本發(fā)明涉及生物制劑的技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種酶法輔助提取鐵皮石斛多糖的方法。
背景技術(shù)：
鐵皮石斛是蘭科草本植物，適宜在涼爽、濕潤(rùn)、空氣暢通的環(huán)境生長(zhǎng)，分布于我國(guó)安徽西南部、浙江東部、福建西部、廣西西北部、四川和云南東南部等，是傳統(tǒng)名貴中藥材。鐵皮石斛，古已有之，素有“千金草”、“軟黃金”和“植物黃金”之盛譽(yù)，是石斛之極品，因表皮呈鐵綠色而得名。鐵皮石斛具有獨(dú)特的藥用價(jià)值，其主要藥用部位是新鮮或干燥莖，其味甘，性微寒，具有益胃生津，滋陰清熱，潤(rùn)肺益腎之功效。鐵皮石斛主要藥效成分是多糖，并含有豐富的氨基酸和微量元素，其中多糖是鐵皮石斛中最主要的有效成分和特征性成分。鐵皮石斛多糖具有較強(qiáng)的抗衰老、抗氧化、抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等藥理活性。目前，鐵皮石斛的市場(chǎng)需求持續(xù)旺盛，但其野生資源有限，加之鐵皮石斛生境不斷遭受破壞，導(dǎo)致鐵皮石斛野生資源瀕臨滅絕，無(wú)法滿足市場(chǎng)需求。因此，應(yīng)設(shè)法提高鐵皮石斛多糖提取率才能滿足市場(chǎng)要求。
有鑒于此，本發(fā)明人研究和設(shè)計(jì)了一種酶法輔助提取鐵皮石斛多糖的方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明涉及一種酶法輔助提取鐵皮石斛多糖的方法，即通過(guò)α-L-鼠李糖苷酶輔助提取鐵皮石斛多糖。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明解決其技術(shù)問(wèn)題的技術(shù)方案是：
一種酶法輔助提取鐵皮石斛多糖的方法，包括以下步驟：
步驟一、酶液發(fā)酵：將含有α-L-鼠李糖苷酶基因的畢赤酵母GS115接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中進(jìn)行活化后，轉(zhuǎn)入BMGY培養(yǎng)基中繼續(xù)活化，收集OD600為2.0-3.0的菌體，并轉(zhuǎn)入到BMMY培養(yǎng)基中，置于30°C誘導(dǎo)表達(dá)；每隔24 h加無(wú)菌甲醇誘導(dǎo)表達(dá)7天，離心收集酶液；
步驟二、酶制劑制備：設(shè)定噴霧壓力為0.2 Mpa，進(jìn)風(fēng)溫度為135°C，進(jìn)風(fēng)速度為4 m3/min，進(jìn)料速率為800 ml/h，100 mLα-L-鼠李糖苷酶酶液加入15 g的麥芽糊精，進(jìn)行噴霧干燥制備α-L-鼠李糖苷酶酶制劑；
步驟三、酶處理：將鐵皮石斛浸泡于8-20倍水中，再添加0.5%-2%的α-L-鼠李糖苷酶酶制劑，并在50°C-60°C中溫浴0.5 h-1.5 h；
步驟四、水提：將步驟三得到的溶液進(jìn)行兩次水提，第一次加水量為鐵皮石斛質(zhì)量的1-5倍，水提時(shí)間為0.5 h-2.5 h；第二次加水量為鐵皮石斛質(zhì)量的1-6倍，水提時(shí)間為0.5 h -1.5 h；
步驟五、濃縮及醇沉：將步驟四得到的鐵皮石斛多糖水提液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，然后加入3倍濃縮液體積的無(wú)水乙醇，靜置15 h，然后過(guò)濾得到不溶物，將不溶物干燥后即可得到鐵皮石斛多糖。
優(yōu)選地，步驟三中，水與鐵皮石斛的質(zhì)量比為8：1。
優(yōu)選地，步驟三中，酶制劑的添加量為0.5%。
優(yōu)選地，步驟三中，酶解溫度為50°C，酶解時(shí)間為1.5 h。
優(yōu)選地，步驟四中，水提兩次，第一次加水量為鐵皮石斛質(zhì)量的1倍，水提時(shí)間為2.5 h；第二次加水量為鐵皮石斛質(zhì)量的6倍，水提時(shí)間為1.5 h。
本發(fā)明的技術(shù)效果是：加入α-L-鼠李糖苷酶酶制劑可以提高鐵皮石斛多糖的提取率，可使多糖的提取率與不加酶處理的最高提高65.36%；與其他方法相比，酶法輔助提取多糖條件溫和，操作方便，經(jīng)濟(jì)節(jié)約，效果明顯，為鐵皮石斛多糖的商品化應(yīng)用提供一定的基礎(chǔ)。
具體實(shí)施方式
本發(fā)明的實(shí)施例以酶法輔助提高鐵皮石斛多糖的提取率的方法說(shuō)明本發(fā)明的工藝，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于此：
實(shí)施例1：
步驟一、酶液發(fā)酵：將含有α-L-鼠李糖苷酶基因的畢赤酵母GS115接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基中進(jìn)行活化后，轉(zhuǎn)入BMGY培養(yǎng)基中繼續(xù)活化，收集OD600為2.0-3.0的菌體，并轉(zhuǎn)入到BMMY培養(yǎng)基中，置于30°C誘導(dǎo)表達(dá)；每隔24 h加無(wú)菌甲醇誘導(dǎo)表達(dá)7天，離心收集酶液。所述YPD培養(yǎng)基、BMGY培養(yǎng)基及BMMY培養(yǎng)基均為培養(yǎng)酵母菌的常規(guī)培養(yǎng)基。
步驟二、酶制劑制備：設(shè)定噴霧壓力為0.2 Mpa，進(jìn)風(fēng)溫度為135°C，進(jìn)風(fēng)速度為4 m3/min，進(jìn)料速率為800 ml/h，100 mLα-L-鼠李糖苷酶酶液加入15 g的麥芽糊精，進(jìn)行噴霧干燥制備α-L-鼠李糖苷酶酶制劑。
實(shí)施例2：
步驟一、酶處理：將鐵皮石斛浸泡于40倍水中，再添加1%的α-L-鼠李糖苷酶酶制劑，并在50°C中溫浴1.5 h；
步驟二、水提：將步驟一得到的溶液進(jìn)行兩次水提，第一次加水量為鐵皮石斛質(zhì)量的4倍，水提時(shí)間為0.5 h；第二次加水量為鐵皮石斛質(zhì)量的2倍，水提時(shí)間為0.5 h；
步驟三、濃縮及醇沉：將步驟二得到的鐵皮石斛多糖水提液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，然后加入3倍濃縮液體積的無(wú)水乙醇，靜置15 h，然后過(guò)濾得到不溶物，將不溶物干燥后即可得到鐵皮石斛多糖，多糖含量為14.73%。
步驟四、對(duì)照組：將鐵皮石斛浸泡于40倍水中并在50°C中溫浴1.5 h，再進(jìn)行同步驟二、步驟三的水提、濃縮及醇沉處理，得到鐵皮石斛多糖，測(cè)定多糖含量為11.95%。
可見(jiàn)，加酶處理的多糖的提取率與不加酶處理的提取率相比提高21.60%。
實(shí)施例3：
步驟一、酶處理：將鐵皮石斛浸泡于10倍水中，再添加2%的α-L-鼠李糖苷酶酶制劑，并在60°C中溫浴0.5 h；
步驟二、水提：將步驟一得到的溶液進(jìn)行兩次水提，第一次加水量為鐵皮石斛質(zhì)量的5倍，水提時(shí)間為1 h；第二次加水量為鐵皮石斛質(zhì)量的1倍，水提時(shí)間為1 h；
步驟三、濃縮及醇沉：將步驟二得到的鐵皮石斛多糖水提液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，然后加入3倍濃縮液體積的無(wú)水乙醇，靜置15 h，然后過(guò)濾得到不溶物，將不溶物干燥后即可得到鐵皮石斛多糖，多糖含量為13.31%。
步驟四、對(duì)照組：將鐵皮石斛浸泡于10倍水中并在60°C中溫浴0.5 h，再進(jìn)行同步驟二、步驟三的水提、濃縮及醇沉處理，得到鐵皮石斛多糖，測(cè)定多糖含量為10.07%。
可見(jiàn)，加酶處理的多糖的提取率與不加酶處理的提取率相比提高28.23%。
實(shí)施例4：
步驟一、酶處理：將鐵皮石斛浸泡于8倍水中，再添加0.5%的α-L-鼠李糖苷酶酶制劑，并在50°C中溫浴1.5 h；
步驟二、水提：將步驟一得到的溶液進(jìn)行兩次水提，第一次加水量為鐵皮石斛質(zhì)量的1倍，水提時(shí)間為2.5 h；第二次加水量為鐵皮石斛質(zhì)量的6倍，水提時(shí)間為1.5 h；
步驟三、濃縮及醇沉：將步驟二得到的鐵皮石斛多糖水提液通過(guò)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，然后加入3倍濃縮液體積的無(wú)水乙醇，靜置15 h，然后過(guò)濾得到不溶物，將不溶物干燥后即可得到鐵皮石斛多糖，多糖含量為22.39%。
步驟四、對(duì)照組：將鐵皮石斛浸泡于8倍水中并在50°C中溫浴1.5 h，再進(jìn)行同步驟二、步驟三的水提、濃縮及醇沉處理，得到鐵皮石斛多糖，測(cè)定多糖含量為13.54%。
可見(jiàn)，加酶處理的多糖的提取率與不加酶處理的提取率相比提高65.36%。
本發(fā)明采用加入α-L-鼠李糖苷酶酶制劑提高鐵皮石斛多糖的提取率，可使多糖的提取率與不加酶處理的最高提高65.36%，且酶法提取條件溫和，操作方便，經(jīng)濟(jì)節(jié)約，為鐵皮石斛多糖的廣泛應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
以上所述，僅為本發(fā)明較佳實(shí)施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實(shí)施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說(shuō)明書內(nèi)容所作的等效變化與修飾，皆應(yīng)仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內(nèi)。