本發(fā)明涉及一種南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中游離脂肪酸的提取及檢測方法，屬于食品和化工技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

南極磷蝦(Euphausia superba)又名大磷蝦或南極大磷蝦，隸屬節(jié)肢動物門、甲殼綱、磷蝦目，是南大洋生態(tài)系統(tǒng)食物鏈中的關(guān)鍵物種，是地球上數(shù)量最大、繁衍最成功的單種生物資源之一。南極磷蝦生物蘊(yùn)藏量最新估計為3.42～5.36億噸，年可持續(xù)捕撈量將近1億噸，相當(dāng)于目前全世界魚類和其他水產(chǎn)捕獲量的總和，世界各國都將南極磷蝦作為重要的戰(zhàn)略生物資源。

南極磷蝦不僅蘊(yùn)藏量十分驚人，而且營養(yǎng)價值極高。南極磷蝦含油脂較多。油脂中含有豐富的Ω-3不飽和脂肪酸二十碳五烯酸(EPA)和二十碳六烯酸(DHA)。將南極磷蝦油脂與其他所有動植物油脂比較發(fā)現(xiàn)，南極磷蝦油脂具有極為突出的特點(diǎn)：南極磷蝦磷脂含量高，占油脂含量的35-41％(其他動植物磷脂一般占其油脂含量的2％)；南極磷蝦磷脂中磷脂酰膽堿(PC)含量極高，占磷脂含量的80％以上(其他動植物PC一般占其磷脂含量的15-24％)，除PC外，其他的磷脂為磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酸(PA)等等。

南極磷蝦在頭、背、尾部及肢與軀干交接處的甲殼之下油脂成顆粒分布，在頭背部甲殼下分布更為集中，肉眼可見，呈紅色顆粒狀(見圖1)。去甲殼后進(jìn)行電鏡掃描可發(fā)現(xiàn)這些物質(zhì)是一個個各自獨(dú)立的脂質(zhì)顆粒(見圖2)。兩種或兩種以上的分子通過非共價鍵相互作用自組裝成的聚集體即是超分子體系。經(jīng)本課題組研究發(fā)現(xiàn)，該甲殼下脂質(zhì)顆粒即是由多種物質(zhì)組成的聚集體。因此，南極磷蝦甲殼下脂質(zhì)顆粒其存在狀態(tài)完全不同于其他任何一種生物體，它是一個獨(dú)特的、自組裝的脂類超分子體系。

目前尚未有關(guān)于從南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中提取及檢測游離脂肪酸的報道。因此，有必要建立一種針對南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中游離脂肪酸的提取及檢測方法，以便于對南極磷蝦資源的開發(fā)利用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一種南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中游離脂肪酸的提取方法。

本發(fā)明的另一目的是提供一種南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中游離脂肪酸的檢測方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：

本發(fā)明的第一方面，提供一種南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中游離脂肪酸的提取方法，步驟如下：

(1)分別將南極磷蝦頭部、背部和尾部的脂質(zhì)超分子體系剝離，向剝離后的脂質(zhì)超分子體系中加入乙醇溶液，過濾，收集濾液，濾渣用乙醇洗滌，將洗滌液和濾液合并，得超分子體系油脂溶液；

(2)將超分子體系油脂溶液進(jìn)行濃縮處理，得超分子體系油脂膏體；

(3)將超分子體系油脂膏體用丙酮溶解，攪拌均勻，離心，分離上清液，除去上清液中的丙酮，即提取得到游離脂肪酸。

步驟(1)中，南極磷蝦在進(jìn)行脂質(zhì)超分子體系剝離前，南極磷蝦鮮蝦優(yōu)選在-45℃～-80℃條件下冷凍處理，然后在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5％的鹽水(氯化鈉水溶液)中解凍。將南極磷蝦在-45℃～-80℃條件下冷凍處理，一方面可以保證南極磷蝦的脂質(zhì)超分子體系的品質(zhì)，另一方面，經(jīng)冷凍處理后，有利于南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系的剝離。

步驟(1)中，所述乙醇溶液的體積分?jǐn)?shù)為95-100％。該步驟中加入的乙醇主要有兩方面的作用，其一，將剝離的脂質(zhì)超分子體系溶解；其二，脂質(zhì)超分子體系在剝離過程中會附著部分軟膜，通過乙醇溶液可以將軟膜沉淀除去。需要說明的是，溶劑的選擇是該步驟處理的關(guān)鍵，經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，選擇體積分?jǐn)?shù)為95-100％的乙醇溶液作為溶劑能夠有效的將脂質(zhì)超分子體系溶解，并同時能將附著的軟膜去除。

步驟(1)中，乙醇溶液與脂質(zhì)超分子體系加入量的比為(4-6)ml：1g；優(yōu)選的，乙醇溶液與脂質(zhì)超分子體系加入量的比為5ml：1g。乙醇溶液與脂質(zhì)超分子體系加入量的比會影響脂質(zhì)超分子體系處理的效果和成本，若乙醇溶液的加入量過少，則會導(dǎo)致脂質(zhì)超分子體系溶解不完全；若乙醇溶液的加入量過多，則會增加處理的成本，經(jīng)多次試驗(yàn)驗(yàn)證，并綜合考慮處理的效果與成本，發(fā)現(xiàn)乙醇溶液與脂質(zhì)超分子體系加入量的比以(4-6)ml：1g為宜。

步驟(2)中，濃縮處理的條件為：40-50℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干。

步驟(3)中，超分子體系油脂膏體與丙酮加入量的比為(3-4)g：50ml。該步驟中加入丙酮的目的是除去超分子體系油脂膏體中的磷脂。

步驟(3)中，離心的條件為：3000r/min下離心2-4min。

本發(fā)明的第二方面，提供一種南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中游離脂肪酸的檢測方法，步驟如下：

(1)采用上述方法從南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中提取游離脂肪酸；

(2)將提取的游離脂肪酸用無水乙醇溶解，配成的溶液，混合均勻，過濾，得到澄清透明液體作為待測樣品；

(3)將待測樣品按照常規(guī)的游離脂肪酸檢測方法進(jìn)行檢測。

優(yōu)選的，步驟(2)中，配成的溶液濃度為10mg/ml。

優(yōu)選的，步驟(2)中，過濾的條件為：采用0.22μm針式過濾器過濾，每次過濾3～5mL的溶劑，過濾1～3次。

優(yōu)選的，步驟(3)中，采用游離脂肪酸(NEFA)試劑盒進(jìn)行檢測。

需要說明的是，對于南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中游離脂肪酸的提取及檢測而言，目前并沒有相關(guān)的文獻(xiàn)報道，屬于一個全新的領(lǐng)域。在南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中具體含有哪些成分，如何進(jìn)行提取分離？這些在現(xiàn)有技術(shù)中均未有記載，這也就極大的增加了本發(fā)明技術(shù)方案提出的難度。

本發(fā)明的有益效果：

(1)本發(fā)明系首次從南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中提取得到了游離脂肪酸，所需的試劑的種類少，數(shù)量小，降低了提取成本，減小了對環(huán)境的污染，有利于南極磷蝦資源的開發(fā)利用。

(2)本發(fā)明的南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中游離脂肪酸的提取方法，首先選擇體積百分?jǐn)?shù)為95-100％的乙醇溶液對南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系進(jìn)行溶解處理，溶解處理的同時還將脂質(zhì)超分子體系所附著的軟膜沉淀去除；再通過丙酮將脂質(zhì)超分子體系中的磷脂去除，從而提取得到游離脂肪酸。上述各工藝步驟是一個有機(jī)的整體，互為條件，形成了一條全新的從南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中提取游離脂肪酸的工藝流程。

附圖說明

圖1：南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系(甲殼下脂質(zhì)顆粒)的分布圖；

圖2：去殼后脂質(zhì)顆粒的電鏡掃描圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，應(yīng)該說明的是，下述實(shí)施例僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內(nèi)容進(jìn)行限定。

實(shí)施例1：南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中游離脂肪酸的提取及檢測

1.游離脂肪酸的提取

具體步驟如下：

(1)取少量-80℃冷凍保存的南極磷蝦放在5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的鹽水中解凍，解凍完全后取南極磷蝦在顯微鏡下觀察其脂質(zhì)超分子體系的分布和形態(tài)，然后將其頭部、背部、尾部的脂質(zhì)超分子體系分別剝離到3個50mL的做好標(biāo)記的燒杯中，按溶液：溶質(zhì)為5ml：1g在燒杯中倒入無水乙醇，液體呈橙紅色。

(2)將橙紅色溶液過濾，收集濾液。向?yàn)V渣中每次倒入無水乙醇20mL，清洗殘渣1次，至溶液無色后將每次清洗的濾液合并。

(3)在45℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到頭部、背部、尾部脂質(zhì)超分子體系油脂膏體，分別為3.62g、3.02g、3.18g。

(4)將所得到的頭部、背部、尾部南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系油脂膏體分別溶于50mL丙酮，磁力攪拌10min后在3000r/min下離心3min，將上清液倒出，每次以20mL丙酮清洗沉淀1～2次，磁力攪拌和離心的條件同上，將每次離心的上清液混合，在45℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去丙酮，即得到從南極磷蝦的頭部、背部、尾部的脂質(zhì)超分子體系中提取的游離脂肪酸，將它們4℃遮光保存。

2.游離脂肪酸的檢測

具體步驟如下：

(1)分別取從南極磷蝦的頭部、背部、尾部的脂質(zhì)超分子體系中提取的游離脂肪酸4.48mg、4.92mg、3.71mg溶于無水乙醇中配成10mg/mL的溶液，并在渦旋振蕩器上2000r/min震動10s使其充分混勻。

(2)將充分混勻的南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系油脂用有機(jī)系0.22μm針式過濾器過濾，每次過濾4mL的溶劑，過濾2次，得到澄清透明的液體作為待測樣品。

(3)按照游離脂肪酸(NEFA)試劑盒的操作步驟對待測樣品進(jìn)行檢測，具體操作為：

1)取5支帶蓋的玻璃磨口試管進(jìn)行編號；

2)向1號管中加入0.2mL的雙蒸水、0.5mL的試劑二緩沖液、1.0mL的試劑三銅試劑、4.0mL的試劑一作為空白管；向2號管中加入0.2mL的雙蒸水、0.2mL的棕櫚酸標(biāo)準(zhǔn)品、0.5mL的試劑二緩沖液、1.0mL的試劑三銅試劑、3.8mL的試劑一作為標(biāo)準(zhǔn)管；向3號管中加入0.2mL的南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系頭部樣品溶液、0.5mL的試劑二緩沖液、1.0mL的試劑三銅試劑、4.0mL的試劑一作為測定管1；向4號管中加入0.2mL的南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系背部樣品溶液、0.5mL的試劑二緩沖液、1.0mL的試劑三銅試劑、4.0mL的試劑一作為測定管2；向3號管中加入0.2mL的南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系尾部樣品溶液、0.5mL的試劑二緩沖液、1.0mL的試劑三銅試劑、4.0mL的試劑一作為測定管3。

3)充分抽提2min，2500r/min離心10min，仔細(xì)吸去上層藍(lán)色液體棄之，吸取下層抽提液進(jìn)行顯色。

4)用移液槍準(zhǔn)確吸去2mL下層抽提液加入另一試管中，加0.25mL顯色劑混勻，室溫放置2min，在440nm，1cm光徑下測量并記錄其吸光度。

5)根據(jù)游離脂肪酸(NEFA)試劑盒說明書提供的計算公式計算出南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系頭部、背部、尾部各部位的游離脂肪酸濃度分別為17559.7umol/L、15247umol/L、18980.3umol/L。

實(shí)施例2：南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中游離脂肪酸的提取及檢測

1.游離脂肪酸的提取

(1)取少量-80℃冷凍保存的南極磷蝦放在5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的鹽水中解凍，解凍完全后取南極磷蝦在顯微鏡下觀察其脂質(zhì)超分子體系的分布和形態(tài)，然后將其頭部、背部、尾部的脂質(zhì)超分子體系分別剝離到3個50mL的做好標(biāo)記的燒杯中，按溶液：溶質(zhì)為4ml：1g在燒杯中倒入無水乙醇，液體呈橙紅色。

(2)將橙紅色溶液過濾，收集濾液。向?yàn)V渣中每次倒入無水乙醇20mL，清洗殘渣2次，至溶液無色后將每次清洗的濾液合并。

(3)在45℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到頭部、背部、尾部脂質(zhì)超分子體系油脂膏體，分別為3.58g、3.04g、3.15g。

(4)將所得到的頭部、背部、尾部南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系油脂膏體分別溶于50mL丙酮，磁力攪拌10min后在3000r/min下離心3min，將上清液倒出，每次以20mL丙酮清洗沉淀1～2次，磁力攪拌和離心的條件同上，將每次離心的上清液混合，在45℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去丙酮，即得到從南極磷蝦的頭部、背部、尾部的脂質(zhì)超分子體系中提取的游離脂肪酸，將它們4℃遮光保存。

2.游離脂肪酸的檢測

具體步驟如下：

(1)分別取從南極磷蝦的頭部、背部、尾部的脂質(zhì)超分子體系中提取的游離脂肪酸4.36mg、4.75mg、3.98mg溶于無水乙醇中配成10mg/mL的溶液，并在渦旋振蕩器上2000r/min震動10s使其充分混勻。

(2)將充分混勻的南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系油脂用有機(jī)系0.22μm針式過濾器過濾，每次過濾4mL的溶劑，過濾2次，得到澄清透明的液體作為待測樣品。

(3)按照游離脂肪酸(NEFA)試劑盒的操作步驟對待測樣品進(jìn)行檢測，具體操作同實(shí)施例1。

根據(jù)游離脂肪酸(NEFA)試劑盒說明書提供的計算公式計算出南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系頭部、背部、尾部各部位的游離脂肪酸濃度分別為16986.3umol/L、15012.5umol/L、19124.3umol/L。

實(shí)施例3：南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中游離脂肪酸的提取及檢測

1.游離脂肪酸的提取

(1)取少量-80℃冷凍保存的南極磷蝦放在5％(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的鹽水中解凍，解凍完全后取南極磷蝦在顯微鏡下觀察其脂質(zhì)超分子體系的分布和形態(tài)，然后將其頭部、背部、尾部的脂質(zhì)超分子體系分別剝離到3個50mL的做好標(biāo)記的燒杯中，按溶液：溶質(zhì)為6ml：1g在燒杯中倒入無水乙醇，液體呈橙紅色。

(2)將橙紅色溶液過濾，收集濾液。向?yàn)V渣中每次倒入無水乙醇20mL，清洗殘渣3次，至溶液無色后將每次清洗的濾液合并。

(3)在45℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，得到頭部、背部、尾部脂質(zhì)超分子體系油脂膏體，分別為3.65g、3.06g、3.22g。

(4)將所得到的頭部、背部、尾部南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系油脂膏體分別溶于50mL丙酮，磁力攪拌10min后在3000r/min下離心3min，將上清液倒出，每次以20mL丙酮清洗沉淀1～2次，磁力攪拌和離心的條件同上，將每次離心的上清液混合，在45℃溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，除去丙酮，即得到從南極磷蝦的頭部、背部、尾部的脂質(zhì)超分子體系中提取的游離脂肪酸，將它們4℃遮光保存。

2.游離脂肪酸的檢測

具體步驟如下：

(1)分別取從南極磷蝦的頭部、背部、尾部的脂質(zhì)超分子體系中提取的游離脂肪酸4.52mg、4.87mg、3.66mg溶于無水乙醇中配成10mg/mL的溶液，并在渦旋振蕩器上2000r/min震動10s使其充分混勻。

(2)將充分混勻的南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系油脂用有機(jī)系0.22μm針式過濾器過濾，每次過濾4mL的溶劑，過濾2次，得到澄清透明的液體作為待測樣品。

(3)按照游離脂肪酸(NEFA)試劑盒的操作步驟對待測樣品進(jìn)行檢測，具體操作同實(shí)施例1。

根據(jù)游離脂肪酸(NEFA)試劑盒說明書提供的計算公式計算出南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系頭部、背部、尾部各部位的游離脂肪酸濃度分別為18452.3umol/L、14973.2umol/L、17937.8umol/L。

對比例1：

在游離脂肪酸提取的步驟(1)中，將無水乙醇替換為甲醇，其余操作同實(shí)施例1，經(jīng)檢測，提取得到的南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系頭部、背部、尾部各部位的游離脂肪酸濃度分別為13647.2umol/L、12367.4umol/L、13553.8umol/L。

對比例2：

在游離脂肪酸提取的步驟(1)中，將無水乙醇替換為體積分?jǐn)?shù)為70％的乙醇，其余操作同實(shí)施例1，經(jīng)檢測，提取得到的南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系頭部、背部、尾部各部位的游離脂肪酸濃度分別為13584.6umol/L、12493.2umol/L、13602.3umol/L。

由上述對比例可以看出，在游離脂肪酸的提取過程中，替換不同的提取溶劑，或改變提取溶劑的體積分?jǐn)?shù)，則會直接影響南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中游離脂肪酸的提取效率。與對比例1-2相比，采用本發(fā)明的提取方法，能夠顯著的提高南極磷蝦脂質(zhì)超分子體系中游離脂肪酸的提取量。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。