜0.01對(duì)照組 40mg/kg五、結(jié)論受試物對(duì)小鼠骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核試驗(yàn)結(jié)果為陰性。IV陰道粘膜刺激試驗(yàn)一、試驗(yàn)?zāi)康臋z測(cè)受試物對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物陰道粘膜的刺激作用和強(qiáng)度。二、材料和動(dòng)物受試物性狀關(guān)檢樣品為無色液體配制方法取棉條0.01，用送檢樣品浸潤后作為受試物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SD大鼠，雌性，普通級(jí)，12只，體重240-260g，分二組，受試物組和對(duì)照組，每組6只。由上海醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，合格證號(hào)02-22-2。飼養(yǎng)室溫度20±2℃，相對(duì)濕度50-70％，動(dòng)物房合格證號(hào)02-28，大鼠飼養(yǎng)料由蘇杭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技發(fā)展公司提供，合格證號(hào)9905084。三、試驗(yàn)方法1、檢測(cè)依據(jù)消毒技術(shù)規(guī)范(第三版)1999.11中3.8條。2、將受試物置動(dòng)物陰道內(nèi)，與陰道粘膜接觸4小時(shí)，對(duì)照組用棉條0.01g浸以滅菌生理鹽水作同樣的試驗(yàn)。3、于24h處死動(dòng)物，取出局部陰道組織，觀察有無充血、水釧等現(xiàn)象。4、參照消毒技術(shù)規(guī)范(第三版)1999.11中皮膚刺激反應(yīng)強(qiáng)度的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)及皮膚刺激強(qiáng)度分級(jí)，進(jìn)行對(duì)陰道粘膜刺激強(qiáng)度的評(píng)定。四、試驗(yàn)結(jié)果動(dòng)物陰道粘膜刺激反應(yīng)評(píng)分組 動(dòng)物 體重 刺激反應(yīng)評(píng)分別 編號(hào) (g) 紅斑 水腫 總分1 240 0 0 0受 2 245 0 0 0試 3 252 0 0 0物 4 254 0 0 0組 5 260 0 0 06 255 0 0 0總積分均值 07 243 0 0 08 245 0 0 0對(duì) 9 251 0 0 0照 10260 0 0 0組 11248 0 0 012250 0 0 0總積分均值 0五、結(jié)論受試物對(duì)大鼠陰道粘膜刺激反應(yīng)最高總積分均值為0，屬無刺激性。V皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)一、試驗(yàn)?zāi)康臋z測(cè)受試物重復(fù)接觸后對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生的皮膚變態(tài)反應(yīng)。二、材料和動(dòng)物受試物性狀送檢樣品為無色液體配制方法原液直接測(cè)試。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物英國種白色豚鼠，普通級(jí)，雌雄各半，體重200-240g，共48只，分為受試物組、陰性對(duì)照組、陽性對(duì)照組三組，每組16只，由上海醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，合格證號(hào)02-52-2。飼養(yǎng)室溫度20±2℃，相對(duì)濕度50-70％，動(dòng)物房合格證號(hào)02-28，大鼠飼養(yǎng)料由蘇杭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技發(fā)展公司提供，合格證號(hào)9905084。三、試驗(yàn)方法1、檢測(cè)依據(jù)消毒技術(shù)規(guī)范(第三版)1999.11中3.9條。2、試驗(yàn)前24h將豚鼠背部左側(cè)毛剪掉，面積約3×3cm2。3、誘導(dǎo)接觸將誘導(dǎo)用受試物0.2ml在2×2cm2兩層紗布上，并將其貼敷在受試組動(dòng)物左側(cè)去毛區(qū)皮膚上，用一層玻璃紙覆蓋，再用無刺激膠布固定，使受試物在皮膚直接接觸6h。于第7d和第14d以同樣方法重復(fù)一次。4、激發(fā)接觸在末次誘導(dǎo)接觸后14d，將激發(fā)用受試物0.2ml在2×2cm2兩層紗布上，并將其貼敷在受試組和陰性對(duì)照組動(dòng)物右側(cè)去毛皮膚上，用一層玻璃紙覆蓋，再用無刺激膠布固定，使直接接觸6h。5、6h后將貼敷的受試物取掉。于24、48h后觀察皮膚反應(yīng)，按皮膚反應(yīng)強(qiáng)度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)平分并計(jì)算致敏率和按致敏強(qiáng)度評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)致敏強(qiáng)度。6、陽性對(duì)照組分別用5％喝2％2、4-二硝基氯代笨作同樣的誘導(dǎo)接觸和激發(fā)接觸。四、試驗(yàn)結(jié)果豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)結(jié)果
注皮膚紅斑反應(yīng)、水腫反應(yīng)強(qiáng)度即在積分為0、1、2、3、4時(shí)的反應(yīng)動(dòng)物數(shù)與試驗(yàn)動(dòng)物數(shù)之比。五、結(jié)論受試物對(duì)豚鼠皮膚變態(tài)反應(yīng)試驗(yàn)結(jié)果，致敏率為0(％)，致敏強(qiáng)度屬極輕。VI蓄積毒性試驗(yàn)——?jiǎng)┝窟f增蓄積系數(shù)法一、試驗(yàn)?zāi)康臋z測(cè)受試物在試驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)蓄積毒性，并為亞慢性試驗(yàn)及其他有關(guān)毒性試驗(yàn)的劑量選擇提供參數(shù)。二、材料和動(dòng)物受試物性狀送檢樣品為無色液體配置方法準(zhǔn)確稱取樣品，加入蒸餾水，配成濃度分別為50、75、110、250mg/kg，作為各期受試物。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種小鼠，清潔級(jí)，體重20-21g，由上海醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部提供，合格證號(hào)02-22-1。飼養(yǎng)室溫度20±2℃，相對(duì)濕度50-80％，動(dòng)物房合格證號(hào)02-28。小鼠飼養(yǎng)料，由蘇杭實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技發(fā)展公司提供，合格證號(hào)9905084。三、試驗(yàn)方法1、檢測(cè)依據(jù)消毒技術(shù)規(guī)范(第三版)1999.11中3.10.3條。2、根據(jù)急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)結(jié)果，該樣品小鼠經(jīng)口LD50以5.0g/kg計(jì)。3、將動(dòng)物隨機(jī)分為雌雄兩組，每組10只，經(jīng)口灌胃容量以0.1ml/10g體重。每天一次，每4天為一期。首期劑量用0.1 LD50即0.5g/kg，連續(xù)4天。以后每期劑量一次遞增50％，在遞增同時(shí)重稱體重，按體重校正灌胃量。四、試驗(yàn)結(jié)果在蓄積毒性試驗(yàn)染毒期間未見明顯中毒癥狀出現(xiàn)。受試物染毒劑量，累計(jì)劑量和動(dòng)物死亡數(shù)見表。
累計(jì)劑量和動(dòng)物死亡數(shù)表
小鼠連續(xù)染毒20天，未見死亡，累積劑量為26.20g/kg，蓄積系數(shù)＞5。五、結(jié)論受試物對(duì)小鼠蓄積毒性試驗(yàn)，其蓄積系數(shù)(K值)＞5，根據(jù)蓄積毒性分級(jí)屬弱蓄積性。檢驗(yàn)結(jié)果匯總一、急性經(jīng)口毒性試驗(yàn)雌性小鼠LD50＞5.0g/kg雄性小鼠LD50＞5.0g/kg屬實(shí)際無毒級(jí)二、皮膚刺激試驗(yàn)屬無刺激性。三、微核試驗(yàn)陰性四、陰道粘膜刺激試驗(yàn)屬無刺激性五、皮膚變態(tài)反應(yīng)屬極輕六、蓄積毒性試驗(yàn)蓄積系數(shù)K＞5，屬弱蓄積性。
本發(fā)明的主要成份-高科復(fù)合溶菌酶，本質(zhì)上是蛋白質(zhì)，不會(huì)對(duì)皮膚和粘膜產(chǎn)生刺激，不對(duì)機(jī)體產(chǎn)生任何形式的毒副作用，并可通過代謝徹底降解，沒有殘留，不會(huì)富集，所以該洗液在使用過程中無需過洗。
其基本特點(diǎn)為1)殺菌譜廣。不僅能有效殺滅白色念珠菌、溶血性鏈球菌、厭氧菌、綠膿桿菌、大腸桿菌等常見致病細(xì)菌，對(duì)淋病奈瑟菌也有很強(qiáng)的殺滅作用。此外對(duì)一些耐藥性細(xì)菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等也顯示出極強(qiáng)的殺菌效果。
2)殺菌活性和穩(wěn)定性大大高于溶葡萄球菌酶。由于高科復(fù)合酶洗液是以溶葡萄球菌酶(lysostaphin)為主要成分，配以另一種溶菌酶及穩(wěn)定劑、增效劑等成分復(fù)合而成，比純的溶葡萄球菌酶具有更大的穩(wěn)定性，經(jīng)測(cè)試證明，該洗液在常溫下可保存2年。
實(shí)例1、制造100毫升溶葡萄球菌復(fù)合酶洗液組分溶葡葡球菌酶 0.001克溶菌酶 0.02克洗必泰 0.1克甘油 0.2毫升蒸餾水 99.7毫升方法分別將溶葡萄球菌酶0.001克，溶菌酶0.02克，洗必泰0.1克混勻，再加入甘油0.2ml蒸餾水99.7ml，混勻灌裝。
實(shí)例2制造100毫升溶葡萄球菌復(fù)合酶洗液組分溶葡萄球菌酶 0.002克溶菌酶 0.02克洗必泰 0.1克甘油 0.2毫升蒸餾水 99.7毫升方法分別將溶葡萄球菌酶0.002克，溶菌酶0.02克，洗必泰0.1克混勻，再加入甘油0.2ml蒸餾水99.7ml，混勻灌裝。
實(shí)例3、制造100毫升溶葡萄球菌復(fù)合酶洗液組分；溶葡萄球菌酶 0.002克溶菌酶 0.02克洗必泰 0.15克甘油 0.2毫升蒸餾水 99.6毫升方法分別將溶葡萄球菌酶0.002克，溶菌酶0.02克，洗必泰0.15克混勻，再加入甘油0.2ml蒸餾水99.6ml，混勻灌裝。
權(quán)利要求
1.一種溶葡萄球菌復(fù)合酶洗液，其特征在于該洗液是由由溶葡萄球菌酶0.001～0.002％和溶菌酶0.02～0.05％、洗必泰0.1-0.2％作為主要成份與甘油0.2～0.3％和蒸餾水作為輔料組成100％的組成。
2.一種如權(quán)利要求1所述的溶葡萄球菌復(fù)合酶洗液的制備方法，其特征在于該方法是在無菌室或超凈工作臺(tái)中，按處方量將溶葡萄球菌酶，溶菌酶，洗必泰按比例依次加入潔凈的玻璃或不銹鋼盛具中，輕輕攪拌，充分混和均勻后，再加入所示比例的甘油和蒸餾水，充分混勻，灌裝于塑料或玻璃瓶中，入庫，室溫保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種溶葡萄球菌復(fù)合酶洗液及制備方法。本發(fā)明的產(chǎn)品為消毒類生物制劑,該產(chǎn)品不僅有效殺滅白色念珠菌、淋病奈瑟菌、溶血性鏈球菌、厭氧菌、綠膿桿菌、大腸桿菌,對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌等耐藥性細(xì)菌也可以高效殺滅。具有殺菌譜廣、無毒副作用、無殘留的特點(diǎn)。制備方法簡(jiǎn)單宜于規(guī)模型生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C11D7/22GK1364866SQ0110520
公開日2002年8月21日 申請(qǐng)日期2001年1月11日 優(yōu)先權(quán)日2001年1月11日
發(fā)明者陸婉英 申請(qǐng)人:上海高科生物工程有限公司