本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種基于熱誘導miR30-shRNA敲低魚類基因表達的方法。

背景技術：

DNA堿基切除修復(BER)通路主要監(jiān)測并修復活性氧、烷化劑及電離輻射誘發(fā)的DNA堿基損傷。BER通路包含多步酶促反應，涉及多種DNA修復蛋白。該通路主要分為3個步驟：(1)DNA N-糖基化酶識別受損堿基，使異常嘌呤的N5和異常嘧啶的N3與脫氧核糖之間的化學鍵發(fā)生水解，在DNA鏈上形成脫嘌呤/脫嘧啶位點(AP)；(2)AP核酸內(nèi)切酶(APEX1)在AP位點上游切開缺口，使一端成為5’-磷酸基，另一端成為3’-羥基；(3)DNA多聚酶重新合成正確的堿基，最后由連接酶將其連接。Apex1在BER通路中的作用是形成脫嘌呤/脫嘧啶位點，是BER的主要限速酶，對維護DNA堿基切除修復能力起關鍵作用。BER通路的破壞可能導致腫瘤的發(fā)生和神經(jīng)退化紊亂，BER通路通過轉化不同的損傷堿基為一種常見的中間體的脫嘌呤/嘧啶(AP)位點，然后Apex1基因通過特有的DNA修復通路發(fā)揮作用。

目前魚類上有效敲低目的基因的技術主要依賴于反義Morpholino技術，但是由于注射Morpholino降解作用只能暫時性的抑制目的基因的表達，因此局限于魚類早期胚胎發(fā)育研究。雖然有報道直接利用siRNA特異性敲低魚類目的基因的表達，在實際應用中的有效敲除靶基因的成功率較少。

自20世紀末RNA干擾現(xiàn)象(RNA interference，RNAi)及其作用機制被發(fā)現(xiàn)以來，外源性siRNA干擾技術已被廣泛應用于基礎研究及臨床實踐的多個領域，如功能基因組學、信號通路分析、藥物靶點篩選。同時，其在轉基因斑馬魚的基因功能研究中也有很大潛力。例如，Dodd等設計了斑馬魚dystrophin基因的siRNA，成功地干擾了斑馬魚dystrophin基因的表達。該實驗證明此技術可以應用在構建基因沉默的脊椎動物模型中(Dodd A,Chambers SP,Love DR.FEBS Lett.2004,561:89–93.)；Acosta等設計了斑馬魚myostatin基因的siRNA，并將其注入斑馬魚受精卵，也成功地干擾了myostatin的表達(Acosta J,Carpio Y,Borroto I,et al.J Biotechnol.2005,119:324-331.)。但是最近的研究表明，用于斑馬魚上的siRNA或shRNA敲低研究技術存在某些結果不能重復或效果不佳的問題(Kelly A, Hurlstone AF.Brief Funct Genomics.2011,10:189-196.)。

技術實現(xiàn)要素：

為了克服現(xiàn)有技術中所存在的問題，本發(fā)明的目的在于提供一種基于熱誘導miR30-shRNA敲低魚類基因表達的方法。

為了實現(xiàn)上述目的以及其他相關目的，本發(fā)明采用如下技術方案：

本發(fā)明的第一方面，提供了一種利用miR30引導的干擾機制敲低魚類基因表達的方法，所述方法包括：

(1)提供干擾載體，所述干擾載體包括：熱激啟動子HSP70和miR30干擾序列；

(2)構建重組載體：將目的基因干擾序列插入步驟(1)所得干擾載體，獲得重組載體；

(3)將步驟(2)所得重組載體注射入魚的受精卵，進行熱誘導培養(yǎng)，以敲低目的基因表達。

優(yōu)選地，步驟(1)中，所述熱激啟動子HSP70含有如SEQ ID NO.4所示的序列。

優(yōu)選地，步驟(1)中，熱激啟動子HSP70和miR30干擾序列由5’端到3’端依次排布。

優(yōu)選地，步驟(1)中，所述干擾載體還含有可被檢測的標記物的核苷酸序列。

所述可被檢測的標記物的核苷酸序列與目的基因干擾序列插入?yún)^(qū)相連。

較優(yōu)的，所述可被檢測的標記物如綠色熒光蛋白(eGFP)。

優(yōu)選地，步驟(1)中，所述干擾載體含有如SEQ ID NO.5所示的序列。

優(yōu)選地，步驟(2)中，所述目的基因為魚類基因。

優(yōu)選地，步驟(2)中，插入的目的基因干擾序列與miR30干擾序列連接。

更優(yōu)選地，插入的目的基因干擾序列連接于miR30干擾序列的3’端。

優(yōu)選地，步驟(2)中，所述目的基因干擾序列為shRNA，所述shRNA中含有能夠在嚴緊條件下與目的基因雜交的核苷酸序列。

進一步的，所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，并且所述正義鏈片段的序列與目的基因中15-27個連續(xù)的核苷酸序列基本相同。所述shRNA經(jīng)加工后可成為小干擾RNA(siRNA)進而起到特異性沉默目的基因表達的作用。

更一步的，所述shRNA包括正義鏈片段和反義鏈片段，以及連接所述正義鏈片段和反義鏈片段的莖環(huán)結構，所述正義鏈片段和所述反義鏈片段的序列互補，并且所述正義鏈片段的序列與目的基因中的靶序列基本相同。

較佳的，所述正義鏈片段與目的基因中19-23個連續(xù)的核苷酸序列基本相同；更佳的，所述正義鏈片段與目的基因中19、20或者21個連續(xù)的核苷酸序列基本相同。

進一步的，所述shRNA的莖環(huán)結構的序列可選自以下任一：UUCAAGAGA、AUG、CCC、UUCG、CCACC、CUCGAG、AAGCUU和CCACACC。

shRNA經(jīng)酶切加工后可成為siRNA，進而起到敲低目的基因特異性表達的作用。

本發(fā)明的一優(yōu)選實施例中，所述目的基因為Apex1基因。Apex1基因中的靶序列含有如SEQ ID NO:2所示的打靶序列。

本發(fā)明實施例具體列舉了以pISceI-HSP70-eGFP為干擾載體構建的Apex1基因干擾重組載體，命名為pISceI-HSP70-miR30-Apex1-eGFP。

進一步地，所述Apex1基因來源于斑馬魚。

優(yōu)選地，步驟(3)中，所述注射采用顯微注射法。

優(yōu)選地，步驟(3)中，所述熱誘導培養(yǎng)包括：將注射完成的受精卵在26℃-29℃條件下孵育，然后再將受精卵在37℃條件下進行熱激誘導，然后再將受精卵重新放入26℃-29℃條件下培育。

進一步優(yōu)選地，將注射完成的受精卵在26℃-29℃條件下孵育24h。

進一步優(yōu)選地，將受精卵在37℃條件下熱激誘導1h。

進一步優(yōu)選地，將受精卵重新放入26℃-29℃條件下培育6h。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于敲低魚類基因表達的干擾載體，所述干擾載體包括：熱激啟動子HSP70和miR30干擾序列。

優(yōu)選地，所述熱激啟動子HSP70含有如SEQ ID NO.4所示的序列。

優(yōu)選地，所述干擾載體還含有可被檢測的標記物的核苷酸序列。較優(yōu)的，所述可被檢測的標記物如綠色熒光蛋白(eGFP)。

優(yōu)選地，所述干擾載體含有如SEQ ID NO.5所示的序列。

本發(fā)明的第三方面提供一種用于敲低魚類基因表達的試劑盒，所述試劑盒中包括：前述用于敲低魚類基因表達的干擾載體。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明具有如下有益效果：

針對現(xiàn)有技術中，用于斑馬魚上的siRNA或shRNA敲低研究技術存在某些結果不能重復或效果不佳的問題，本發(fā)明采用miR30介導的shRNA基因敲低系統(tǒng)，構建相應的RNAi載體，通過引進熱誘導調(diào)控技術，實現(xiàn)在熱激誘導條件下控制靶基因的表達水平。結果表明，靶序如SEQ ID NO.1所示的miR30Apex1shRNA載體能夠實現(xiàn)熱激誘導性敲除Apex1基因表達，顯著下調(diào)Apex1基因的表達。

附圖說明

圖1是表達載體質粒的結構示意圖。

圖2是熱激后培育6h斑馬魚熒光情況，說明在培育6h后斑馬魚全身有明顯熒光，在頭部熒光最強。質粒含有可被檢測的標記物如綠色熒光蛋白(eGFP)，理論上成功敲低斑馬魚胚胎Apex1基因后，標記熒光會在斑馬魚胚胎上顯示。

具體實施方式

在進一步描述本發(fā)明具體實施方式之前，應理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下述特定的具體實施方案；還應當理解，本發(fā)明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。下列實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件，或者按照各制造商所建議的條件。

當實施例給出數(shù)值范圍時，應理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術和科學術語與本技術領域技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、材料外，根據(jù)本技術領域的技術人員對現(xiàn)有技術的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本發(fā)明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術的任何方法、設備和材料來實現(xiàn)本發(fā)明。

除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術領域常規(guī)的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養(yǎng)、重組DNA技術及相關領域的常規(guī)技術。這些技術在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Third edition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

實施例

從數(shù)據(jù)庫中調(diào)取斑馬魚Apex1基因信息，斑馬魚Apex1基因的ORF序列如SEQ ID NO.1。

設計針對Apex1基因的有效的siRNA靶點。靶向于Apex1基因的有效siRNA靶點序列含有如SEQ ID NO.2所示的序列。

如SEQ ID NO.2所示的序列具體為：GGAGAGGCTGACAATGGAA。

本實施例利用miR30干擾序列構建了以熱激啟動子HSP70調(diào)節(jié)下游基因表達的序列載體(pISceI-HSP70-miR30-Apex1-eGFP)。

首先，體外合成一段單鏈的部分miR30干擾序列和一條單鏈的shApex1，通過退火獲得插入目的片段miR30-Apex1，目的片段兩端帶有BbsI酶切位點。所述插入目的片段miR30-Apex1含有如SEQ ID NO.3所示的序列。如SEQ ID NO.3所示的序列具體為：5-GGCTAGCATGACCAGGATTAGAAATCAGGAAACTCCTGGTGCACATGATGGAGGAGTTTCCTGATTTCTTCC TGGTCA-3。

制備載體片段：將質粒pISceI-HSP70-miR30-eGFP進行BbsI酶切。酶切體系：10xGreen Buffer 5μl、質粒DNA 0.7μl、BbsI2.5μl、加水補足至50μl。酶切完成后，將酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳回收片段(HSP70-miR30-eGFP)得到質粒載體片段。

用T4DNA連接酶將所得質粒載體片段與目的片段37℃連接過夜，獲得重組質粒(pISceI-HSP70-miR30-Apex1-eGFP)。反應體系：質粒載體片段0.7μl，目的片段3μl，10xBuffer 2μl，T4DNAligase 1μl，加水補足20μl。

重組質粒(pISceI-HSP70-miR30-Apex1-eGFP)中，熱激啟動子HSP70含有如SEQ ID NO.4所示的序列。

重組質粒(pISceI-HSP70-miR30-Apex1-eGFP)中，除目的基因干擾序列Apex1以外的序列含有如SEQ ID NO.5所示的序列。

斑馬魚受精卵的獲取：數(shù)量2：1的親本野生雌雄魚放入交配盒中隔離培養(yǎng)，交配盒置于26～29℃恒溫環(huán)境中進行黑暗過夜培養(yǎng)，光周期為白晝14h、黑暗10h。培養(yǎng)結束混合雌雄魚，將底部有柵欄的內(nèi)層交配盒傾斜放置在外層交配盒上并置于26℃-29℃恒溫水域中， 待親魚產(chǎn)卵，親魚產(chǎn)卵25min～35min后，挑選收集交配盒底部的受精卵。

利用顯微注射儀并參照顯微注射法將得到的重組質粒注射入斑馬魚受精卵，將受精卵移入平鋪瓊脂糖的培養(yǎng)皿中；外源DNA的注射體積為0.5μL(0.4μg/μL)，I-SceⅠ酶0.6μL、酚紅0.25μl，加水至總體積5μl，取0.6μl注入玻璃毛細管中，隨即將其置入微型注射儀(Eppendorf AG Germany)中，注射后將受精卵放入裝有恒溫滅菌水的培養(yǎng)皿中，進行26℃-29℃恒溫培養(yǎng)。

將注射完成的受精卵在26℃-29℃恒溫滅菌水中培育24h后將受精卵收集裝于無菌試管中，37℃恒溫水浴鍋熱浴1h后，重新放入26℃-29℃恒溫殺菌水中培育6h檢測綠色熒光蛋白基因的表達效果，挑選有熒光的斑馬魚胚胎進行后續(xù)熒光定量PCR檢測。

收集好的受精卵要及時凍藏以備提取RNA，進行逆轉錄時采用Takara逆轉錄試劑盒，反應條件為37℃ 15min，85℃ 5sec，4℃保存，獲得的cDNA模板用于檢測斑馬魚胚胎中Apex1基因是否被敲低。

結果表明，檢測斑馬魚胚胎中Apex1基因被成功敲低，且敲除方法重復性好，效果佳。

以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實施例，并非對本發(fā)明任何形式上和實質上的限制，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還將可以做出若干改進和補充，這些改進和補充也應視為本發(fā)明的保護范圍。凡熟悉本專業(yè)的技術人員，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，當可利用以上所揭示的技術內(nèi)容而做出的些許更動、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實施例；同時，凡依據(jù)本發(fā)明的實質技術對上述實施例所作的任何等同變化的更動、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術方案的范圍內(nèi)。