本發(fā)明屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種用于檢測(cè)諾如病毒Ⅰ型的試劑盒和寡核苷酸，更確切的說(shuō)，是一種檢測(cè)諾如病毒Ⅰ型的反轉(zhuǎn)錄—微滴式數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(droplet digital reverse transcriptional polymerase chain reaction,RT-ddPCR))快速定量檢測(cè)試劑盒。

背景技術(shù)：

諾如病毒(Norovirus)屬于杯狀病毒科，為無(wú)包膜單股正鏈RNA病毒，基因組全長(zhǎng)為7.5-7.7kp，包括3個(gè)開(kāi)放閱讀框(Open Reading Frame,ORF)，其中ORF1編碼核苷酸三磷酸酶、蛋白酶和RNA依賴的RNA多聚酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)等非結(jié)構(gòu)蛋白，ORF2編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白VP1，ORF3編碼次要結(jié)構(gòu)蛋白?；赗dRP和VP1基因序列信息的不同，諾如病毒可被分為5種基因型GⅠ-GⅤ。其中GⅠ和GⅡ最為常見(jiàn)，為感染人的主要病毒基因型。

諾如病毒是全世界范圍內(nèi)引起非細(xì)菌性胃腸炎暴發(fā)的主要食源性病毒，可感染各年齡組人群，尤其是兒童，引起患者惡心、嘔吐、腹痛，甚至低熱、頭痛、肌痛、乏力及食欲減退等癥狀。其傳播途徑為：傳染源→糞便→水體(食品)→人體傳播，污染的水和食物尤其貝類是傳播的主要載體。諾如病毒對(duì)環(huán)境具有較強(qiáng)的耐受性，在酸性(pH 2.7)條件下、加熱(60℃)條件及自來(lái)水中游離氯(3.75～6.25mg/L)濃度條件下，仍具感染性，預(yù)防手段十分有限。因此，對(duì)環(huán)境和食品中諾如病毒進(jìn)行檢測(cè)和分析，有利于水體環(huán)境及貝類海產(chǎn)品諾如病毒污染風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的開(kāi)展，進(jìn)而對(duì)食源性病毒病的暴發(fā)進(jìn)行有效的預(yù)警，保護(hù)人類健康，保障食品貿(mào)易正常進(jìn)行。

雖然諾如病毒Ⅰ型是嚴(yán)格的細(xì)胞內(nèi)寄生物，在食品中不能繁殖，但是其感染性強(qiáng)，甚至少于10²拷貝數(shù)/mL的病毒顆粒都能導(dǎo)致感染。而可能存在諾如病毒Ⅰ型污染的食品樣品中，其病毒滴度通常處于比較低的水平。因此需要一種針對(duì)諾如病毒Ⅰ型的精確定量檢測(cè)方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)諾如病毒Ⅰ型的有效監(jiān)控。目前，諾如病毒Ⅰ型的定量檢測(cè)方法主要包括以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR)基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-time Fluorescent Quantitative PCR,RT-qPCR)和反轉(zhuǎn)錄－環(huán)介導(dǎo)恒溫核酸擴(kuò)增(Realtime reverse transcription lood-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)法。這兩種方法需要經(jīng)過(guò)仔細(xì)校準(zhǔn)的標(biāo)準(zhǔn)曲線和穩(wěn)定的諾如病毒Ⅰ型標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，而且每次檢測(cè)都需建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，因此，結(jié)果分析中潛在主觀因素的存在，造成了多次檢測(cè)間結(jié)果的差異和不同實(shí)驗(yàn)室間結(jié)果的多樣性，影響諾如病毒Ⅰ型定量檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化和規(guī)范化。

近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的數(shù)字PCR(Digital PCR，dPCR)技術(shù)是一種全新的核酸定量檢測(cè)方法。目前，數(shù)字PCR包括：微反應(yīng)室/孔板數(shù)字PCR(Chamber Digital PCR,cdPCR)、微流體數(shù)字PCR(Microfluidic Digital PCR，mdPCR)(大規(guī)模集成微流控芯片)和微滴式數(shù)字PCR(Droplet Digital PCR，ddPCR)三種dPCR系統(tǒng)。目前，國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)利用RT-ddPCR進(jìn)行諾如病毒Ⅰ型定量檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一組特異性強(qiáng)、靈敏度高的用于檢測(cè)諾如病毒Ⅰ型的RT-ddPCR引物和探針。

本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確的諾如病毒Ⅰ型RT-ddPCR快速定量檢測(cè)試劑盒。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

本發(fā)明通過(guò)分析諾如病毒Ⅰ型的基因組構(gòu)成，選取其分型基因片段RdRp-VP1，設(shè)計(jì)出特異性引物和探針，所述用于檢測(cè)諾如病毒Ⅰ型的引物和探針的序列見(jiàn)表1，其中，探針5’標(biāo)記FAM，3’標(biāo)記BHQ。

表1 RT-ddPCR引物和探針序列

本發(fā)明還提供一種精確定量檢測(cè)諾如病毒Ⅰ型的試劑盒，該試劑盒包括上述用于檢測(cè)諾如病毒Ⅰ型的引物和探針。進(jìn)一步地，該試劑盒還包括完成RT-ddPCR反應(yīng)所需材料和試劑，例如諾如病毒Ⅰ型陽(yáng)性對(duì)照RNA、one-step RT-ddPCR supermix、醋酸鎂、微滴生成油、微滴生成卡、96孔板和鋁箔熱封膜等，上述材料和試劑優(yōu)選為單獨(dú)包裝。

本發(fā)明還提供了一種諾如病毒Ⅰ型精準(zhǔn)定量的檢測(cè)方法，即RT-ddPCR方法，其包括以下內(nèi)容：

1.提取待測(cè)樣品RNA，可以使用傳統(tǒng)Trizol法提取方法或商業(yè)化試劑盒進(jìn)行提??；

2.配制RT-ddPCR反應(yīng)體系，其中，所述反應(yīng)體系包括序列表中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.3所示的引物和探針。在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，RT-ddPCR反應(yīng)體系如表2所示；

表2諾如病毒Ⅰ型ddPCR反應(yīng)體系

3.將步驟2.配制的RT-ddPCR反應(yīng)體系和微滴生成油加入微滴生成卡中，置于微滴生成儀中生成微滴；

4.進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件見(jiàn)表3；

表3諾如病毒Ⅰ型RT-ddPCR反應(yīng)條件

注：升降溫速度應(yīng)≤2.5℃/s

5.結(jié)果判定。

將擴(kuò)增后的96孔板置于微滴讀取儀(QX200,Bio-Rad,Pleasanton,CA)中，利用QuantaSoft軟件進(jìn)行結(jié)果讀取和分析。含有擴(kuò)增產(chǎn)物的陽(yáng)性微滴與不含擴(kuò)增產(chǎn)物的陰性微滴會(huì)呈現(xiàn)出熒光信號(hào)強(qiáng)度的差異，以陰性微滴簇?zé)晒夥鹊淖罡唿c(diǎn)為界來(lái)設(shè)定閾值線。按照泊松分布原理計(jì)算獲得RT-ddPCR反應(yīng)體系內(nèi)諾如病毒Ⅰ型目的片段含量，進(jìn)而通過(guò)RNA模板加樣量(2μL)和提取的RNA模板體積數(shù)，按以下公式計(jì)算獲得樣品中諾如病毒Ⅰ型的精準(zhǔn)定量。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：1)對(duì)核酸分子的絕對(duì)定量避免了由PCR擴(kuò)增效率差異所導(dǎo)致的偏差；2)無(wú)需依賴有證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)或其他標(biāo)準(zhǔn)品；3)具有更高的精確度、靈敏性和重復(fù)性，易于標(biāo)準(zhǔn)化；4)更適合低拷貝數(shù)的核酸檢測(cè)；5)由于RT-ddPCR是終點(diǎn)檢測(cè)，對(duì)抑制劑的耐受度更高，因此可降低由基質(zhì)類型所導(dǎo)致的檢測(cè)偏差。

下面結(jié)合說(shuō)明書(shū)附圖和具體實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說(shuō)明，凡依照本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容所做的任何本領(lǐng)域的等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。

附圖說(shuō)明

圖1不同退火溫度條件下諾如病毒Ⅰ型目的片段RT-ddPCR檢測(cè)結(jié)果。

圖2 RT-ddPCR試劑盒檢測(cè)諾如病毒Ⅰ型特異性分析結(jié)果。

圖3 RT-ddPCR試劑盒檢測(cè)諾如病毒Ⅰ型靈敏度分析結(jié)果。

圖4 RT-ddPCR試劑盒檢測(cè)諾如病毒Ⅰ型重復(fù)性分析結(jié)果。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1 RT-ddPCR引物、探針設(shè)計(jì)

為實(shí)現(xiàn)對(duì)諾如病毒Ⅰ型的特異性檢測(cè)和絕對(duì)定量分析，我們選取諾如病毒分型基因片段RdRp-VP1，通過(guò)NCBI在線工具進(jìn)行序列分析和比對(duì)，利用Prime Express軟件V4.0(ABI,Foster City,CA,USA)設(shè)計(jì)出10余對(duì)引物和探針組合，經(jīng)過(guò)篩選最終獲得特異性強(qiáng)、適用于RT-ddPCR引物/探針組合各1套，序列見(jiàn)表1。其中探針5’端標(biāo)記FAM，3’端標(biāo)記BHQ。引物/探針均由北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司合成。

實(shí)施例2檢測(cè)方法的建立

(1)RNA提取：利用商業(yè)化試劑盒進(jìn)行提??；或者利用傳統(tǒng)Trizol法提取RNA，具體操作如下：①在100μL樣品中加入1mL Trizol，震蕩30s后，室溫放置5min；②加入250μL氯仿，劇烈震蕩30s，室溫放置5min；4℃，12000g，離心5min；③將上清液轉(zhuǎn)入新離心管中，加入500μL的異丙醇劇烈震蕩混勻30s，室溫放置5min；④4℃，5000g，離心5min；⑤小心移去上清，沉淀用1mL 70％乙醇清洗后12000g，4℃，離心5min(盡可能吸走上清，離心管置于超凈臺(tái)上將沉淀吹干)；⑥加入50μL無(wú)RNase水溶解RNA(為了使病毒RNA更好的溶解，置60℃加熱10min)。提取的RNA于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)按照表2配制20μL的RT-ddPCR反應(yīng)體系

(3)微滴生成

將20μL的ddPCR反應(yīng)體系和65μL微滴生成油分別加入到8孔微滴生成卡中，置于微滴生成儀(QX200,Bio-Rad,Pleasanton,CA)中生成微滴。

(4)擴(kuò)增反應(yīng)

將生成的油包水的微滴(40μL)緩慢轉(zhuǎn)移至96孔板中，封膜后置于PCR儀(Veriti Thermal cycler,Applied BioSystems,Foster City,CA)上進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增條件如表3所示。

(5)結(jié)果判定

將擴(kuò)增后的96孔板置于微滴讀取儀(QX200,Bio-Rad,Pleasanton,CA)中，利用QuantaSoft軟件進(jìn)行結(jié)果讀取和分析。含有擴(kuò)增產(chǎn)物的陽(yáng)性微滴與不含擴(kuò)增產(chǎn)物的陰性微滴會(huì)呈現(xiàn)出熒光信號(hào)強(qiáng)度的差異，可以陰性微滴簇?zé)晒夥鹊淖罡唿c(diǎn)為界來(lái)設(shè)定閾值線。按照泊松分布原理計(jì)算獲得RT-ddPCR反應(yīng)體系內(nèi)諾如病毒Ⅰ型目的片段含量，進(jìn)而通過(guò)RNA模板加樣量(2μL)和提取的RNA模板體積數(shù)，按以下公式計(jì)算獲得樣品中諾如病毒Ⅰ型的精準(zhǔn)定量。

本發(fā)明還對(duì)RT-ddPCR檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，例如退火溫度，取提取的諾如病毒Ⅰ型RNA作為模板，分別在50℃、55℃、60℃、65℃和70℃的退火溫度下進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，比較不同條件下RT-ddPCR的檢測(cè)結(jié)果。由圖1可見(jiàn)，50℃條件下諾如病毒Ⅰ型目的基因片段的擴(kuò)增效率偏低，陽(yáng)性微滴和陰性微滴分界不明顯；55℃和60℃條件下目的基因片段擴(kuò)增效率較高，可出現(xiàn)比較明顯的陽(yáng)性微滴簇，且55℃條件下擴(kuò)增的熒光信號(hào)略高于60℃，因此，將55℃作為最佳退火溫度。

實(shí)施例3試劑盒組成

1.試劑盒的組成(保存于-20℃)

(1)實(shí)施例1設(shè)計(jì)的用于檢測(cè)諾如病毒Ⅰ型的引物和探針SEQ ID No.1-3，由北京六合通經(jīng)貿(mào)有限公司合成；

(2)one-step RT-ddPCR supermix、25mM醋酸鎂：購(gòu)自美國(guó)BioRad公司，貨號(hào)186-3021；

(3)微滴生成油：購(gòu)自美國(guó)BioRad公司，貨號(hào)186-3030；

(4)微滴生成卡：購(gòu)自美國(guó)BioRad公司，貨號(hào)186-4007；

(5)鋁箔熱封膜：購(gòu)自美國(guó)BioRad公司，貨號(hào)181-4000；

(6)Twin Tec Semi-Skirted 96孔板：購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司，貨號(hào)0030128605；

(7)陰性對(duì)照：DEPC水；購(gòu)自上海生工，貨號(hào)：D1005；

(8)陽(yáng)性對(duì)照：諾如病毒Ⅰ型RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；

(9)DEPC水：購(gòu)自上海生工，貨號(hào)：D1005。

2.諾如病毒Ⅰ型RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備

以諾如病毒Ⅰ型RNA為模板，利用引物SEQ ID No.1-2，擴(kuò)增出約68bp的特異性片斷，稱之為GⅠ(包含RT-ddPCR擴(kuò)增靶基因)；構(gòu)建重組質(zhì)粒pcDNAⅡ-GⅠ(pcDNAⅡ載體購(gòu)自Invitrogen公司)，于上海生工公司進(jìn)行序列測(cè)定，并將測(cè)序結(jié)果與GenBank中諾如病毒Ⅰ型的基因序列進(jìn)行同源性分析，其同源性達(dá)100％。提取并純化質(zhì)粒DNA，用Promega公司的Ribo MAX^TM Large Scale RNA Production system-T7試劑盒(貨號(hào)：P1300)進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄(按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行)，體外轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用DNase消化，去除其中的DNA。利用RNeasy MiniElute Cleanup kit(購(gòu)自QIAGEN公司，貨號(hào)74204)進(jìn)一步純化cRNA。純化的cRNA于上海生工公司進(jìn)行序列測(cè)定，并將測(cè)序結(jié)果與GenBank中諾如病毒Ⅰ型的基因序列進(jìn)行同源性分析，其同源性達(dá)100％。將cRNA分裝，保存于-80℃。對(duì)制備的諾如病毒Ⅰ型RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行均勻性、穩(wěn)定性檢驗(yàn)，均符合相關(guān)要求；采用多家實(shí)驗(yàn)室定值方法對(duì)制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行定值研究，最終制備的諾如病毒Ⅰ型RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度為：5.43×10⁷copies/μl。-80℃保存，作為試劑盒的陽(yáng)性對(duì)照

實(shí)施例4檢測(cè)方法特異性和靈敏度評(píng)價(jià)

1.檢測(cè)特異性分析

(1)材料：輪狀病毒、星狀病毒、諾如病毒Ⅰ型和諾如病毒Ⅱ型RNA均由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心病毒病所提供。

(2)方法：使用本發(fā)明所述試劑盒，對(duì)常見(jiàn)的腹瀉病毒包括輪狀病毒、星狀病毒、諾如病毒Ⅰ型和諾如病毒Ⅱ型RNA進(jìn)行RT-ddPCR擴(kuò)增檢測(cè)，觀察該試劑盒有無(wú)非特異性反應(yīng)的發(fā)生。

(3)結(jié)果：輪狀病毒、星狀病毒、諾如病毒Ⅰ型和諾如病毒Ⅱ型RNA經(jīng)PCR儀(Veriti Thermal cycler,Applied BioSystems,Foster City,CA)擴(kuò)增后，采用微滴讀取儀(QX200,Bio-Rad,Pleasanton,CA)檢測(cè)，利用QuantaSoft軟件進(jìn)行結(jié)果讀取和分析。結(jié)果表明，只有諾如病毒Ⅰ型出現(xiàn)陽(yáng)性微滴，其余病毒均為陰性微滴，證明該方法具有良好的特異性。結(jié)果見(jiàn)圖2。

2.檢測(cè)靈敏度分析

(1)材料：前面制備的諾如病毒Ⅰ型RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行10倍梯度稀釋至5.43拷貝/μL。

(2)方法：各稀釋梯度取2μL，利用實(shí)施例3所述的試劑盒進(jìn)行RT-ddPCR檢測(cè)，通過(guò)分析本發(fā)明所述試劑盒所能檢測(cè)到的最低限，反應(yīng)體系見(jiàn)表2。

(3)結(jié)果：發(fā)現(xiàn)利用本發(fā)明所述試劑盒，可檢測(cè)到5.43拷貝/μL諾如病毒Ⅰ型RNA標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。結(jié)果見(jiàn)圖3?？梢?jiàn)本試劑盒檢測(cè)諾如病毒Ⅰ型可達(dá)到5.43拷貝/μL，大大提高了諾如病毒Ⅰ型相關(guān)檢測(cè)方法的靈敏度，不依賴標(biāo)準(zhǔn)品，可實(shí)現(xiàn)絕對(duì)定量，結(jié)果直觀可靠。

實(shí)施例5檢測(cè)方法準(zhǔn)確性和重復(fù)性評(píng)價(jià)

1.檢測(cè)準(zhǔn)確性分析

準(zhǔn)確性(truness)是指一組測(cè)試結(jié)果的平均值與可接受的參考值之間的一致性程度。按照歐盟與Codex的標(biāo)準(zhǔn)，準(zhǔn)確度的判定標(biāo)準(zhǔn)是在整個(gè)檢測(cè)動(dòng)態(tài)范圍內(nèi)，測(cè)定值應(yīng)在參考值±25％范圍內(nèi)。

(1)材料：前面制備的諾如病毒Ⅰ型檢測(cè)RNA陽(yáng)性對(duì)照(5.43×10⁷copies/μl)分別稀釋至5.43×10³copies/μl、5.43×10²copies/μl、5.43×10¹copies/μl和5.43copies/μl，表示為樣品U1-U4(表4)。

(2)方法：各樣品分別進(jìn)行RT-ddPCR檢測(cè)，每個(gè)樣品設(shè)7個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照(以去DEPC水代替模板RNA)。

(3)結(jié)果：諾如病毒Ⅰ型RNA的RT-ddPCR測(cè)定值均同預(yù)計(jì)值接近，其標(biāo)準(zhǔn)偏差均＜15％(表4)，小于25％的判定標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明該方法具有非常好的準(zhǔn)確性。

表4諾如病毒Ⅰ型RT-ddPCR檢測(cè)的準(zhǔn)確性

2.檢測(cè)重復(fù)性分析

(1)方法：利用前面制備的諾如病毒Ⅰ型RNA陽(yáng)性對(duì)照(5.43×10⁷copies/μl)稀釋至5.43×10³copies/μl，進(jìn)行RT-ddPCR檢測(cè)，設(shè)8個(gè)重復(fù)，同時(shí)設(shè)置1個(gè)空白對(duì)照(以去DEPC水代替模板RNA)。

(2)結(jié)果：由圖4可見(jiàn)，對(duì)特定濃度的諾如病毒Ⅰ型RNA陽(yáng)性對(duì)照的測(cè)定變異系數(shù)CV小于25％，證明該方法用于諾如病毒Ⅰ型定量檢測(cè)時(shí)具有良好的重復(fù)性。

顯然，本發(fā)明的上述實(shí)施例僅僅是為清楚地說(shuō)明本發(fā)明所作的舉例，而并非是對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方式的限定。對(duì)于所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在上述說(shuō)明的基礎(chǔ)上還可以做出其它不同形式的變化或變動(dòng)。這里無(wú)法對(duì)所有的實(shí)施方式予以窮舉。凡是屬于本發(fā)明的技術(shù)方案所引伸出的顯而易見(jiàn)的變化或變動(dòng)仍處于本發(fā)明的保護(hù)范圍之列。