本發(fā)明屬于生物工程和化學(xué)工程技術(shù)領(lǐng)域，涉及微生物發(fā)酵液分離技術(shù)，特別涉及從微生物發(fā)酵液中分離精制1,2,4-丁三醇的方法。

背景技術(shù)：

1,2,4-丁三醇(以下簡稱bt)是一種重要的中間體，在醫(yī)藥、煙草、化妝品、造紙、農(nóng)業(yè)和高分子材料領(lǐng)域具有廣泛用途。自然界中尚未發(fā)現(xiàn)天然的bt生物合成途徑，現(xiàn)階段丁三醇的工業(yè)化生產(chǎn)主要依靠化學(xué)合成法，副產(chǎn)物多、產(chǎn)率低、對環(huán)境有危害，清潔高效的丁三醇生物合成途徑逐漸引起研究者的關(guān)注。

目前生物發(fā)酵生產(chǎn)的bt濃度偏低，一般在幾克/升的水平，另外，bt本身沸點(diǎn)高，親水性強(qiáng)，常規(guī)的分離技術(shù)如精餾等需要耗費(fèi)大量能源，再加上發(fā)酵液成分復(fù)雜，進(jìn)一步增加了分離提純的難度。因此從發(fā)酵液中分離提取bt，已成為其工業(yè)化發(fā)展的瓶頸之一。

目前，從發(fā)酵液中分離提取bt尚處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。例如密歇根州立大學(xué)的研究表明，bt的下游分離可以利用2-丁醇作為萃取劑，萃取率達(dá)到74％，再經(jīng)過樹脂吸附，可得到純度超過99％的bt。但2-丁醇在水中有中等的溶解度(35.0g/100ml，20℃)，顯然該溶劑不適用于大規(guī)模使用。bt類似物甘油，早期也一直用溶劑萃取的方法進(jìn)行分離提純，涉及的萃取劑包括醚、對二氧六環(huán)、正丁醇、異戊醇、苯胺、二甲苯、煤油等等。但因?yàn)槿軇┏杀具^高，操作環(huán)境不佳，逐漸被淘汰。目前甘油提純的主流技術(shù)為減壓蒸餾。

考慮到bt屬于一種多元醇，而硼酸和硼酸鹽可以非常迅速地與多元醇和α-羥基羧酸形成穩(wěn)定的螯合物。很多研究報(bào)道利用硼酸來絡(luò)合多元醇，或者利用多元醇絡(luò)合硼酸等。例如專利cn103073086b發(fā)明了用硼酸處理過的樹脂吸附廢水中所含甘油的方法，將硼酸處理大孔陰離子樹脂后形成硼酸型離子樹脂，將其置入含甘油的廢水處理裝置中，吸附后通過酸堿處理洗脫，樹脂可循環(huán)使用，這一方法正是基于硼酸可與甘油發(fā)生反應(yīng)的原理。

bt發(fā)酵液中的多元醇僅有未發(fā)酵的殘?zhí)?，以及一些發(fā)酵的副產(chǎn)物，其含量相對較少。如果能選擇性將多元醇先進(jìn)行一步分離，則bt可以從復(fù)雜的發(fā)酵液混合物中得以有效的初步分離，將極大的減少后期處理成本。然而，單純的無機(jī)硼酸并不能直接用于bt的絡(luò)合，因?yàn)榕鹚岜旧硎撬苄?，絡(luò)合產(chǎn)物也是水溶性，無法做到兩相分離?？紤]到絡(luò)合后的兩相分離，必須采用不溶于水的硼酸產(chǎn)品作為絡(luò)合劑，并需要考慮絡(luò)合劑與bt的分離問題。有研究利用帶有硼酸基團(tuán)的樹脂作為吸附劑進(jìn)行多元醇的吸附，但問題在于吸附后需要脫附，脫附后又需要進(jìn)一步將脫附的洗脫液進(jìn)行分離，再加上樹脂吸附和洗脫本身的速度較緩慢，因此效率不高。

另外，由于發(fā)酵產(chǎn)物成分復(fù)雜，最終高純度的產(chǎn)品仍然需要通過蒸餾手段實(shí)現(xiàn)。由于bt沸點(diǎn)高，且高溫下容易與其他雜質(zhì)發(fā)生進(jìn)一步反應(yīng)，因此需要一種減壓且受熱時(shí)間短的分離手段實(shí)現(xiàn)。分子蒸餾是一種特殊的液液分離技術(shù)，它不同于傳統(tǒng)蒸餾依靠沸點(diǎn)差分離原理，而是依不同物質(zhì)分子運(yùn)動平均自由程的差別實(shí)現(xiàn)分離。專利cn2668212y提出了一種真空分子蒸餾裝置，用于分離一些特殊的熱敏性物料或在分離過程中易分解的不穩(wěn)定高分子有機(jī)化合物，將該裝置應(yīng)用于bt的分離提純，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)過多級分子蒸餾提純后，bt的純度可達(dá)90％以上，同時(shí)保持著較高的收率。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)方面，提供了一種從發(fā)酵液中分離精制bt的方法，其特征是，采用特定的有機(jī)硼酸作為bt的絡(luò)合劑，發(fā)酵液首先進(jìn)行絡(luò)合萃取，從發(fā)酵液中分離獲得bt混合液，bt純度約為50～60％；bt混合液進(jìn)行分子蒸餾進(jìn)行提純，經(jīng)一級或多級分子蒸餾后，得到純度≥90％的高純度bt產(chǎn)品。

根據(jù)本發(fā)明的分離精制方法，其包括以下步驟：

1)bt發(fā)酵液經(jīng)滅菌、板框過濾等步驟，除去菌體及其他蛋白絮凝有機(jī)雜質(zhì)；

2)向bt發(fā)酵液溶液中加入含有有機(jī)硼酸的有機(jī)溶劑，有機(jī)硼酸與bt的質(zhì)量比為0.1:1至10:1作為萃取劑進(jìn)行萃取，所述萃取可以為多級萃取，例如進(jìn)行3至5級萃取，萃取時(shí)間為0.2至10小時(shí)，溫度為0至60℃，優(yōu)選時(shí)間30分鐘，溫度優(yōu)選為40℃，萃取結(jié)束后分離有機(jī)相和水相；

3)將有機(jī)相利用減壓蒸餾脫除有機(jī)溶劑；

4)將步驟3)中得到的脫除有機(jī)溶劑后的產(chǎn)品進(jìn)行分子蒸餾，得到最終bt產(chǎn)品，分子蒸餾溫度控制在100～120℃，真空度穩(wěn)定在0.001mbar，刮板轉(zhuǎn)速為200～400rpm，分子蒸餾可以采用一級或多級，相應(yīng)的分子蒸餾條件應(yīng)根據(jù)最終產(chǎn)品要求決定。

優(yōu)選地，步驟2)中所述含有有機(jī)硼酸的有機(jī)溶劑可以是醚類、醇類、苯類、脂類等，優(yōu)選為甲醚、乙醚、甲乙醚、丙醚、丁醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯，磷酸三丁酯，對二氧六環(huán)、正丁醇、異戊醇、苯胺、二甲苯、煤油等，所述有機(jī)硼酸為烷基硼酸或芳基硼酸等，優(yōu)選為c10-c18烷基硼酸或c6-c18芳基硼酸，進(jìn)一步優(yōu)選為正十四烷基硼酸、苯硼酸、2-苯基乙基硼酸、二聯(lián)苯硼酸，4-丙基苯硼酸、4-戊基苯硼酸等。

優(yōu)選地，步驟2)中有機(jī)硼酸與bt的摩爾比可以為0.1:1至10:1，優(yōu)選為4:1至1:1，最優(yōu)選為1:1。

優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的分離精制方法除了上述有機(jī)硼酸以外，不采用其它絡(luò)合劑。

有益效果

根據(jù)本發(fā)明的分離精制方法結(jié)合了絡(luò)合萃取與分子蒸餾的方法對發(fā)酵法生產(chǎn)bt進(jìn)行分離純化。特別是采用了特定的有機(jī)硼酸作為bt的絡(luò)合劑，所述有機(jī)硼酸或者萃取前后一直保持液態(tài)，或者溶解在一定的稀釋劑中，直到分子精餾分離。根據(jù)本發(fā)明的分離精制方法工藝簡單，分離效率高，有利于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)。

具體實(shí)施方式

bt作為一種多元醇可以與硼酸和硼酸鹽迅速地絡(luò)合形成穩(wěn)定的螯合物，但由于形成的螯合物非常穩(wěn)定，當(dāng)采用分子蒸餾時(shí)，反而使得分子蒸餾的分離提純效率降低，特別是由于硼酸和硼酸鹽不能非常有效地通過分子蒸餾進(jìn)行分離，造成產(chǎn)物bt中的雜質(zhì)含量較高。

本發(fā)明的發(fā)明人驚奇的發(fā)現(xiàn)，當(dāng)采用特定的有機(jī)硼酸作為bt的絡(luò)合劑時(shí)，可以有效地避免上述技術(shù)問題。在根據(jù)本發(fā)明的分離精制方法中所述有機(jī)硼酸為烷基硼酸或芳基硼酸等，優(yōu)選為c10-c18烷基硼酸或c6-c18芳基硼酸，進(jìn)一步優(yōu)選為正十四烷基硼酸、苯硼酸、2-苯基乙基硼酸、二聯(lián)苯硼酸等。當(dāng)采用上述特定的有機(jī)硼酸時(shí)，即可以確保萃取效率，同時(shí)在后面的分子蒸餾中也可以有效地實(shí)現(xiàn)有機(jī)硼酸與bt的分離，從而提高bt的純度和收率。

以下，將詳細(xì)地描述本發(fā)明。在進(jìn)行描述之前，應(yīng)當(dāng)理解的是，在本說明書和所附的權(quán)利要求書中使用的術(shù)語不應(yīng)解釋為限制于一般含義和字典含義，而應(yīng)當(dāng)在允許發(fā)明人適當(dāng)定義術(shù)語以進(jìn)行最佳解釋的原則的基礎(chǔ)上，根據(jù)與本發(fā)明的技術(shù)方面相應(yīng)的含義和概念進(jìn)行解釋。因此，這里提出的描述僅僅是出于舉例說明目的的優(yōu)選實(shí)例，并非意圖限制本發(fā)明的范圍，從而應(yīng)當(dāng)理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，可以由其獲得其他等價(jià)方式或改進(jìn)方式。

以下實(shí)施例僅是作為本發(fā)明的實(shí)施方案的例子列舉，并不對本發(fā)明構(gòu)成任何限制，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解在不偏離本發(fā)明的實(shí)質(zhì)和構(gòu)思的范圍內(nèi)的修改均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1：

將其中bt濃度約為3～6g/l的bt發(fā)酵液經(jīng)加熱滅菌、板框過濾，以去除發(fā)酵液中的菌體和絮凝的固體蛋白。

過濾后去除菌體的發(fā)酵液中加入正十四烷基硼酸的乙酸乙酯溶液，乙酸乙酯與水溶液的總體積比約為1:1，使所述正十四烷基硼酸與發(fā)酵液中的bt的摩爾比控制在約為1:1，與水溶液形成兩相。其中在60℃條件下，將0.46g正十四烷基硼酸絡(luò)合劑加入10ml乙酸乙酯中，攪拌溶解后，加入10ml的0.1mol/l氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)ph值至約為13左右，再加入10ml的bt發(fā)酵液，適度緩慢攪拌，60℃下利用有機(jī)相中的硼酸試劑與發(fā)酵液中的bt之間的絡(luò)合作用進(jìn)行選擇性絡(luò)合萃取，攪拌30min后，靜置分層，取下層清液測bt濃度。至發(fā)酵液中bt濃度小于0.5g/l。分離水相與有機(jī)溶劑相，這樣重復(fù)3次，每次都用相同量的乙酸乙酯和烷基硼酸，合并萃取有機(jī)相。將含有“bt-烷基硼酸”有機(jī)相進(jìn)行減壓脫溶操作，獲得“bt-烷基硼酸”混合液，其中bt純度約為50～60％。

將得到的“bt-烷基硼酸”混合液進(jìn)行分子蒸餾，溫度120℃，真空度0.001mbar，收集輕相，一級分子蒸餾后bt產(chǎn)品的純度為79％，經(jīng)過兩級分子蒸餾處理，即可得到純度≥90％的bt產(chǎn)品。

實(shí)施例2：

bt發(fā)酵液中bt濃度約為3～6g/l，發(fā)酵液經(jīng)加熱滅菌、板框過濾，以去除發(fā)酵液中的菌體和絮凝的固體蛋白。

過濾后去除菌體的發(fā)酵液中加入苯基硼酸的乙酸乙酯溶液，乙酸乙酯與水溶液的總體積比為約1:1，使所述苯基硼酸與發(fā)酵液中的bt的摩爾比控制在約為1:1，與水溶液形成兩相，適度緩慢攪拌，利用有機(jī)相中的硼酸試劑與發(fā)酵液中的bt之間的絡(luò)合作用進(jìn)行選擇性絡(luò)合萃取，攪拌30min后，至發(fā)酵液中bt濃度小于0.5g/l，分離水相與有機(jī)溶劑相，這樣重復(fù)3次，每次都用相同量的乙酸乙酯和烷基硼酸，合并萃取有機(jī)相。將含有“bt-苯基硼酸”有機(jī)溶劑相進(jìn)行減壓脫溶操作，獲得“bt-苯基硼酸”混合液，bt純度約為50～60％。

將得到的“bt-苯基硼酸”混合液后進(jìn)入分子蒸餾，溫度120℃，真空度0.001mbar，收集輕相，一級分子蒸餾后bt產(chǎn)品的純度為79％，經(jīng)過兩級分子蒸餾處理，即可得到純度≥90％的bt產(chǎn)品。

實(shí)施例3

除了采用2-苯基乙基硼酸作為有機(jī)硼酸以外，以與實(shí)施例1相同的方式獲得bt產(chǎn)品。

實(shí)施例4

除了采用二聯(lián)苯硼酸作為有機(jī)硼酸以外，以與實(shí)施例1相同的方式獲得bt產(chǎn)品。

實(shí)施例5

除了采用4-丙基苯硼酸作為有機(jī)硼酸以外，以與實(shí)施例1相同的方式獲得bt產(chǎn)品。

實(shí)施例6

除了采用4-戊基苯硼酸作為有機(jī)硼酸以外，以與實(shí)施例1相同的方式獲得bt產(chǎn)品。

對比實(shí)施例1

除了不采用如何有機(jī)硼酸以外，以與實(shí)施例1相同的方式獲得bt產(chǎn)品。此實(shí)驗(yàn)作為空白對比試驗(yàn)。

下表1中為實(shí)施例和對比實(shí)施例的不同絡(luò)合劑及空白對萃取的影響對比。

表1

從表中可以看出，添加了有機(jī)硼酸的實(shí)施例萃取率都要高于對比實(shí)施例中不采用有機(jī)硼酸的情況，說明有機(jī)硼酸能夠有效的提高萃取效率。另外，根據(jù)本發(fā)明的制備方法中采用的c10-c18烷基硼酸或c6-c18芳基硼酸，相比于現(xiàn)有技術(shù)中采用的通常的硼酸，水溶性更小，不會因?yàn)槿芙獾剿锒斐奢^大的損失，即使反復(fù)多次使用，損失也很小。特別是在大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)過程中，有機(jī)硼酸的損失不僅造成成本高昂并且還容易污染環(huán)境。另外本發(fā)明的特定的有機(jī)硼酸具有合適的熔點(diǎn)，一般低于100℃，以確保分子蒸餾時(shí)bt與有機(jī)硼酸能夠有效分離，有機(jī)硼酸以液體狀態(tài)出料。