本發(fā)明涉及一類可作為鈉-葡萄糖共轉運蛋白2(SGLT2)抑制劑的化合物及其制備方法，和其用于制備抗糖尿病及其并發(fā)癥藥物方面的用途。

背景技術：

糖尿病是一種由體內的胰島素缺乏或相對缺乏(胰島素抵抗等)引起的綜合性高發(fā)病率代謝疾病，以高血糖為主要特征。近年來，其發(fā)病日趨廣泛化和年輕化，據國際糖尿病聯(lián)盟(IDF)2015年報告，全球范圍內已有4.15億糖尿病患者，預計到2040年達到6.42億人，其中2型患者占糖尿病患者總數的90％～95％。糖尿病本身并不可怕，但其常引發(fā)的多種并發(fā)癥，如糖尿病神經病變、糖尿病視網膜病和糖尿病腎病等致殘率高，嚴重影響人類的健康和生活，社會危害日益增大。因此目前主要的抗糖尿病藥物研究都是針對2型糖尿病及其并發(fā)癥展開的。

2型糖尿病，又稱為非胰島素依賴糖尿病或成人型糖尿病，通常是由于胰腺胰島β細胞功能缺陷導致胰島素分泌不足或胰島素抵抗導致胰島素調節(jié)血糖功能減弱所致，臨床中也表現為胰島素缺失與胰島素抵抗同時存在。傳統(tǒng)的降糖藥主要有胰島素增敏劑、胰島素促分泌劑、α-葡萄糖苷酶抑制劑三大類，然而，2型糖尿病發(fā)病機制復雜，涉及靶點多，傳統(tǒng)治療藥物，如磺脲類(胰島素促分泌劑)、噻唑烷二酮類(胰島素增敏劑)和α-葡萄糖苷酶抑制劑等大多依賴胰島素的分泌，且副作用，如增重、低血糖和胃腸道不適等較為明顯，故其發(fā)展運用受到很大限制。糖尿病治療形勢日趨嚴峻，研發(fā)高效安全的新型降糖藥物也迫在眉睫。

鈉-葡萄糖共轉運蛋白2(SGLT2)為一類僅分布于腎小管S1段的低親和力/高容量鈉-葡萄糖轉運蛋白，其抑制劑可通過阻斷腎近端小管對葡萄糖的重吸收而增加尿糖的排出，最終達到降低血糖水平的目的。SGLT2作為一個新型的糖尿病治療靶點，降血糖機理與傳統(tǒng)糖尿病治療藥物不同，其抑制劑可以從尿中排出體內多余的葡萄糖，從而能夠減少糖基化蛋白，改善肝臟和外周組織的胰島素敏感性、改善β細胞功能，同時能進一步改善肝臟胰島素抵抗，從而促使較高的肝糖輸出恢復正常。SGLT2抑制劑與其他抗糖尿病藥物相比，具有以下優(yōu)勢：①使用范圍較廣，其適用于腎性糖尿病患者的血糖改善；②不易引起低血糖，能改善β細胞功能，改善胰島素抵抗；③減少了水鈉潴留的可能性，降低了引起心血管類疾病的風險；④副作用較少，能促進能量平衡，不易引起患者體質降低。因此SGLT2抑制劑可適用于糖尿病、糖尿病性酯血異常、葡萄糖耐量減低(IGT)癥、禁食血漿葡萄糖減低(IFG)、代謝性酸中毒、食欲調節(jié)、肥胖癥、各種癌癥、神經系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病等一系列疾病。

技術實現要素：

本發(fā)明提供一種可用作SGLT2抑制劑的化合物，即，如式I所示的一類2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮類化合物：

或其藥學上可接受的鹽、水合物、溶劑化物、立體異構體，其中：

R₁＝H、NO₂、NH₂、C₁-C₆烷基、F、Cl、Br；

R₂＝H、NO₂、NH₂、C₁-C₆烷基、F、Cl、Br；

n＝2，3，4，5，6。

優(yōu)選，R₁為H或NO₂。優(yōu)選，R₂為H或Cl。

優(yōu)選，n＝2，3，4。

優(yōu)選，當R₁為H時，R₂為Cl。

優(yōu)選，當R₁為NO₂時，R₂為H。

優(yōu)選，上述通式I化合物是或選自于下列中的一種或多種：

硝酸((1-(2-(3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐；

硝酸((1-(3-(3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)丙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐；

硝酸((1-(4-(3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐；

硝酸((1-(5-(3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)戊基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐；

硝酸((1-(6-(3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)己基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐；

((1-(2-(6-氯-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)硝酸酐；

((1-(3-(6-氯-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)丙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)硝酸酐；

((1-(4-(6-氯-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)硝酸酐；

((1-(5-(6-氯-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)戊基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)硝酸酐；

((1-(6-(6-氯-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)己基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)硝酸酐；

2硝酸((1-(2-(7-硝基-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐；

硝酸((1-(3-(7-硝基-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)丙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐；

硝酸((1-(4-(7-硝基-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐；

硝酸((1-(5-(7-硝基-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)戊基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐；

硝酸((1-(6-(7-硝基-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)己基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐。

本發(fā)明還提供上述化合物的制備方法，如下列反應式：

上述制備方法包括下列步驟：

步驟一：4-R₂-5-R₁-2-氨基苯酚(a)與2-氯乙酰氯反應，得6-R₂-7-R₁-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(b)；

步驟二：6-R₂-7-R₁-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(b)與二溴代C₂-C₄烷烴反應，得6-R₂-7-R₁-4-溴C₂-C₄烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(c)；

步驟三：6-R₂-7-R₁-4-溴C₂-C₄烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(c)與疊氮化鈉反應，得6-R₂-7-R₁-4-疊氮基C₂-C₄烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(d)；

步驟四：6-R₂-7-R₁-4-疊氮基C₂-C₄烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(d)與炔丙醇反應，得6-R₂-7-R₁-4-(((羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)C₂-C₄烷基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(e)；

步驟五：6-R₂-7-R₁-4-(((羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)C₂-C₄烷基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(e)與硝酸銀反應，得式I化合物；

其中R₁＝H、NO₂、NH₂、C₁-C₆烷基、F、Cl、Br；

R₂＝H、NO₂、NH₂、C₁-C₆烷基、F、Cl、Br；

n＝2，3，4，5，6。

在上述方法中，優(yōu)選，R₁為H或NO₂。優(yōu)選，R₂為H或Cl。

在上述方法中，優(yōu)選，n＝2，3，4。

在上述方法中，優(yōu)選，當R₁為H時，R₂為Cl。

在上述方法中，優(yōu)選，當R₁為NO₂時，R₂為H。

優(yōu)選，在所述步驟一中，在由4-R₂-5-R₁-2-氨基苯酚(a)溶于有機溶劑(如乙腈)中所形成的溶液中添加芐基三乙基溴化銨和碳酸氫鈉，然后添加(優(yōu)選緩慢添加，例如滴加)由2-氯乙酰氯在有機溶劑(如乙腈)中所形成的溶液，進行攪拌反應，在反應結束后從反應混合物中分離產物，獲得固體6-R₂-7-R₁-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(b)；優(yōu)選的是，4-R₂-5R₁-2-氨基苯酚:芐基三乙基溴化銨:碳酸氫鈉的摩爾比為1:0.02-0.3:1.2-4，更優(yōu)選1:0.07-0.2:1.5-2.8，更優(yōu)選1:0.08-0.15:1.7-2.3，例如1:0.1:2；優(yōu)選的是，4-R₂-5R₁-2-氨基苯酚:2-氯乙酰氯的摩爾比為1:1.1-1.8，更優(yōu)選1:1.15-1.5，例如1:1.2。

更具體地說，在所述步驟一中，4-R₂-5-R₁-2-氨基苯酚(a)加入芐基三乙基溴化銨和碳酸氫鈉(優(yōu)選將4-R₂-5-R₁-2-氨基苯酚溶于乙腈中，在0℃下加入芐基三乙基溴化銨和碳酸氫鈉；更優(yōu)選將4-R₂-5-R₁-2-氨基苯酚溶于乙腈中并預冷10min，在0℃下加入芐基三乙基溴化銨和碳酸氫鈉；再優(yōu)選4-R₂-5R₁-2-氨基苯酚:芐基三乙基溴化銨:碳酸氫鈉的摩爾比為1:0.1:2)，再加入含2-氯乙酰氯的乙腈溶液反應(優(yōu)選緩慢滴加含2-氯乙酰氯的乙腈溶液，更優(yōu)選4-R₂-5R₁-2-氨基苯酚:2-氯乙酰氯的摩爾比為1:1.2，再優(yōu)選保持0℃攪拌反應，優(yōu)選反應時間40-60min)，然后轉移至油浴中反應(優(yōu)選在55-60℃的油浴中攪拌反應，優(yōu)選反應時間8-10h)，濃縮，干燥(優(yōu)選濃縮后用乙醇:水(1:1-1.2)混合液重結晶，抽濾，干燥)，得固體6-R₂-7-R₁-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(b)。

優(yōu)選，在所述的步驟二中，在由6-R₂-7-R₁-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(b)溶于有機溶劑(如DMF)中所形成的溶液中添加二溴代C₂-C₄烷烴、四正丁基溴化銨和無水碳酸鉀進行攪拌反應(優(yōu)選在避光下進行攪拌反應)；然后進行分離和提純，獲得6-R₂-7-R₁-4-溴烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(c)；優(yōu)選的是，6-R₂-7-R₁-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮:二溴代烷:四正丁基溴化銨:無水碳酸鉀的摩爾比為1:1.1-1.8:0.05-0.3:1.3-4，更優(yōu)選1:1.15-1.5:0.08-0.15:1.7-2.5，例如1:1.2:0.1:2。

更具體地說，在所述步驟二中，6-R₂-7-R₁-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(b)加二溴代烷、四正丁基溴化銨和無水碳酸鉀反應(優(yōu)選將6-R₂-7-R₁-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮溶于DMF中，加入二溴代烷、四正丁基溴化銨和無水碳酸鉀反應，更優(yōu)選6-R₂-7-R₁-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮:二溴代烷:四正丁基溴化銨:無水碳酸鉀的摩爾比為1:1.2:0.1:2，優(yōu)選避光反應，優(yōu)選室溫下攪拌反應，優(yōu)選反應時間6～8h)，反應完畢，萃取，有機層干燥，濃縮，純化(優(yōu)選加入冰水，再用乙酸乙酯萃取，優(yōu)選有機層用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，優(yōu)選采用硅膠柱層析純化，洗脫劑乙酸乙酯:石油醚的體積比＝1:2-4)，得6-R₂-7-R₁-4-溴烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(c)。

優(yōu)選，在所述的步驟三中，在由6-R₂-7-R₁-4-溴烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(c)溶于有機溶劑(如DMF)中形成的溶液中添加疊氮化鈉和四正丁基溴化銨進行反應(優(yōu)選在避光下進行反應)，然后進行分離和提純，獲得6-R₂-7-R₁-4-疊氮基烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(d)；優(yōu)選的是，6-R₂-7-R₁-4-溴烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮:疊氮化鈉:四正丁基溴化銨的摩爾比為1:1.1-1.8:0.05-0.3，更優(yōu)選為1:1.2-1.6:0.08-0.2，例如1:1.3:0.1。

更具體地說，在所述步驟三中，6-R₂-7-R₁-4-溴烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(c)加疊氮化鈉、四正丁基溴化銨反應(優(yōu)選加入催化量的碘化鉀，優(yōu)選將6-R₂-7-R₁-4-溴烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮溶于DMF中，再加入疊氮化鈉、四正丁基溴化銨反應，優(yōu)選6-R₂-7-R₁-4-溴烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮:疊氮化鈉:四正丁基溴化銨的摩爾比為1:1.3:0.1，優(yōu)選在100-120℃避光反應，優(yōu)選反應時間12-14h)，反應完畢，萃取，有機層干燥，濃縮，純化(優(yōu)選加入冰水，再用乙酸乙酯萃取，優(yōu)選有機層用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，優(yōu)選采用硅膠柱層析純化，洗脫劑乙酸乙酯:石油醚的體積比＝1:2-3)，得6-R₂-7-R₁-4-疊氮基烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(d)。

優(yōu)選，在所述的步驟四中，在由6-R₂-7-R₁-4-疊氮基烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(d)溶于溶劑(如THF與水的混合液，如THF:H₂O按1:0.5-1.5重量比的混合液)中所形成的溶液中添加炔丙醇、CuSO₄·5H₂O(Ⅱ)和L-抗壞血酸鈉進行攪拌反應(優(yōu)選在避光下進行攪拌反應和/或在惰性氣體保護下)，然后進行分離和提純，獲得6-R₂-7-R₁-4-(((羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)烷基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(e)；優(yōu)選的是，6-R₂-7-R₁-4-疊氮基烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮:炔丙醇:CuSO₄·5H₂O(Ⅱ):L-抗壞血酸鈉的摩爾比為1:1.1-1.5:0.1-0.4:0.2-0.7，更優(yōu)選為1:1.1-1.5:0.1-0.4:0.2-0.7，例如1:1.2:0.2:0.4。

更具體地說，在所述步驟四中，6-R₂-7-R₁-4-疊氮基烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(d)，加入炔丙醇、CuSO₄·5H₂O(Ⅱ)和L-抗壞血酸鈉反應(優(yōu)選將6-R₂-7-R₁-4-疊氮基烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮溶于THF:H₂O(1:1-1.5)混合液中，再加入炔丙醇、CuSO₄·5H₂O(Ⅱ)和L-抗壞血酸鈉，更優(yōu)選6-R₂-7-R₁-4-疊氮基烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮:炔丙醇:CuSO₄·5H₂O(Ⅱ):L-抗壞血酸鈉的摩爾比為1:1.2:0.2:0.4，優(yōu)選在氮氣的保護下反應，優(yōu)選避光反應，優(yōu)選室溫下攪拌反應，反應時間優(yōu)選12-15h)，反應完畢，萃取，有機層干燥，濃縮，純化(優(yōu)選加入冰水，再用乙酸乙酯萃取，優(yōu)選有機層用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥，過濾，濃縮，優(yōu)選采用硅膠柱層析純化，洗脫劑乙酸乙酯:石油醚的體積比＝1:1-2)，得6-R₂-7-R₁-4-(((羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)烷基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(e)。

優(yōu)選，在所述的步驟五中，在由6-R₂-7-R₁-4-(((羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)烷基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(e)溶于有機溶劑(如乙腈)中所形成的溶液中添加N,N'-羰基二咪唑進行反應(優(yōu)選在惰性氣體保護下進行反應)，然后添加硝酸銀進一步反應(優(yōu)選在避光下進行進一步反應)，反應結束后，反應混合物在光照下進一步攪拌，然后分離和提純，獲得式I的化合物；優(yōu)選的是，6-R₂-7-R₁-4-(((羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)烷基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮:N,N'-羰基二咪唑的的摩爾比為1:1.1-2，更優(yōu)選1:1.2-1.5，例如1:1.3；更優(yōu)選的是，6-R₂-7-R₁-4-(((羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)烷基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮:硝酸銀的摩爾比為1:1.1-1.8，更優(yōu)選1:1.2-1.5，例如1:1.2。

更具體地說，在所述步驟五中，6-R₂-7-R₁-4-(((羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)烷基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(e)，加入N,N'-羰基二咪唑反應(優(yōu)選將6-R₂-7-R₁-4-(((羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)烷基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮溶于乙腈中，再加入N,N'-羰基二咪唑，優(yōu)選6-R₂-7-R₁-4-(((羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)烷基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮:N,N'-羰基二咪唑的的摩爾比為1:1.3，優(yōu)選在氮氣的保護下反應，優(yōu)選室溫下攪拌反應，反應時間優(yōu)選0.5-1h)，加入硝酸銀反應(優(yōu)選6-R₂-7-R₁-4-(((羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)烷基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮:硝酸銀的摩爾比為1:1.3-1.5，優(yōu)選避光反應，反應溫度優(yōu)選30-35℃，反應時間優(yōu)選8-10h)，反應完畢，反應液在光照下繼續(xù)攪拌(優(yōu)選攪拌3h)，過濾，萃取，有機層干燥，濃縮，層析(優(yōu)選加入飽和食鹽水，抽濾，優(yōu)選濾液用乙酸乙酯萃取，有機層用蒸餾水洗滌兩次并用無水硫酸鈉干燥，過濾，優(yōu)選減壓濃縮，優(yōu)選采用硅膠柱層析，洗脫劑乙酸乙酯:石油醚的體積比＝4-6:1)，得式I化合物。

本發(fā)明還提供上述化合物或其藥學上可接受的鹽、水合物、溶劑化物、立體異構體在制備治療或預防受益于SGLT2抑制的疾病的藥物中的用途，所述的受益于SGLT2抑制的疾病選自糖尿病、糖尿病性酯血異常、葡萄糖耐量減低(IGT)癥、禁食血漿葡萄糖減低(IFG)、代謝性酸中毒、食欲調節(jié)、肥胖癥、各種癌癥、神經系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病，優(yōu)選2型糖尿病。

一種藥物組合物，其包括上述化合物或其藥學上可接受的鹽、水合物、溶劑化物、立體異構體，和一種或幾種藥學上可接受的輔料。

一種藥物固體制劑，其包括上述化合物或其藥學上可接受的鹽、水合物、立體異構體，和一種或幾種藥物制劑領域通常使用的添加劑。

本發(fā)明所提供的化合物，通過抑制SGLT2活性，能抑制糖的再吸收，將多余的糖通過尿液排出體外。因此，能在不增加胰島細胞負擔的情況下調節(jié)高血糖。本發(fā)明還公開了該化合物的制備方法、含有該化合物的制劑，以及該化合物在抗糖尿病及其并發(fā)癥方面的用途，包括糖尿病、糖尿病性酯血異常、葡萄糖耐量減低(IGT)癥、禁食血漿葡萄糖減低(IFG)、代謝性酸中毒、食欲調節(jié)、肥胖癥、各種癌癥、神經系統(tǒng)疾病、免疫系統(tǒng)疾病等。

附圖說明

圖1是本發(fā)明實施例11中間產物b：7-硝基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮的¹H NMR圖譜；

圖2是本發(fā)明實施例11中間產物c：4-(2-溴乙基)-7-硝基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮的¹H NMR圖譜；

圖3是本發(fā)明實施例11中間產物d：4-(2-疊氮基乙基)-7-硝基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮的¹H NMR圖譜；

圖4是本發(fā)明實施例11中間產物e：4-(2-(4-(羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙基)-7-硝基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮的¹H NMR圖譜；

圖5是本發(fā)明實施例11終產物：2硝酸((1-(2-(7-硝基-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐的¹H NMR圖譜。

具體實施方式

通過以下實例進一步詳細說明本發(fā)明，但應注意本發(fā)明的范圍并不受這些實例的任何限制。

通用制備方法

步驟一：將原料4-R₂-5-R₁-2-氨基苯酚(a)溶于乙腈中并預冷10min，在0℃下加芐基三乙基溴化銨(TEBA)和碳酸氫鈉，4-R₂-5R₁-2-氨基苯酚:TEBA:碳酸氫鈉的摩爾比為1:0.1:2，攪拌，接著緩慢滴加含2-氯乙酰氯的乙腈溶液，4-R₂-5R₁-2-氨基苯酚:2-氯乙酰氯的摩爾比為1:1.2，攪拌反應。滴加完畢，保持0℃攪拌40min，然后轉移至55℃油浴中攪拌反應8h，濃縮反應液，然后用乙醇:水(1:1)混合液重結晶，抽濾，真空干燥，得6-R₂-7-R₁-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(b)。

步驟二：6-R₂-7-R₁-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(b)溶于DMF中，加二溴代烷、四正丁基溴化銨(TBAB)和無水碳酸鉀，6-R₂-7-R₁-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮:二溴代烷:TBAB:無水碳酸鉀的摩爾比為1:1.2:0.1:2，室溫下避光攪拌反應8h。反應完畢，加冰水，再用乙酸乙酯萃取，合并有機層，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。過濾，濃縮，硅膠柱層析純化，洗脫劑乙酸乙酯:石油醚的體積比為1:2-4。得6-R₂-7-R₁-4-溴烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(c)。

步驟三：6-R₂-7-R₁-4-溴烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(c)溶于DMF中，加疊氮化鈉、四正丁基溴化銨(TBAB)和催化量的碘化鉀，6-R₂-7-R₁-4-溴烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮:疊氮化鈉:TBAB的摩爾比為1:1.3:0.1，在120℃避光攪拌反應12h。反應完畢，加蒸餾水，再用乙酸乙酯萃取，合并有機層，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。過濾，濃縮，硅膠柱層析純化，洗脫劑乙酸乙酯:石油醚的體積比為1:2-3。得6-R₂-7-R₁-4-疊氮基烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(d)；

步驟四：6-R₂-7-R₁-4-疊氮基烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(d)溶于THF:H₂O(1:1)混合液中，加炔丙醇、CuSO₄·5H₂O(Ⅱ)和L-抗壞血酸鈉，6-R₂-7-R₁-4-疊氮基烷基-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮:炔丙醇:CuSO₄·5H₂O(Ⅱ):L-抗壞血酸鈉的摩爾比為1:1.2:0.2:0.4，在氮氣的保護下，室溫下避光攪拌12h。反應完畢，加冰水或蒸餾水，再用乙酸乙酯萃取，合并有機層，用飽和食鹽水洗滌，無水硫酸鈉干燥。過濾，濃縮，硅膠柱層析純化，洗脫劑乙酸乙酯:石油醚的體積比為1:1-2。得6-R₂-7-R₁-4-(((羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)烷基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(e)。

步驟五：6-R₂-7-R₁-4-(((羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)烷基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(e)溶于乙腈中，加N,N'-羰基二咪唑(CDI)，6-R₂-7-R₁-4-(((羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)烷基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮:CDI的摩爾比為1:1.3，在氮氣的保護下，室溫下攪拌0.5h。隨后加硝酸銀，6-R₂-7-R₁-4-(((羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)烷基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮:硝酸銀的摩爾比為1:1.2，在30℃下避光攪拌8h，反應完畢，反應液在光照下繼續(xù)攪拌3h，加飽和食鹽水，抽濾，并用乙酸乙酯萃取。合并有機層，用蒸餾水洗滌兩次，然后用無水硫酸鈉干燥。過濾，減壓濃縮，硅膠柱層析，洗脫劑乙酸乙酯:石油醚的體積比為4-6:1，得式I化合物。

實施例1

硝酸((1-(2-(3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐的制備。

步驟一：制備中間體2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮

將2-氨基苯酚(5.7g，52.0mmol)溶于100mL乙腈中并預冷10min，在0℃下加入TEBA(1.2g，5.2mmol)和NaHCO₃(8.7g，103.6mmol)并保持攪拌。接著緩慢滴加含2-氯乙酰氯(4.9mL，62.4mmol)的20mL乙腈溶液。滴加完畢，保持0℃繼續(xù)攪拌40min，然后轉移至55℃油浴中攪拌反應8h，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮反應液，然后用乙醇:水(1:1)混合液重結晶，抽濾，真空干燥得淡棕色固體2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮5.3g，產率為68.4％。m.p.：171-173℃；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm):4.55(s,2H),6.97-6.86(m,4H),9.53(brs,1H).MALDI-TOF:m/z 149([M+H]⁺)。

步驟二：制備中間體4-(2-溴乙基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮

將2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(5.0g，33.6mmol)溶于50mL DMF中，加1,2-二溴乙烷(3.5mL，40.3mmol)、四正丁基溴化銨(1.1g，3.36mmol)和無水碳酸鉀(9.5g，67.2mmol)，在室溫下避光攪拌8h。反應完畢，將混合物倒入到200mL冰冷的蒸餾水中，再用乙酸乙酯(50mL×3)萃取，合并有機層并用飽和食鹽水洗滌兩次，用無水硫酸鈉干燥過夜。過濾，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮溶液，硅膠柱層析純化(洗脫劑：乙酸乙酯:石油醚＝1:3)，得淡棕色液體3.9g，產率為45.1％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm):7.10-6.95(m,2H),4.79(s,1H),3.88(t,J＝7.5Hz,1H),3.45(t,J＝7.5Hz,1H).MALDI-TOF:m/z 257([M+H]⁺)。

步驟三：制備中間體4-(2-疊氮基乙基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮

將4-(2-溴乙基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(3.2g，12.5mmol)溶于50mL DMF中，加疊氮化鈉(1.0g，16.2mmol)、四丁基溴化銨(0.4g，1.25mmol)和催化量的碘化鉀，然后在120℃下避光攪拌反應12h。反應完畢，將混合物倒入到100mL蒸餾水或冰水中，用乙酸乙酯(60mL×3)萃取，合并有機層并用飽和食鹽水洗滌兩次，用無水硫酸鈉干燥過夜。過濾，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮溶液，硅膠柱層析純化(洗脫劑：乙酸乙酯:石油醚＝1:2)，得淡棕色液體1.8g，產率為65.4％。¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ(ppm):7.11-6.96(m,1H),7.01-6.92(m,1H),4.79(s,1H),3.40(t,J＝7.3Hz,1H),1.50(t,J＝7.3Hz,1H).MALDI-TOF:m/z 218([M+H]⁺)。

步驟四：制備中間體4-(2-(4-(羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮

在氮氣的保護下，將4-(2-疊氮基乙基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(1.8g，8.6mmol)溶于50mL THF/H₂O(1:1)混合液中，加炔丙醇(0.6mL，10.3mmol)、CuSO₄·5H₂O(Ⅱ)(0.4g，1.7mmol)和L-抗壞血酸鈉(0.7g，3.4mmol)，在室溫下避光攪拌反應12h。反應完畢，將混合物倒入到100mL冰冷的蒸餾水中，再用乙酸乙酯(80mL×3)萃取，合并有機層并用飽和食鹽水洗滌兩次，用無水硫酸鈉干燥過夜。過濾，用旋轉蒸發(fā)儀濃縮溶液，硅膠柱層析純化(洗脫劑：乙酸乙酯:石油醚＝1:1)，得到淡棕色液體1.6g，產率為68.3％。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆):1.86-1.92(m,1H),2.00-2.04(m,2H),4.42-4.44(m,2H),4.57-4.61(m,2H),4.79(s,4H),6.83-7.05(m,4H),7.72(s,1H)；MALDI-TOF:m/z 274([M+H]⁺)。

步驟五：制備目標化合物硝酸((1-(2-(3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐

在氮氣的保護下，將4-(2-(4-(羥基甲基)-1H-1,2,3-三唑-1-基)乙基)-2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮(1.4g，5.0mmol)溶于40mL乙腈中，加N,N'-羰基二咪唑(CDI)(1.0g，6.5mmol)，在室溫下攪拌0.5h。隨后加入硝酸銀(1.0g，6.0mmol)，在30℃下避光攪拌反應8h。反應完畢，反應液在光照下繼續(xù)攪拌3h，加入100mL飽和食鹽水，抽濾，濾液用乙酸乙酯(60mL×3)萃取，合并有機層，并用蒸餾水洗滌兩次，再用無水硫酸鈉干燥過夜。過濾，溶液減壓濃縮，得粗產物，粗產物通過柱色譜法純化(洗脫劑：乙酸乙酯:石油醚＝5:1)，得到終產物0.6g，為白色固體，產率為35.3％。

實施例1-15

按照通用制備方法，用不同的取代形式的2-氨基苯酚為原料，合成了表1所列的2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮類SGLT2抑制劑。

表1 2H-苯并[b][1,4]噁嗪-3(4H)-酮類化合物

實施例1～15的¹H NMR與MALDI-TOF-MS數據

硝酸((1-(2-(3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐(實施例1)：白色固體，收率35.3％，m.p.：67.5～68.4℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):8.34(s,1H),7.06(ddd,J＝7.5,6.2,2.9Hz,1H),7.06-6.92(m,3H),5.42(s,2H),4.79(s,2H),4.50(t,J＝5.7Hz,2H),3.86(t,J＝5.7Hz,2H).MALDI-TOF:m/z 363([M+H]⁺)。

硝酸((1-(3-(3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)丙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐(實施例2)：白色固體，收率39.3％，m.p.：80.3～81.7℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):7.64(s,1H),7.11-6.95(m,2H),6.99-6.91(m,2H),5.42(s,2H),4.79(s,2H),4.42(t,J＝7.4Hz,2H),4.30(t,J＝7.7Hz,2H),2.13(p,J＝7.6Hz,2H).MALDI-TOF:m/z 377([M+H]⁺)。

硝酸((1-(4-(3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐(實施例3)：白色固體，收率42.6％，m.p.：83.3～84.5℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):7.11-6.97(m,2H),5.42(s,1H),4.79(s,1H),4.42(t,J＝5.0Hz,1H),4.30(t,J＝5.9Hz,1H),1.90(p,J＝5.9Hz,1H),1.65-1.55(m,1H).MALDI-TOF:m/z 391([M+H]⁺)。

硝酸((1-(5-(3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)戊基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐(實施例4)：白色固體，收率40.5％，m.p.：75.6～76.8℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):7.11-6.98(m,1H),6.98(hept,J＝3.0Hz,1H),5.42(s,1H),4.79(s,1H),4.42(t,J＝7.7Hz,1H),4.30(t,J＝7.7Hz,1H),1.90(p,J＝7.8Hz,1H),1.60(p,J＝7.8Hz,1H),1.32(q,J＝8.0Hz,1H).MALDI-TOF:m/z 405([M+H]⁺)。

硝酸((1-(6-(3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)己基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐(實施例5)：白色固體，收率36.1％，m.p.：53.1～54.8℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):7.11-6.95(m,1H),7.00-6.93(m,1H),5.42(s,1H),4.79(s,1H),4.42(t,J＝7.6Hz,1H),4.30(t,J＝7.7Hz,1H),1.90(p,J＝7.7Hz,1H),1.60(p,J＝7.7Hz,1H),1.37-1.23(m,2H).MALDI-TOF:m/z 419([M+H]⁺)。

((1-(2-(6-氯-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)硝酸酐(實施例6)：白色固體，收率38.4％，m.p.：71.2～72.5℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):7.67(s,1H),7.36(d,J＝2.0Hz,1H),7.25(dd,J＝7.5,2.1Hz,1H),6.94(d,J＝7.5Hz,1H),5.42(s,2H),4.79(s,2H),4.50(t,J＝7.5Hz,2H),3.86(t,J＝7.5Hz,2H).MALDI-TOF:m/z397([M+H]⁺)。

((1-(3-(6-氯-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)丙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)硝酸酐(實施例7)：白色固體，收率43.8％，m.p.：85.7～87.1℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):7.64(s,1H),7.31(d,J＝2.1Hz,1H),7.24(dd,J＝7.5,2.1Hz,1H),6.91(d,J＝7.5Hz,1H),5.42(s,2H),4.79(s,2H),4.42(t,J＝7.5Hz,2H),4.30(t,J＝7.6Hz,2H),2.13(p,J＝7.6Hz,2H).MALDI-TOF:m/z 411([M+H]⁺)。

((1-(4-(6-氯-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)硝酸酐(實施例8)：白色固體，收率48.2％，m.p.：86.8～88.5℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):7.61(s,1H),7.34-7.22(m,2H),6.95(d,J＝7.5Hz,1H),5.42(s,2H),4.79(s,2H),4.42(t,J＝5.0Hz,2H),4.30(t,J＝5.7Hz,2H),1.90(p,J＝5.7Hz,2H),1.60(p,J＝5.4Hz,2H).MALDI-TOF:m/z 425([M+H]⁺)。

((1-(5-(6-氯-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)戊基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)硝酸酐(實施例9)：白色固體，收率42.7％，m.p.：77.6～79.0℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):7.99(s,1H),7.31(d,J＝2.1Hz,1H),7.24(dd,J＝7.6,2.0Hz,1H),6.93(d,J＝7.5Hz,1H),5.42(s,2H),4.79(s,2H),4.42(t,J＝5.3Hz,2H),4.30(t,J＝4.7Hz,2H),1.90(tt,J＝7.7,4.7Hz,2H),1.60(p,J＝5.3Hz,2H),1.31(tt,J＝7.6,5.4Hz,2H).MALDI-TOF:m/z 439([M+H]⁺)。

((1-(6-(6-氯-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)己基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)硝酸酐(實施例10)：白色固體，收率37.6％，m.p.：58.6～61.1℃。¹¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):7.67(s,1H),7.31(d,J＝2.0Hz,1H),7.23(dd,J＝7.5,2.1Hz,1H),6.90(d,J＝7.5Hz,1H),5.42(s,2H),4.79(s,2H),4.42(t,J＝7.5Hz,2H),4.30(t,J＝7.7Hz,2H),1.90(p,J＝7.7Hz,2H),1.60(p,J＝7.7Hz,2H),1.37-1.23(m,4H).MALDI-TOF:m/z 453([M+H]⁺)。

2硝酸((1-(2-(7-硝基-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)乙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐(實施例11)：淡黃色固體，收率42.3％，m.p.：81.2～82.3℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):7.82(dd,J＝7.5,2.1Hz,1H),7.75(d,J＝1.9Hz,1H),7.69(s,1H),7.18(d,J＝7.4Hz,1H),5.42(s,2H),4.79(s,2H),4.50(t,J＝6.7Hz,2H),3.86(t,J＝6.7Hz,2H).MALDI-TOF:m/z 408([M+H]⁺)。

硝酸((1-(3-(7-硝基-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)丙基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐(實施例12)：淡黃色固體，收率50.5％，m.p.：91.8～93.5℃；。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):7.94(dd,J＝7.5,2.0Hz,1H),7.88(d,J＝2.0Hz,1H),7.63(s,1H),7.22(d,J＝7.5Hz,1H),5.42(s,2H),4.79(s,2H),4.42(t,J＝7.5Hz,2H),4.30(t,J＝7.6Hz,2H),2.13(p,J＝7.6Hz,2H).MALDI-TOF:m/z 422([M+H]⁺)。

硝酸((1-(4-(7-硝基-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)丁基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐(實施例13)：淺黃色固體，收率55.6％，m.p.：94.5～95.8℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):8.01-7.90(m,2H),7.66(s,1H),5.42(s,2H),4.79(s,2H),4.42(t,J＝7.6Hz,2H),4.30(t,J＝7.2Hz,2H),1.90(p,J＝7.5Hz,2H),1.60(p,J＝7.7Hz,2H).MALDI-TOF:m/z436([M+H]⁺)。

硝酸((1-(5-(7-硝基-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)戊基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐(實施例14)：淡黃色固體，收率45.0％，m.p.：84.9～86.3℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):7.97(dd,J＝7.5,1.9Hz,1H),7.89(d,J＝2.0Hz,1H),7.68(s,1H),7.19(d,J＝7.5Hz,1H),5.42(s,2H),4.79(s,2H),4.42(t,J＝5.1Hz,2H),4.30(t,J＝5.3Hz,2H),1.90(tt,J＝7.8,5.3Hz,2H),1.60(p,J＝5.2Hz,2H),1.31(tt,J＝7.7,5.2Hz,2H).MALDI-TOF:m/z 450([M+H]⁺)。

硝酸((1-(6-(7-硝基-3-氧代-2,3-二氫-4H-苯并[b][1,4]噁嗪-4-基)己基)-1H-1,2,3-三唑-4-基)甲基碳酸)酐(實施例15)：淡黃色固體，收率40.1％，m.p.：65.7～67.2℃。¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):8.03(dd,J＝7.5,2.1Hz,1H),7.91(d,J＝2.0Hz,1H),7.71(s,1H),7.17(d,J＝7.5Hz,1H),5.42(s,2H),4.79(s,2H),4.42(t,J＝5.7Hz,2H),4.30(t,J＝4.8Hz,2H),1.95-1.85(m,2H),1.60(tt,J＝7.7,5.7Hz,2H),1.37-1.23(m,4H).MALDI-TOF:m/z 464([M+H]⁺)。生物學評價

生物學評價：降血糖活性實驗

本實驗采用小鼠口服葡萄糖耐受量(Oral glucose tolerance test,OGTT)的方法來測定相應目標化合物對實驗小鼠的降血糖活性，并通過血糖抑制率來反映化合物的SGLT2抑制活性。采用已經上市的SGLT2抑制劑Dapagliflozin和磺酰脲類降糖藥Gliclazide作為陽性對照。由測試結果可以看出，本發(fā)明中的化合物均有一定的降血糖活性，部分化合物表現出較強的降血糖活性，對今后進一步的結構改造起到了指導作用。

1實驗材料

實驗所用到的主要藥物和試劑：化合物1～15，由實驗室自制得到；Dapagliflozin購于將來試劑(上海)有限公司；Gliclazide購于上海泰坦科技有限公司，批號：P1174132；羧甲基纖維素鈉購于天津福晨化學試劑廠，批號：20121103；葡萄糖試劑盒購于中生北控生物科技股份有限公司，批號：135441；葡萄糖購于天津市科密歐化學試劑有限公司。

實驗動物及其飼養(yǎng)管理條件：實驗前一周，我們從湖南省長沙市天勤生物技術有限公司購得實驗所用的健康KM小鼠200只，SPF級，雌雄各半，20～25g，許可證號：SCXK(湘)2014-0011。實驗前先將小鼠正常飼養(yǎng)半周，且動物房的溫度和濕度基本上保持恒定，注意通風，每天光照12h，每周注意消毒。

2實驗方法

(1)血清樣本的獲取

將健康的KM小鼠進行隨機分組：1～5、6～10和11～12組(0.5％CMCC-Na；100mg/kg，20mg/kg，給藥容量為0.4mL/20g)；陽性對照Dapagliflozin組和Gliclazide組(0.5％CMCC-Na；100mg/kg，給藥容量為0.4mL/20g)；模型和空白對照組(0.5％CMCC-Na；0.4mL/20g)，每組6只。

實驗前，樣品化合物用0.5％羧甲基纖維素鈉(CMCC-Na)溶液配制成5mg/mL和1mg/mL濃度的混懸液，每只小鼠的給藥容量為0.4mL/20g，相當于給藥劑量為100mg/kg和20mg/kg；陽性對照Dapagliflozin組和Gliclazide組用0.5％羧甲基纖維素鈉(CMCC-Na)溶液配制成5mg/mL濃度的混懸液，每只小鼠的給藥容量為0.4mL/20g，相當于給藥劑量為100mg/kg。

實驗前先將小鼠禁食不禁水12h，而后分別給每組小鼠灌胃口服給藥相應的藥物。除空白對照組外，各組于給藥后90min腹腔注射葡萄糖溶液(2g/kg，10mL/kg)進行葡萄糖耐受量試驗，并且在給糖后的0.5h、1.0h、1.5h和2.5h分別用毛細管于小鼠眼球后靜脈叢處取血，然后離心分離血清，待用。

(2)血清中葡萄糖濃度的測定

本實驗采用葡萄糖氧化酶法測定各時刻的葡萄糖濃度。

檢測方法：

1)工作液的準備：

將葡萄糖試劑盒中的10mL R1與90mL R2均勻混合，既得到工作液。

2)檢測的條件：

波長：505nm；反應溫度：37℃；比色杯光徑：1cm。各試劑的體積如表2所示：

表2各試劑的體積

根據計算得到的ΔA_樣本和ΔA_校準來計算得到相應時刻的葡萄糖濃度，其計算公式如下：

C_樣本＝(ΔA_樣本/ΔA_校準)*C_校準品

(3)“血糖濃度-時間”曲線的獲得

曲線下面積(Area Under Carve,AUC)，即給藥后以血藥濃度(或葡萄糖濃度等)為縱坐標，以時間為橫坐標所得曲線下的面積，通?？捎梅e分法或梯形法求得。其中“血糖濃度-時間”曲線可通過軟件Origin9.0繪制得到，相應的曲線下面積亦可通過該軟件相應模塊求得。

(4)化合物1～15對實驗小鼠的血糖抑制率實驗結果

相應目標化合物的降血糖活性可通過抑制率(Inhibitory rate，％)來衡量，同時，我們可根據“血糖濃度-時間”曲線的曲線下面積計算抑抑制率，其計算公式如下：

抑制率＝[1-(AUC_(化合物)-AUC_(空白))/(AUC_(模型)-AUC_(空白))]×l00％

表3實驗結果表明：所合成的化合物1～15在高劑量(100mg/kg)時均有一定的降血糖活性：Dapagliflozin對血糖的抑制率為80.9％；所合成的化合物中也有許多有較高的血糖抑制活性(抑制率大于50％)，如2、3、4、5、9和10的血糖抑制率均在50％到60％之間，與陽性對照藥Gliclazide的該值(58.3％)相近，特別是化合物6和11～13，其血糖抑制率可分別高達65.3％、66.1％、62.7％和60.5％，大于Gliclazide的該值，故據此推測，這幾個化合物對血糖的半抑制有效劑量應小于100mg/kg，令人鼓舞；通過比較不同劑量的同化合物的血糖抑制率數據，我們發(fā)現所有化合物的血糖抑制活性隨劑量的增加而增強，故可初步判斷該類化合物對血糖的抑制活性呈一定的劑量依賴性；另外，在給藥劑量為20mg/kg時，化合物14的血糖抑制率為0，這可能是由于該化合物的特殊結構，使其在生物體內較不穩(wěn)定，易被代謝清除，且所用的劑量較小，故而幾乎沒有表現出血糖抑制活性。

表3各化合物血糖抑制率的測試結果

續(xù)表3各化合物血糖抑制率的測試結果

^a,bIt means the dose is 20 mg/kg and 100 mg/kg.

^c,dDapagliflozin and Gliclazide were used as positive controls for mice oral glucose tolerance test(OGTT).