本發(fā)明設(shè)計一種獸用藥物的合成方法，具體來說是一種酶法合成泰拉霉素的方法。
背景技術(shù)：
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畜牧業(yè)中牲畜的呼吸道感染一般為多重感染，致病因素多，病情復(fù)雜，在尋求生物防治和環(huán)境阻斷的同時，藥物治療及預(yù)防是目前的主要途徑。因此尋找一種對該感染安全、有效、低殘留的新型抗菌藥迫在眉睫。
輝瑞藥業(yè)于2002年推出泰拉霉素，各國進(jìn)行了大量的體內(nèi)和體外藥理學(xué)、毒理學(xué)的相關(guān)實驗，同時也進(jìn)行了大量的臨床試驗證明泰拉霉素具有抗菌活性強(qiáng)、抗菌譜廣、半衰期長等眾多優(yōu)點，成為治療豬和牛呼吸道感染的明星藥物。2002年歐洲藥物評價署批準(zhǔn)泰拉霉素以Draxxin注射液在歐洲銷售，2005年美國批準(zhǔn)泰拉霉素用于動物呼吸系統(tǒng)疾病治療，2008年中國批準(zhǔn)泰拉霉素在大陸使用。
國內(nèi)外關(guān)于泰拉霉素的合成方法報道比較多
方法一：專利CN103073603A以阿奇霉素A為原料，經(jīng)乙酸酐保護(hù)、重鉻酸鈉氧化，與氰化鈉加成、還原和縮合等五步合成泰拉霉素
方法二:專利CN102260306A、CN102786569A和文獻(xiàn)Boorg Med Chem Lett.12(2002),1771-2774以阿奇霉素A為原料，經(jīng)乙酸酐/Boc2O保護(hù)，swern氧化、環(huán)氧化、堿性醇溶液或鈀碳脫保護(hù)、胺化脫環(huán)合成泰拉霉素。
方法三:專利US6472371B1、US6420536B1等以阿奇霉素A為原料，經(jīng)卞氧羰酰氯保護(hù)，swern氧化，硫葉立德環(huán)氧化鈀碳催化脫保護(hù)、開環(huán)合成泰拉霉素。
方法四:專利CN102295672、EP1253153A1公開了一種制備方法，以去甲基阿奇霉素為原料，用CbzCl選擇保護(hù)4位羥基，然后進(jìn)行Swern氧化，在通過硫葉立德進(jìn)行環(huán)氧化，之后用鈀碳加氫進(jìn)行保護(hù)基的脫除，最后進(jìn)行氨化反應(yīng)得到泰拉霉素。
綜上所述，在合成泰拉霉素的反應(yīng)過程中，要么用到劇毒的堿如氰化鈉，要么得用到昂貴的鈀碳做催化劑，進(jìn)行脫除保護(hù)基，而且用鈀碳的時候需高壓加氫，特別危險。
本發(fā)明的目的在于提供一種簡便的方法來合成泰拉霉素的關(guān)鍵中間體環(huán)氧化產(chǎn)物，本方法采用酶法合成，講改進(jìn)的酯酶(Esterase)吸附于LKZ518載體上，形成固定化的酯酶，以水為反應(yīng)溶劑，反應(yīng)溫度15℃，pH7.5條件下完成芐氧羰基的脫除。本方法采用水為反應(yīng)溶劑，反應(yīng)條件溫和，而且脫除效率高，固定化酯酶能重復(fù)利用，減少了環(huán)境污染，大大降低了生產(chǎn)成本。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
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針對現(xiàn)有化學(xué)合成泰拉霉素的工藝中，4位羥基上的保護(hù)基的脫除需要用到昂貴且危險的鈀碳在高壓下進(jìn)行加氫脫除，生產(chǎn)工藝繁瑣、操作危險、污染嚴(yán)重、成本高昂的問題，本發(fā)明提供一種酶法合成泰拉霉素的新工藝，反應(yīng)路線如下：
一種酶法合成泰拉霉素的工藝，具體步驟如下：
(1)將去甲基阿奇霉素、氯甲酸卞酯加入二氯甲烷中，0～5℃反應(yīng)1～2h后，加入二甲基亞砜，降溫至-70～-80℃后，加入三氟乙酸酐反應(yīng)10～30min，再加入三乙胺反應(yīng)10～30min，反應(yīng)結(jié)束用水淬滅并萃取有機(jī)相，有機(jī)相減壓濃縮后，得到化合物一；
(2)將三甲基溴化硫醚、叔丁醇鉀加到THF中-8～-16℃反應(yīng)1.5～2.5h得到硫葉立德溶液，將步驟(1)中的化合物一溶于二氯甲烷中，滴入硫葉立德溶液中反應(yīng)1～3h，反應(yīng)完畢把反應(yīng)液倒入飽和氯化銨溶液中萃取分相，有機(jī)相減壓濃縮后，得化合物二；
(3)采用LKZ518為載體，將酯酶采用共價法固定化，得到固定化酯酶；
(4)將步驟(2)中的化合物二加水，并用1mol/L的稀鹽酸調(diào)pH6.8～7.2溶解后加入步驟(3)所得的固定化酯酶，用1mol/L稀鹽酸和1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH7.3～7.7，控制反應(yīng)溫度10～20℃，反應(yīng)60～120min，反應(yīng)完成后用篩網(wǎng)過濾；料液加適量二氯甲烷用1mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH9.5～10.5萃取10～15min，有機(jī)相減壓濃縮后，加正丙胺和異丙醇，55～70℃反應(yīng)24h，反應(yīng)完成料液減壓濃縮后，后加丙酮溶解，滴加水析晶、養(yǎng)晶抽濾得泰拉霉素。
所述的步驟(4)中加入水的量為化合物二質(zhì)量的10-20倍；
所述的步驟(4)中加入的正丙胺-化合物二當(dāng)量比為15-25，異丙醇-化合物二質(zhì)量的15-20倍；
所述的步驟(4)中篩網(wǎng)為60～120目；
本申請利用酶法制備泰拉霉素的反應(yīng)機(jī)理如下：
氯甲酸芐酯由于羰基上連著鹵素和苯環(huán)兩個吸電子集團(tuán)，大大增加了脂肪酶脫去氯甲酸芐酯的難度，故增加酯酶的疏水活性中心，其一是使其與載體固定化更加牢固，其二是增加固定化后酶載體的酶活。
LKZ518載體由艾美科健(中國)生物醫(yī)藥有限公司提供，LKZ518載體為苯乙烯與二乙烯苯交聯(lián)網(wǎng)狀多孔聚合物，其足夠大的孔徑(平均孔徑10～20nm)讓酶進(jìn)入孔道內(nèi)，通過與聚合物比表面(比表面在100～500m2/g之間)發(fā)生物理吸附作用(主要是疏水性吸附)和交聯(lián)作用(主要是戊醛交聯(lián)作用)固定在一起，且LKZ518載體具有適宜的孔容保證其足夠的載酶量。
固定化過程：以LKZ518為載體，戊二醛為交聯(lián)劑進(jìn)行酶固定化。在合適的pH緩沖液體系中給予一定溫度、攪拌、反應(yīng)時間并按需要的載酶量加入蛋白酶即完成固定化過程，再經(jīng)后處理洗去酶載體上殘留的交聯(lián)劑等雜質(zhì)。
所述產(chǎn)品泰拉霉素的純度在99.5％以上，總摩爾收率在57％以上。
本發(fā)明所述的泰拉霉素合成酶由艾美科健(中國)醫(yī)藥有限公司提供，在本申請中泰拉霉素合成酶又稱固定化酯酶或酯酶。
本發(fā)明將化合物二和固定化酯酶加到水中，每次反應(yīng)后只需過濾分離出母液和固定化酯酶，固定化酯酶只需用去離子水沖洗即可重復(fù)再用，本合成過程工藝簡單、操作方便、反應(yīng)時間短、生產(chǎn)效率高、成本低、污染少。
本發(fā)明的創(chuàng)新點：
(1)使用固定化酯酶代替鈀碳和氫氣脫保護(hù)安全無污染。
(2)固定化酯酶可以回收重復(fù)利用，有效降低生產(chǎn)成本。
(3)使用固定化酯酶合成泰拉霉素副反應(yīng)少，收率高，產(chǎn)品純度高。
具體實施方式:
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明，應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利書要求所限定的范圍。
實施例一：
在反應(yīng)燒瓶中加入140ml二氯甲烷，17g(23.1mmol)去甲基阿奇霉素，4.6g(27.6mmol)氯甲酸卞酯，控溫0～5℃反應(yīng)1h，降溫至-80℃，加入二甲基亞砜32g(409.5mol)，滴加三氟乙酸酐16.2g(77.0mmol)，滴畢反應(yīng)30min，滴加三乙胺17.2g(170.0mmol)反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢向體系中加入100ml水萃取，有機(jī)相減壓濃縮后得化合物一23.8g。
在反應(yīng)瓶中加入130mlTHF，20.8g(132mmol)三甲基溴化硫醚,19.6g(175mmol)叔丁醇鉀，-10～15℃進(jìn)行硫葉立德反應(yīng)，反應(yīng)1.5h降溫至-80℃，把化合物二用50ml二氯甲烷溶解后，加入硫葉立德溶液中，-75～-85反應(yīng)2.5h,反應(yīng)完畢把反應(yīng)液倒入200ml飽和氯化銨溶液中萃取分相，有機(jī)相減壓濃縮后得化合物二17g。
在反應(yīng)瓶中加入17g化合物二，240ml水，用1mol/L稀鹽酸調(diào)pH6.8～7.2溶清后，加入2500u的固定化酯酶，用1mol/L稀鹽酸和1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH7.5,保持反應(yīng)溫度15℃反應(yīng)1h，將反應(yīng)液與固定化酯酶過濾分離，固定化酯酶用去離子水沖洗循環(huán)利用，濾液加100ml二氯甲烷，用1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH9.5～10.5，萃取，有機(jī)相減壓濃縮后得到化合物三。加入20g(339mmol)正丙胺，110ml異丙醇65～70℃反應(yīng)12h，減壓濃縮后，加入40ml丙酮溶解，滴加120ml純化水結(jié)晶、養(yǎng)晶1h抽濾，干燥得到泰拉霉素12.3g(15.5mmol)(摩爾收率65％,純度99.8％)。
實施例二：
在反應(yīng)燒瓶中加入140ml二氯甲烷，17g(23.1mmol)去甲基阿奇霉素，4.6g(27.6mmol)氯甲酸卞酯，控溫0-5℃反應(yīng)1h，降溫至-80℃，加入二甲基亞砜32g(409.5mol)，滴加三氟乙酸酐16.2g(77.0mmol)，滴畢反應(yīng)30min，滴加三乙胺17.2g(170.0mmol)反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢向體系中加入100ml水萃取，有機(jī)相減壓濃縮后得化合物一23.5g。
在反應(yīng)瓶中加入130mlTHF，20.8g(132mmol)三甲基溴化硫醚,19.6g(175mmol)叔丁醇鉀，-10～15℃進(jìn)行硫葉立德反應(yīng)，反應(yīng)1.5h降溫至-80℃，把化合物用50ml二氯甲烷溶解后加入硫葉立德溶液中，-75～-85反應(yīng)2.5h,反應(yīng)完畢把反應(yīng)液倒入200ml飽和氯化銨溶液中萃取分相，有機(jī)相減壓濃縮后得化合物二16.5g。
在反應(yīng)瓶中加入16.5g化合物二，240ml水，用1mol/L稀鹽酸調(diào)pH6.8～7.2溶清后，加入3000u的固定化酯酶，用1mol/L稀鹽酸和1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH7.3,保持反應(yīng)溫度15℃反應(yīng)1h，將反應(yīng)液與固定化酯酶過濾分離，固定化酯酶用去離子水沖洗循環(huán)利用，濾液加100ml二氯甲烷，用1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH9.5～10.5，萃取，有機(jī)相減壓濃縮后得到化合物三。加入20g(339mmol)正丙胺，110ml異丙醇65～70℃反應(yīng)12h，減壓濃縮后，加40ml丙酮溶解滴加120ml純化水結(jié)晶、養(yǎng)晶1h抽濾，干燥得到泰拉霉素12.0g(14.6mmol)(摩爾收率63.2％,純度99.6％)。
實施例三：
在反應(yīng)燒瓶中加入140ml二氯甲烷，17g(23.1mmol)去甲基阿奇霉素，4.6g(27.6mmol)氯甲酸卞酯，控溫0-5℃反應(yīng)1h，降溫至-80℃，加入二甲基亞砜32g(409.5mol)，滴加三氟乙酸酐16.2g(77.0mmol)，滴畢反應(yīng)30min，滴加三乙胺17.2g(170.0mmol)反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢向體系中加入100ml水萃取，有機(jī)相減壓濃縮后，得化合物一23.6。
在反應(yīng)瓶中加入130mlTHF，20.8g(132mmol)三甲基溴化硫醚,19.6g(175mmol)叔丁醇鉀，-10～15℃進(jìn)行硫葉立德反應(yīng)，反應(yīng)1.5h降溫至-80℃，把化合物一用50ml二氯甲烷溶解后加入硫葉立德溶液中，-75～-85反應(yīng)2.5h,反應(yīng)完畢把反應(yīng)液倒入200ml飽和氯化銨溶液中萃取分相，有機(jī)相減壓濃縮后，得化合物二17.5g。
在反應(yīng)瓶中加入17g化合物二，240ml水，用1mol/L稀鹽酸調(diào)pH6.8～7.2溶清后，加入3500u的固定化酯酶，用1mol/L稀鹽酸和1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH7.7,保持反應(yīng)溫度15℃反應(yīng)1h，將反應(yīng)液與固定化酯酶過濾分離，固定化酯酶用去離子水沖洗循環(huán)利用，濾液加100ml二氯甲烷，用1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH9.5～10.5，萃取，有機(jī)相減壓濃縮后得到化合物三。加入20g(339mmol)正丙胺，110ml異丙醇65～70℃反應(yīng)12h，減壓濃縮后，加40ml丙酮溶解，滴加120ml純化水結(jié)晶、養(yǎng)晶1h抽濾，干燥得到泰拉霉素11.8g(14.3mmol)(摩爾收率61.9％,純度99.5％)。
實施例四：
在反應(yīng)燒瓶中加入140ml二氯甲烷，17g(23.1mmol)去甲基阿奇霉素，4.6g(27.6mmol)氯甲酸卞酯，控溫0-5℃反應(yīng)1h，降溫至-80℃，加入二甲基亞砜32g(409.5mol)，滴加三氟乙酸酐16.2g(77.0mmol)，滴畢反應(yīng)30min，滴加三乙胺17.2g(170.0mmol)反應(yīng)30min，反應(yīng)完畢向體系中加入100ml水萃取，有機(jī)相減壓濃縮后得化合物一23.8g。
在反應(yīng)瓶中加入130mlTHF，20.8g(132mmol)三甲基溴化硫醚,19.6g(175mmol)叔丁醇鉀，-10～15℃進(jìn)行硫葉立德反應(yīng)，反應(yīng)1.5h降溫至-80℃，把化合物一用50ml二氯甲烷溶解后加入硫葉立德溶液中，-75～-85反應(yīng)2.5h,反應(yīng)完畢把反應(yīng)液倒入200ml飽和氯化銨溶液中萃取分相，有機(jī)相減壓濃縮后得化合物二17g。
在反應(yīng)瓶中加入17g化合物二，240ml水，用1mol/L稀鹽酸調(diào)pH6.8～7.2溶清后，加入2500u的固定化酯酶，用1mol/L稀鹽酸和1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)體系pH7.5,保持反應(yīng)溫度20℃反應(yīng)1h，將反應(yīng)液與固定化酯酶過濾分離，固定化酯酶用去離子水沖洗循環(huán)利用，濾液加100ml二氯甲烷，用1mol/L氫氧化鈉調(diào)pH9.5～10.5，萃取，有機(jī)相減壓濃縮后得到化合物三，加入20g(339mmol)正丙胺，110ml異丙醇65～70℃反應(yīng)12h，減壓濃縮后，加40ml丙酮溶解滴加120ml純化水結(jié)晶、養(yǎng)晶1h抽濾，干燥得到泰拉霉素11.0g(13.3mmol)(摩爾收率57.6％,純度99.4％)。