專利名稱：一種微球菌兩級復(fù)凝固定化方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細胞固定化生物制劑，尤指微球菌(Micrococcus sp.)兩級復(fù)凝固定化方法，具體地說是一種海藻酸鈉(Na·Alg)-明膠(Gel)-氯化鈣(CaCl2)-氯化鈣(CaCl2)-殼聚糖(CS)兩級復(fù)凝微膠囊工藝。
背景技術(shù)：
微膠囊包埋細菌技術(shù)因包埋細菌數(shù)量大、緩釋、生物相容性好等特點，一直以來被人們廣泛關(guān)注，已經(jīng)在制藥、食品、釀造、提純等領(lǐng)域得到了普遍應(yīng)用；但由于微膠囊壁(厚度)薄，機械強度較小，長期使用易破碎等缺陷，限制了其廣泛范圍。
傳統(tǒng)增強微膠囊壁厚度的方法有兩種一是選用強度高的載體材料，一是延長制囊時間，以增加微膠囊壁厚。但是高強度載體的生物相容性和水溶性一般較差，制得的微膠囊缺少彈性；延長制囊時間將導(dǎo)致膠囊壁產(chǎn)生過多的單質(zhì)滲出層，并使鈣化層過度增厚，阻塞囊壁孔隙，不利于氧氣、營養(yǎng)物質(zhì)以及其它的小分子物質(zhì)自由通過微膠囊膜進行物質(zhì)傳遞，因此，如何在保證微膠囊壁滲透性的基礎(chǔ)上，最大限度的提高囊壁強度，是微膠囊技術(shù)能否大規(guī)模實際應(yīng)用的關(guān)鍵控制性因素。
微球菌Micrococcus sp.菌體尺寸微小，適宜的微膠囊壁孔徑不宜過大，否則容易泄漏；一般在Na·Alg-CS復(fù)凝制囊時，為了提高強度而延長時間，導(dǎo)致囊壁孔隙阻塞，固定化失敗。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于利用Na·Alg-Gel-CaCl2一級復(fù)凝、CaCl2二次鈣化和CS兩級復(fù)凝技術(shù)，在保證囊壁傳質(zhì)滲透性的前提下，提高微膠囊壁的機械強度，成功固定化微球菌Micrococcus sp.，制備性能優(yōu)良的微生物菌劑。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為向Na·Alg溶液里加入1ml吐溫80和微球菌，在40-45℃，通過9#針頭注射器，控制下滴速度40-60滴/分鐘，向Gel和CaCl2混合液中滴加，穩(wěn)定3.5-5h，然后在CaCl2溶液中二次鈣化10-15min，隨后在CS溶液中進行二級復(fù)凝聚反應(yīng)2-3h，再利用檸檬酸囊內(nèi)液化5-8min，以無菌生理鹽水水浸泡6-24h，增殖培養(yǎng)，備用。
微球菌兩級復(fù)凝固定化方法，可按如下步驟進行具體操作，
1)壁材配制按質(zhì)量百分比配制1.5-2.5％海藻酸鈉(Na·Alg)的水溶液(用自來水浸潤24h)，滅菌冷卻(使用前于111℃下濕熱滅菌30min，冷卻到45℃)，加入與海藻酸鈉的水溶液體積比為200∶1的無菌吐溫80，并加入海藻酸鈉的水溶液總質(zhì)量15-30％的黃桿菌液體種子(菌齡16-20h)，攪拌均勻；2)一級芯材溶液配制按質(zhì)量百分比配制含1.5-2.5％明膠(Gel)和1.0-2.0％氯化鈣(CaCl2)的水溶液，pH＝5.0-7.0，滅菌冷卻(使用前于111℃下濕熱滅菌30min)，備用；3)二次鈣化溶液配制按質(zhì)量百分比配制0.2-0.8％氯化鈣(CaCl2)的水溶液，滅菌冷卻(使用前于121℃下濕熱滅菌20min)，備用；4)二級芯材溶液配制按質(zhì)量百分比配制0.1-0.7％殼聚糖(CS)的水溶液，pH＝3.5-5.5，滅菌冷卻(使用前于111℃下濕熱滅菌30min)，備用；5)囊內(nèi)液化液配制按摩爾濃度配制0.055mol/L檸檬酸水溶液，滅菌冷卻(使用前于111℃下濕熱滅菌30min)，備用；6)微膠囊制備在40-45℃下，將壁材溶液在無菌條件下按40-60滴/分鐘的速度滴入一級芯材溶液中，不斷攪拌；膠珠成型后，穩(wěn)定3.5-5h；，將膠珠轉(zhuǎn)移到二次鈣化液中，二次鈣化10-15min，然后將膠珠轉(zhuǎn)移到二級芯材溶液中，進行二級復(fù)凝聚反應(yīng)2-3h；將膠珠轉(zhuǎn)移到檸檬酸溶液中，攪拌囊內(nèi)液化5-8min；取出膠珠用無菌水或無菌生理鹽水浸泡6-24h(通常為16h)，置于增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)后制得微膠囊。
壁材配制中海藻酸鈉水溶液的質(zhì)量百分比濃度為1.6-2.0％(以自來水浸潤24h)，滅菌冷卻，向其中加入海藻酸鈉的水溶液總質(zhì)量20％的黃桿菌液體種子，攪拌均勻；一級芯材配制中明膠和氯化鈣的質(zhì)量百分比分別為1.8-2.2％和1.2-1.8％，pH＝5.5-6.5；二次鈣化溶液配制中氯化鈣水溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.3-0.6％；二級芯材溶液配制中殼聚糖(CS)水溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.25-0.55％，pH＝4.0-5.0。
壁材配制中海藻酸鈉水溶液的質(zhì)量百分比濃度為1.8％(以自來水浸潤24h)；一級芯材配制中明膠(Gel)和氯化鈣(CaCl2)的質(zhì)量百分比分別為2.0％和1.5％，pH＝6.0；二次鈣化溶液配制中氯化鈣水溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.5％；二級芯材溶液配制中殼聚糖(CS)水溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.4％，pH＝4.5。
所述增殖培養(yǎng)是將制備的微膠囊在無菌條件下按照4％的質(zhì)量濃度加入到增殖培養(yǎng)基中，控制溫度28-30℃，搖床轉(zhuǎn)速130rpm-140rpm，培養(yǎng)時間24小時，之后更換培養(yǎng)基，共2次培養(yǎng)，備用。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.微球菌(生理)活性良好。本發(fā)明通過優(yōu)化兩級復(fù)凝聚體系組分含量，包括Na·Alg、Gel、CS、CaCl2，制備得到平均直徑為25μm-45μm的微膠囊，微膠囊擴散傳質(zhì)性能優(yōu)異，固定后的微球菌Micrococcus sp.(生理)活性良好。
2.提高了囊壁的機械強度。本發(fā)明采用Na·Alg-Gel-CaCl2-CaCl2-Na·Alg-CS兩級復(fù)凝聚技術(shù)，在保證囊壁傳質(zhì)滲透性能的同時，成功地改善了微膠囊的結(jié)構(gòu)，提高了囊壁的機械強度；制得的微膠囊機械強度高，在5000rpm速度下離心30min，膠囊不變形，不破碎；用于微球菌屬固定，長期培養(yǎng)微膠囊不溶解。
3.膠珠壁結(jié)構(gòu)均勻。微膠囊被束縛在直徑1.5mm-2.5mm的多孔膠珠內(nèi)部，膠珠壁結(jié)構(gòu)均勻，有效防止了微膠囊流失，并起到了強化微膠囊機械強度的效果。
4.緩釋性能優(yōu)異。按本發(fā)明(配方)制備的微膠囊在液體環(huán)境中(連續(xù))培養(yǎng)30天，微膠囊的緩釋性能優(yōu)異。
具體實施例方式
下面通過實施例對本發(fā)明作進一步詳細說明。
實施例1(1)微球菌Micrococcus sp.斜面培養(yǎng)在牛肉蛋白胨基礎(chǔ)培養(yǎng)基(0.3％牛肉膏，1.0％蛋白胨，0.5％NaCl，1.5-2.0％瓊脂，pH＝7.0-7.2)的試管中接入微球菌Micrococcus sp.，置28℃-30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h；(2)微球菌Micrococcus sp.液體種子制備用接種環(huán)在斜面培養(yǎng)基上接取2環(huán)菌苔，接入到液體種子培養(yǎng)基(1.25％葡萄糖，0.25％酵母膏，0.1％NH4NO3，0.02％MgSO4·7H2O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2)中，在搖床轉(zhuǎn)速130rpm-140rpm、28℃-30℃條件下，培養(yǎng)16-20小時，制得液體種子；(3)壁材配制按質(zhì)量百分比稱取2.5％Na·Alg，以97.5％質(zhì)量比的自來水浸潤24小時。于111℃下濕熱滅菌30min，冷卻到45℃，加入1ml無菌吐溫80，并加入上述總質(zhì)量20％的液體種子，攪拌均勻；(4)一級芯材溶液配制按質(zhì)量百分比稱取2.5％Gel和2.0％CaCl2，以自來水定容，調(diào)節(jié)pH＝7.0。于111℃下濕熱滅菌30min；(5)二次鈣化溶液配制按質(zhì)量百分比稱取0.8CaCl2，以自來水定容，pH自然。于121℃下濕熱滅菌20min；(6)二級芯材溶液配制按質(zhì)量百分比稱取0.7％CS，以自來水定容，調(diào)節(jié)pH＝5.5。于111℃下濕熱滅菌30min；(7)囊內(nèi)液化液配制按照摩爾濃度配制0.055mol/L檸檬酸水溶液，于121℃下濕熱滅菌20min；(8)微膠囊制備將壁材溶液在無菌條件下注入注射器內(nèi)，利用9#針頭按照30滴/分鐘的速度滴入一級芯材溶液中，不斷攪拌。膠珠成型后，維持5h，將膠珠轉(zhuǎn)移到二次鈣化液中，穩(wěn)定10min，然后將膠珠轉(zhuǎn)移到二級芯材溶液中，穩(wěn)定3h，將膠珠轉(zhuǎn)移到檸檬酸溶液中，攪拌5min，用無菌生理鹽水浸泡16h，置于增殖培養(yǎng)基(3.0％葡萄糖，0.4％酵母膏，0.1％牛肉膏，0.1％NH4NO3，0.02％MgSO4·7H2O，0.02％KCl，pH＝7.0-7.2)中，增殖24h，更換培養(yǎng)基，再次增殖24h，制得微膠囊。
(9)機械強度和緩釋性檢測按照4％接種量將微膠囊接入增殖培養(yǎng)基中，培養(yǎng)30d后，取1g微膠囊置于生理鹽水中，在5000rpm轉(zhuǎn)速下離心30min，囊體不變形、不破碎。微膠囊失重率小于24％。
實施例2與實施例1不同之處在于配制壁材溶液時，按照質(zhì)量百分比稱取2.0％Na·Alg；配制一級芯材溶液時，按質(zhì)量百分比稱取2.2％Gel和1.8％CaCl2，調(diào)節(jié)pH＝6.5；配制二次鈣化溶液時，按質(zhì)量百分比稱取0.6CaCl2；配制二級芯材溶液時，按質(zhì)量百分比稱取0.55％CS，調(diào)節(jié)pH＝5.0；控制壁材溶液下滴速度35滴/分鐘，一級復(fù)凝膠珠成型后，維持4h，膠珠轉(zhuǎn)移到二級芯材溶液中，穩(wěn)定2.5h；經(jīng)上述步驟制得的微膠囊機械強度較好，30d失重率小于23％。
實施例3與實施例1不同之處在于配制壁材溶液時，按照質(zhì)量百分比稱取1.8％Na·Alg；配制一級芯材溶液時，按質(zhì)量百分比稱取2.0％Gel和1.5％CaCl2，調(diào)節(jié)pH＝6.0；配制二次鈣化溶液時，按質(zhì)量百分比稱取0.5CaCl2；配制二級芯材溶液時，按質(zhì)量百分比稱取0.4％CS，調(diào)節(jié)pH＝4.5；控制壁材溶液下滴速度45滴/分鐘，一級復(fù)凝膠珠成型后，維持3.5h，膠珠轉(zhuǎn)移到二級芯材溶液中，穩(wěn)定2h；經(jīng)上述步驟制得的微膠囊機械強度較好，30d失重率小于19％。
權(quán)利要求
1.一種微球菌兩級復(fù)凝固定化方法，可按如下步驟操作，其特征在于1)壁材配制按質(zhì)量百分比配制1.5-2.5％海藻酸鈉的水溶液，滅菌冷卻，加入與海藻酸鈉的水溶液體積比為200∶1的無菌吐溫80，并加入海藻酸鈉的水溶液總質(zhì)量15-30％的黃桿菌液體種子，攪拌均勻；2)一級芯材溶液配制按質(zhì)量百分比配制含1.5-2.5％明膠和1.0-2.0％氯化鈣的水溶液，pH＝5.0-7.0，滅菌冷卻，備用；3)二次鈣化溶液配制按質(zhì)量百分比配制0.2-0.8％氯化鈣的水溶液，滅菌冷卻，備用；4)二級芯材溶液配制按質(zhì)量百分比配制0.1-0.7％殼聚糖的水溶液，pH＝3.5-5.5，滅菌冷卻，備用；5)囊內(nèi)液化液配制按摩爾濃度配制0.050-0.060mol/L檸檬酸水溶液，滅菌冷卻，備用；6)微膠囊制備在40-45℃下，將壁材溶液在無菌條件下按40-60滴/分鐘的速度滴入一級芯材溶液中，不斷攪拌；膠珠成型后，穩(wěn)定3.5-5h；，將膠珠轉(zhuǎn)移到二次鈣化液中，二次鈣化10-15min，然后將膠珠轉(zhuǎn)移到二級芯材溶液中，進行二級復(fù)凝聚反應(yīng)2-3h；將膠珠轉(zhuǎn)移到檸檬酸溶液中，攪拌囊內(nèi)液化5-8min；取出膠珠用無菌水或無菌生理鹽水浸泡6-24h，置于增殖培養(yǎng)基中，增殖培養(yǎng)后制得微膠囊。
2.按照權(quán)利要求1所述微球菌兩級復(fù)凝固定化方法，其特征在于壁材配制中海藻酸鈉水溶液的質(zhì)量百分比濃度為1.6-2.0％，滅菌冷卻，加入海藻酸鈉的水溶液總質(zhì)量20％的黃桿菌液體種子，攪拌均勻；一級芯材配制中明膠和氯化鈣的質(zhì)量百分比分別為1.8-2.2％和1.2-1.8％，pH＝5.5-6.5；二次鈣化溶液配制中氯化鈣水溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.3-0.6％；二級芯材溶液配制中殼聚糖水溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.25-0.55％，pH＝4.0-5.0。
3.按照權(quán)利要求1所述微球菌兩級復(fù)凝固定化方法，其特征在于壁材配制中海藻酸鈉水溶液的質(zhì)量百分比濃度為1.8％；一級芯材配制中明膠和氯化鈣的質(zhì)量百分比分別為2.0％和1.5％，pH＝6；二次鈣化溶液配制中氯化鈣水溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.5％；二級芯材溶液配制中殼聚糖水溶液的質(zhì)量百分比濃度為0.4％，pH＝4.5。
4.按照權(quán)利要求1所述微球菌兩級復(fù)凝固定化方法，其特征在于所述增殖培養(yǎng)是將制備的微膠囊在無菌條件下按照4％的質(zhì)量濃度加入到增殖培養(yǎng)基中，控制溫度28-30℃，搖床轉(zhuǎn)速130rpm-140rpm，培養(yǎng)時間24小時，之后更換培養(yǎng)基，共2次培養(yǎng)，備用。
全文摘要
本發(fā)明涉向Na·Alg溶液里加入1ml吐溫80和微球菌，在40－45℃，通過9#針頭注射器，控制下滴速度40－60滴/分鐘，向Gel和CaCl
文檔編號C12N1/20GK1778910SQ200410087568
公開日2006年5月31日 申請日期2004年11月17日 優(yōu)先權(quán)日2004年11月17日
發(fā)明者李培軍, 李海波, 鞠京麗, 張軼, 許華夏 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所