本發(fā)明公開了一種玉米種皮多糖復合物，具有多重活性成分；同時還提供了該玉米種皮多糖復合物的制備方法，本發(fā)明進一步公開了玉米種皮多糖復合物的醫(yī)療用途，屬于食品、醫(yī)藥、保健品制備
技術領域：
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背景技術：
：植物種皮是種子的保護組織，其含有纖維素、半纖維素、肽聚糖及酚酸等物質；多糖是一種聚合程度不同的糖鏈組成的混合物，不足10個單糖，并多于3個單糖所組成的短糖鏈稱為寡糖，如果蛋白質、脂類等大分子物質結合在寡糖鏈上，整體形成新的高分子化合物，稱為復合多糖；另外，多酚化合物是植物的次生代謝產物，在植物中的含量較為豐富，其中包括連接有糖苷基的多酚化合物。這些物質在同一體系內存在，統(tǒng)稱為多糖復合物，其兼有多糖、多酚及多肽的功能活性。秀麗隱桿線蟲（C.elegans）是一種無毒無害、可以獨立生存的線蟲。自1965年起，科學家SydneyBrenner利用線蟲作為分子生物學和發(fā)育生物學研究領域的模式生物，并于2002年獲得諾貝爾生理醫(yī)學獎。近年來秀麗隱桿線蟲被廣泛應用于抗衰老藥物的篩選及抗衰老分子機制的研究中，主要用于抗衰老藥物生理指標的評價及反映抗衰老機制的生化指標測定，包括壽命、生存率、生存時間、ROS含量以及daf-16，sod-3等基因調控情況研究。復合多糖主要承擔細胞信息功能，在激素、病毒等識別中發(fā)揮重要作用，同時也能作為表面抗原響應免疫應答等,是細胞間信號傳遞的分子基礎，具有一定的生物活性。谷物中的多酚類化合物，均具有良好的清除自由基能力，是一類來源十分廣泛，低毒無毒，危險性很小的天然抗氧化劑，具有抗衰老作用。目前，在玉米生產加工過程中，玉米種皮多作為飼料喂養(yǎng)牲畜之用，甚至廢棄物而丟棄，玉米種皮含有大量的多糖復合物，其潛在的價值沒有被充分利用，造成極大浪費。技術實現要素：本發(fā)明公開了一種玉米種皮多糖復合物，具有抗氧化、抗衰老活性，用于食品、醫(yī)療及保健品領域。本發(fā)明提供了一種玉米種皮多糖復合物的制備方法，制備含有多糖、多肽及多酚成分的生物活性物質復合物。本發(fā)明還公開了一種玉米種皮多糖復合物的醫(yī)療用途，用于抗氧化、抗衰老領域。本發(fā)明所述的一種玉米種皮多糖復合物，其特征在于主要含有以下成分：多糖60-80%，多酚5-7.8%，蛋白10-20%，分子量500Da-21kDa，平均分子量為17-18kDa。本發(fā)明所述的提供了一種玉米種皮多糖復合物的制備方法，包括步驟如下:1）將玉米種皮粉碎80-100目，按1：(6-8）(W/V)的比例加水混合均勻，NaOH調pH值為7制成混合液；2）取步驟1）混合液50-500L，升溫至40℃-45℃，NaOH或檸檬酸調pH值為6.8-7.2，加入脂肪酶40g-400g、蛋白酶38g-380g、淀粉酶30mL-300mL及果膠酶0.5g-5g，反應30-60分鐘；3）將步驟2）反應體系升溫至48℃-52℃，檸檬酸調pH值為6-6.5，加入食品級纖維素酶15mL-150mL，反應60-90分鐘；4）將步驟3）反應體系按1：(7-10）(W/V)的比例加水混合均勻，121℃,0.105PKa,滅菌30-50分鐘；5）待溫度降到90℃以下，進行固液分離，1000-2000轉/分鐘，離心10-20分鐘；6）上清液超濾膜截留0.001-0.005um以下分子量；7）截留的液體利用DEAE52或XAD進行柱層析，保留含有酚羥基層析液；8）對層析液進行分離除鹽；9）除鹽后的液體噴霧干燥或冷凍干燥，得到多糖復合物。對所得的本發(fā)明多糖復合物進行了體外抗氧化活性測定，表明其有明顯的體外抗氧化能力；1）當多糖復合物濃度為12μM時，自由基清（DPPH方法）除率達92-95%；多糖復合物的清除活性是抗壞血酸的8-10倍，阿魏酸的17-19倍。結果證明多糖復合物具有顯著的抗氧化活性，并且在低濃度時即具有良好效果；2）利用FRAP法檢測了多糖復合物的總抗氧化能力，多糖復合物有著良好的還原Fe3+離子的能力，實驗表明，在低濃度(0.15uM)時，多糖復合物還原能力約為Trolox的2000倍左右（0.25mM-0.30mM），在高濃度(2.4uM)時為200倍左右（0.50mM-0.55mM）；本發(fā)明對所得的多糖復合物進行了動物體內抗氧化活性測定，實驗證明MAD、SOD及GSH均為陽性，說明多糖復合物具有抗氧化功能。本發(fā)明對所得的多糖復合物進行了以秀麗隱桿線蟲（C.elegans）為模型，研究其抗衰老能力；實驗結果表明，多糖復合物濃度為1.5mg/mL時，其清除線蟲體內的ROS為50%，在熱激條件和自然條件下分別延長線蟲壽命22-26%和15-18%；本發(fā)明的積極效果在于：利用生物酶解法提取的玉米種皮多糖復合物，含有多糖、多肽及多酚成分，具有抗氧化、抗衰老活性功能，可用于制備抗氧化、抗衰老藥物、保健食品及化妝品等領域，提高了糧食作物的附加值，制備工藝無污染、零排放。附圖說明：圖1為本發(fā)明實例1制備的多糖復合物FT-IR紅外光譜檢測結果；圖2為本發(fā)明實例2制備的多糖復合物FT-IR紅外光譜檢測結果；圖3為本發(fā)明實例3制備的多糖復合物FT-IR紅外光譜檢測結果。具體實施方式通過以下實施例進一步舉例描述本發(fā)明，并不以任何方式限制本發(fā)明，在不背離本發(fā)明的技術解決方案的前提下，對本發(fā)明所做的本領域普通技術人員容易實現的任何改動或改變都將落入本發(fā)明的權利要求范圍之內。實施例1玉米多糖復合物的制備：1）將玉米種皮粉碎80目，按1：6(W/V)的比例加水混合均勻，NaOH調pH值為7制成混合液；2）取步驟1）混合液50L，升溫至40℃-45℃，NaOH調pH值為6.8-7.2，加入脂肪酶40g,蛋白酶38g,淀粉酶30mL,果膠酶0.5g，反應30分鐘；3）將步驟2）反應體系升溫至48℃，檸檬酸調pH值為6，加入食品級纖維素酶15mL，反應60分鐘；4）將步驟3）反應體系按1：7(W/V)的比例加水混合均勻，121℃,0.105PKa,滅菌30分鐘；5）待溫度降到90℃以下，進行固液分離，2000轉/分鐘，離心10分鐘；6）上清液超濾膜截留0.001-0.005um以下分子量；7）截留的液體利用DEAE52或XAD進行柱層析，保留含有酚羥基層析液；8）對層析液500分子量透析除鹽；9）截留除鹽后的液體冷凍干燥，得到多糖復合物；10）利用DNS比色定糖法測定多糖復合物中糖含量；利用Folin-Ciocalteu法測定多糖復合物中多酚含量；采用德國Elementar公司的VarioMicrocube型元素分析儀測定多糖復合物中C、H、N、S元素的含量，多糖復合物含有多糖73%，多酚7.6%，多肽15.7%；11）多糖復合物FT-IR紅外檢測，取適量多糖復合物樣品置于瑪瑙研缽中，與等量的KBr研磨混合均勻。壓片后，置于Nicolet5700傅立葉紅外光譜儀（ThermoFisher.USA）上進行檢測。掃描范圍4000-500；ATR池；窗口材料為錫鋅。結果見圖1。實施例21）將玉米種皮粉碎90目，按1：7(W/V)的比例加水混合均勻，NaOH調pH值為7制成混合液；2）取步驟1）混合液100L，升溫至45℃，檸檬酸調pH值為7.0，加入脂肪酶100g、蛋白酶180g、淀粉酶100mL及果膠酶3g，反應40分鐘；3）將步驟2）反應體系升溫至50℃，檸檬酸調pH值為6.5，加入食品級纖維素酶100mL，反應80分鐘；4）將步驟3）反應體系按1：8(W/V)的比例加水混合均勻，121℃,0.105PKa,滅菌50分鐘；5）待溫度降到90℃以下，進行固液分離，2000轉/分鐘，離心10分鐘；6）上清液超濾膜截留0.001-0.005um以下分子量；7）截留的液體利用DEAE52或XAD進行柱層析，保留含有酚羥基層析液；8）對層析液進行500分子量透析除鹽；9）截留除鹽后的液體冷凍干燥，得到多糖復合物；10）利用DNS比色定糖法測定多糖復合物中糖含量；利用Folin-Ciocalteu法測定多糖復合物中多酚含量；采用德國Elementar公司的VarioMicrocube型元素分析儀測定多糖復合物中C、H、N、S元素的含量，多糖復合物含有多糖74.1%，多酚7.5%，多肽15.8%；11）多糖復合物FT-IR紅外檢測，取適量多糖復合物樣品置于瑪瑙研缽中，與等量的KBr研磨混合均勻。壓片后，置于Nicolet5700傅立葉紅外光譜儀（ThermoFisher.USA）上進行檢測。掃描范圍4000-500；ATR池；窗口材料為錫鋅，結果見圖2。實施例31）將玉米種皮粉碎100目，按1：8(W/V)的比例加水混合均勻，NaOH調pH值為7制成混合液；2）取步驟1）混合液500L，升溫至45℃，檸檬酸調pH值為7.2，加入脂肪酶400g、蛋白酶380g、淀粉酶300mL及果膠酶5g，反應60分鐘；3）將步驟2）反應體系升溫至52℃，檸檬酸調pH值為6.5，加入食品級纖維素酶150mL，反應90分鐘；4）將步驟3）反應體系按1：10(W/V)的比例加水混合均勻，121℃,0.105PKa,滅菌50分鐘；5）待溫度降到90℃以下，進行固液分離，2000轉/分鐘，離心20分鐘；6）上清液超濾膜截留0.001um以下分子量；7）截留的液體利用DEAE52或XAD進行柱層析，保留含有酚羥基層析液；8）對層析液進行500分子量透析除鹽；9）除鹽后的液體噴霧干燥或冷凍干燥，即得；10）利用DNS比色定糖法測定多糖復合物中糖含量；利用Folin-Ciocalteu法測定多糖復合物中多酚含量；采用德國Elementar公司的VarioMicrocube型元素分析儀測定多糖復合物中C、H、N、S元素的含量，多糖復合物含有多糖75%，多酚7.8%，多肽15.5%；11）多糖復合物FT-IR紅外檢測，取適量多糖復合物樣品置于瑪瑙研缽中，與等量的KBr研磨混合均勻。壓片后，置于Nicolet5700傅立葉紅外光譜儀（ThermoFisher.USA）上進行檢測。掃描范圍4000-500；ATR池；窗口材料為錫鋅,結果見圖3。實驗例1玉米多糖復合物的清除DPPH自由基能力實驗實驗方法：分別量取2、4、6、8、10、12μM的多糖復合物樣品溶液500μL，加入等體積的DPPH溶液，在室溫下避光反應1h；對照組：分別量取濃度為16、32、62.5、125、250、500μM的抗壞血酸（Vc）和阿魏酸（Fa）溶液作為陽性對照；參比組：500uL去離子水與500uLDPPH溶液的混合溶液，并以500μL無水乙醇與500μL去離子水的混合溶液調節(jié)吸光度零點，在波長517nm處測量吸光度值。清除率按照如下公式計算：清除率(%)=1-（A實驗/A參比）×100%實驗結果如下：利用實例1、實例2、實例3制備的多糖復合物濃度為12μM時，測定其清除能力如表1所示，實驗結果表明三批樣品在相同濃度下，其清除自由基的能力都達到92%以上；多糖復合物、抗壞血酸和阿魏酸清除DPPH自由基的EC50值分別為2.84μM、27.53μM和52.36μM，即多糖復合物的清除活性是抗壞血酸的9倍以上，阿魏酸的18倍以上，具有良好的應用前景，相關研究國內外未見報道。表1不同批次玉米多糖復合物的清除DPPH自由基能力測試結果樣品抗壞血酸阿魏酸實例1實例2實例3清除率（%）1009094.394.995EC50值（μM）27.5352.362.842.822.86實驗例2玉米多糖復合物總抗氧化能力測定實驗實驗方法：分別量取0.15、0.3、0.6、1.2、2.4μM的多糖復合物溶液5μL作為底物，加入180μL的FRAP工作液，37℃孵育5min后，在波長593nm處測定其吸光度值，依據標準曲線計算出多糖復合物總抗氧化能力。實驗結果如表2所示，不同批次玉米多糖復合物有著良好的還原Fe3+離子的能力，利用Trolox為陽性對照，玉米多糖復合物總抗氧化能力以Trolox當量濃度表示；當不同批次玉米多糖復合物濃度都為0.15μM時，其還原能力相當于0.28mM-0.30mMTrolox，并且隨著濃度增長呈現出較好的濃度依賴性，當濃度為2.4μM時相當于0.52-0.55mMTrolox，實驗證明，玉米多糖復合物具有體外抗氧化作用，相關研究國內外未見報道。表2不同批次玉米多糖復合物的總抗氧化能力測試結果實驗例3玉米多糖復合物動物體內抗氧化能力檢測實驗方法（1）抗氧化模型建立方法選取25－30g健康成年小鼠，隨機分為5個組，1個空白對照組，1個模型對照組和3個受試樣品劑量組，3個劑量組給予不同濃度（高劑量800ug/g；中劑量400ug/g；低劑量200ug/g）受試樣品，模型對照組給予同體積溶劑，連續(xù)灌胃40天，末次灌胃后，空白對照組和模型組對照組以及3個劑量組禁食16小時（過夜），然后1次性灌胃給予50%乙醇12mL/kgBW，6小時后取材（空白對照組不作處理），測血清中脂質氧化產物含量還原性谷胱甘肽(GSH)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活力。（2）MDA含量測定機體產生的氧自由基能攻擊細胞生物膜中的多不飽和脂肪酸，引發(fā)脂質過氧化反應而生成脂質過氧化物，其中有丙二醛（MDA）。采用硫代巴比妥酸顯色法進行檢測。丙二醛（MDA）能與硫代巴比妥酸（TBA）發(fā)生縮合反應，形成紅色產物，在532nm處有最大吸收峰。因底物為硫代巴比妥酸（TBA），故稱為TBA法。MDA的測定常常與SOD的測定相配合，SOD活力的大小間接反應了細胞清除氧自由基的能力大小，而MDA含量的多少間接反應了細胞受自由基攻擊的嚴重程度。（3）SOD活性測定采用黃嘌呤氧化酶法進行檢測。通過黃嘌呤及黃嘌呤氧化酶反應產生超氧化物（O2??），后者氧化羥胺形成亞硝酸鹽，在顯色劑的作用下呈現紫紅色，可用可見光分光光度計檢測其吸光度。當被測樣品含SOD時，則對O2??有專一性的抑制作用，使形成的亞硝酸鹽減少，比色時測定管的吸光度低于對照管的吸光度，通過公式計算可求出被測樣品中SOD的活力。（4）GSH活性測定還原型谷胱甘肽（GSH），它能與二硫代二硝基苯甲酸（DTNB）反應，生成一種黃色化合物，在405nm處測其吸光度即可計算出GSH的量法進行檢測。GSH具有良好的解毒、自由基清除、維持紅細胞膜的完整性以及加快鐵質的吸收等多重重要生理功能。另外，它還是一種低分子清除劑，能夠很好的對O2-、H2O2以及LOOH進行清除，因此GSH量的高低是衡量機體或細胞抗氧化能力高低的重要因素。目前，利用試劑盒可以直接對GSH進行檢測，通過測定OD值，依照公式計算可求出被測樣品中GSH的活力。以上MDA,SOD,GSH三個指標均使用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒測定。實驗結果：分別利用實例1、實例2、實例3制備的多糖復合物，按照低劑量（200ug/g）、中劑量（400ug/g）、高劑量（800ug/g）三種濃度灌胃小鼠40天后，按照保健食品功能檢測方法建立抗氧化模型，50%乙醇灌胃模型小鼠及多糖復合物灌胃小鼠，其模型組與空白對照組（沒有利用乙醇損傷）相比，MDA值的增加了4.9倍；灌胃三種不同濃度的多糖復合物小鼠，其MDA值增加分別是3.9倍、2.4倍及1.5倍，實驗證明多糖復合物具有一定減少MDA生成的作用；其SOD活性下降25.4%；灌胃三種不同濃度的多糖復合物小鼠，其SOD活性下降分別是19.3%、10.4%及5.8%，實驗證明多糖復合物具有一定減少SOD活性降低的作用；其GSH活性下降33.7%；灌胃三種不同濃度的多糖復合物小鼠，其GSH活性下降分別是14.5%、13.6%及3.6%，實驗證明多糖復合物具有一定減少GSH活性降低的作用，具體見表3所示，所有數據均有統(tǒng)計學意義。實驗證明玉米多糖復合物在動物體內MDA、SOD及GSH值，均為陽性，其具有抗氧化活性，相關研究國內外未見報道。表3不同批次玉米多糖復合物在動物體內抗氧化能力測試結果實驗例4玉米多糖復合物的抗衰老活性研究實驗方法：多糖復合物對線蟲壽命的影響1.熱激實驗分別取同期化完成的成蟲35只（蟲齡4days）置于給多糖復合物與空白NGM(稱取3gNaCl、17g瓊脂、2.5g蛋白胨、加入975mL去離子水，高壓蒸汽滅菌，待溶液冷卻至55℃后，加入無菌1mL1MCaCl2、1mL1MMgSO4、25mL磷酸鉀緩沖液，最后加入1mL5mg/mL膽固醇，搖勻)培養(yǎng)基上。培養(yǎng)兩天，每天更換新板。兩天后，將平板放入35℃培養(yǎng)箱中，每小時計數線蟲的死亡量。線蟲的死亡以觸碰線蟲后30s內體式顯微鏡下觀察不到蟲體的應激動作或咽部收縮消失為準。2.自然條件壽命實驗分別取35只同期化后的線蟲，置于給藥與空白的NGM平板上。每天將線蟲轉移至對應的新鮮NGM平板上并統(tǒng)計存活線蟲數目，直至線蟲全部死亡。線蟲的死亡以觸碰線蟲后30s內體式顯微鏡下觀察不到蟲體的應激動作或咽部收縮消失為準。實驗結果：分別利用實例1、實例2、實例3制備的多糖復合物，熱激條件下多糖復合物對線蟲壽命的影響機體在受到外界刺激（如熱刺激）時，會迅速產生大量的ROS。在35℃熱應激條件下，野生型線蟲僅能存活8小時左右。給多糖復合物2天后，在熱激條件下，可以延長線蟲壽命分別為22%，23%及25%，效果顯著。分別利用實例1、實例2、實例3制備的多糖復合物，自然條件下多糖復合物對線蟲壽命的影響，當線蟲處于自然生長的條件時（20℃，食物充足），從線蟲齡4天開始給多糖復合物，到蟲齡6天即出現明顯差異，多糖復合物亦能夠顯著延長線蟲壽命分別為16.2%、16.8%、16.9%效果顯著。當前第1頁1 2 3