本發(fā)明屬于藥物化學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，具體是CorylifolA糖基化衍生物及其制備方法和在抗腫瘤方面的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：近年來(lái)，各種惡性腫瘤發(fā)病率在世界范圍內(nèi)呈上升趁勢(shì)。在中國(guó)，惡性腫瘤發(fā)病率也正快速上升，惡性腫瘤已成為居民“第一殺手”。不斷設(shè)計(jì)、合成及篩選出療效顯著、副作用小的抗腫瘤新藥是人類與惡性腫瘤的較量中對(duì)抗腫瘤的必要“武器”。中藥補(bǔ)骨脂為豆科植物補(bǔ)骨脂(PsoraleacorylifoliaL.)的干燥成熟果實(shí)，性溫、味辛，具有補(bǔ)腎壯陽(yáng)、健脾胃等功效。研究表明，補(bǔ)骨脂中含有多種化學(xué)成分，主要包括補(bǔ)骨脂酚類、黃酮類、香豆素類等。其中，CorylifolA屬于異黃酮類黃酮，是中藥補(bǔ)骨脂中主要活性成分之一，CorylifolA的結(jié)構(gòu)式如下：現(xiàn)代藥理研究表明，CorylifolA具有多種藥理作用，如抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、抗氧化等。CorylifolA結(jié)構(gòu)特征上屬于異黃酮類，其C環(huán)上有1個(gè)香葉草基(geranyl)取代，同時(shí)還具有2個(gè)酚羥基。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，黃酮被異戊烯基、香葉草基等取代后，可增加脂溶性和對(duì)生物膜的親和力，以及靶蛋白的相互作用，從而影響了很多生理活性。但是CorylifolA與大多數(shù)黃酮一樣，具有水溶性差的缺陷，使得其在開(kāi)發(fā)應(yīng)用上受到很大限制。天然產(chǎn)物(來(lái)源于植物、微生物、動(dòng)物)是新藥研發(fā)中先導(dǎo)化合物的主要來(lái)源。天然產(chǎn)物的糖基化不僅增加化合物的結(jié)構(gòu)多樣性，而且在功能上這些糖分子參與了目標(biāo)細(xì)胞的識(shí)別，提高水溶性，影響生物活性。如7β-xylosyl-10-deacetyltaxol(CAS：90332-63-1)及其衍生物在保留抗腫瘤活性的同時(shí)，顯著地提高了其水溶性以及對(duì)腫瘤細(xì)胞的特異選擇性。天然產(chǎn)物的糖基化可以影響藥物的吸收、分布、代謝、排泄，而且降低藥物的毒性。目前常用的糖基化途徑有化學(xué)合成法、生物合成途徑工程技術(shù)、生物轉(zhuǎn)化技術(shù)和體外酶法糖基化反應(yīng)(invitroenzymaticglycosylation)等。雖然體外酶法糖基化反應(yīng)具有令人滿意的產(chǎn)率與選擇性，但尋找一種具有底物特異選擇性的糖基轉(zhuǎn)移酶是關(guān)鍵。糖基轉(zhuǎn)移酶是糖基化的天然產(chǎn)物生合成途徑上重要的一種酶，其主要功能是催化供體上的糖轉(zhuǎn)移到非糖體(aglycon)。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的在于提供一類CorylifolA糖基化衍生物及其制備方法和在抗腫瘤方面的應(yīng)用，利用糖基轉(zhuǎn)移酶(YjiC)，將UDP-glucose作為供體，通過(guò)體外酶法糖基化法制備出新型的CorylifolA糖基化衍生物，并研究其理化性質(zhì)，證明本發(fā)明的CorylifolA糖基化衍生物不僅具有較好的水溶性和穩(wěn)定性，還具有顯著的抗腫瘤作用，CorylifolA糖基化衍生物及其鹽在制備治療癌癥藥物中具有廣闊的應(yīng)用前景。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一類CorylifolA糖基化衍生物，具有如式(I)所示的結(jié)構(gòu)通式：其中R是氫(—H)或6-羥甲基-2,3,4,5四羥基-四氫吡喃本發(fā)明的CorylifolA糖基化衍生物的制備方法，包括以下步驟：(1)糖基轉(zhuǎn)移酶(YjiC)的表達(dá)及精制：通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)得到Bacillus來(lái)源的YjiC基因，并定向克隆到pET28/-his載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒pET302-YjiC，將重組質(zhì)粒pET302-YjiC熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)宿主上，并利用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷優(yōu)化重組質(zhì)粒pET302-YjiC的表達(dá)條件。隨后，采用Ni2+NTA樹(shù)脂純化，獲得高純度His-tag-YjiC；(2)CorylifolA糖基化衍生物的制備：將含25mmolpH值為9.6的Tris-HCl、1mmolMgCl2、25mgHis-tag-YjiC、3mmolUDP-glucose和60mgCorylifolA的反應(yīng)液50mL在30℃反應(yīng)3小時(shí)；反應(yīng)結(jié)束后，在100℃水浴加熱5min，清除His-tag-YjiC的活性，再用乙酸乙酯對(duì)反應(yīng)液進(jìn)行萃取，獲得乙酸乙酯提取物，乙酸乙酯提取物經(jīng)半制備高效液相精制，獲得CorylifolA糖基化衍生物。本發(fā)明利用糖基轉(zhuǎn)移酶(YjiC)對(duì)CorylifolA的特異選擇性，將UDP-glucose作為供體，通過(guò)體外酶反應(yīng)制備出新型的CorylifolA糖基化衍生物，且制備的CorylifolA糖基化衍生物不僅具有良好的水溶性和穩(wěn)定性，還具有顯著的抗腫瘤作用。本發(fā)明還提供了CorylifolA糖基化衍生物在制備抗腫瘤藥物中的應(yīng)用，所述的腫瘤細(xì)胞為造血系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、肺系統(tǒng)、腸胃系統(tǒng)、骨骼肌系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)或泌尿系統(tǒng)部位的腫瘤細(xì)胞，特別是肝癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞。本發(fā)明的CorylifolA糖基化衍生物1和CorylifolA糖基化衍生物2的水溶性分別比CorylifolA(底物)的水溶性增加26.91和15.13倍，并且對(duì)pH和溫度具有較好的穩(wěn)定性；而且兩種CorylifolA糖基化衍生物在體內(nèi)還具有良好的藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)，且毒性低，與目前臨床所用的抗腫瘤藥物大相比，具有很好的臨床抗腫瘤藥的應(yīng)用前景。所述的CorylifolA糖基化衍生物被配制為用于口服或注射給藥，劑型可以為液體制劑、片劑、顆粒劑、沖劑、膠丸劑、膠囊、緩釋劑、滴丸劑或口崩制劑。附圖說(shuō)明圖1是十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析重組蛋白YjiC的表達(dá)與精制。圖2是CorylifolA體外酶法糖基化反應(yīng)的反應(yīng)條件優(yōu)化。圖3是CorylifolA糖基化衍生物1和CorylifolA糖基化衍生物2的穩(wěn)定性柱狀圖。具體實(shí)施方式以下結(jié)合實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明發(fā)明。實(shí)施例1.CorylifolA糖基化衍生物1和CorylifolA糖基化衍生物2，結(jié)構(gòu)式如下：實(shí)施例2.CorylifolA糖基化衍生物1和CorylifolA糖基化衍生物2的制備方法：1、CorylifolA的提取分離，結(jié)構(gòu)鑒定：(1)實(shí)驗(yàn)材料：試劑：硅膠(Kieselegel60，230～400目，美國(guó)Merk公司)，薄層色譜板(硅膠60F254，美國(guó)Meck公司)，所有試劑均為分析純(天津市大茂化學(xué)試劑廠)。儀器：BrukerARX核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司)，JMS-HX/HX110A型質(zhì)譜儀(日本JEOL公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本Eyele公司)。(2)提取與分離：中藥補(bǔ)骨脂5.1kg用20L甲醇在室溫條件下，用冷浸法提取兩次，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將甲醇提取液進(jìn)行濃縮，得甲醇浸膏770.5g；將甲醇浸膏溶于水中，依次用同等體積的正己烷、氯仿、乙酸乙酯與水萃取，其中獲得氯仿部位浸膏217.8g；氯仿部位浸膏117.3g經(jīng)硅膠柱色譜(70～230目)，以氯仿-甲醇為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，薄層色譜分析(TLC)檢查后合并得8個(gè)組分A1～A8，其中組分A4(8.4g)經(jīng)過(guò)反復(fù)使用300～400目硅膠柱色譜分離得到CorylifolA(247mg)。(3)結(jié)構(gòu)鑒定：CorylifolA：ESI-MSm/z391.2[M+H]+；1HNMR(600MHz,DMSO-d6)：δ9.48(1H,s),8.25(1H,s),7.97(1H,d,J＝8.8Hz),7.25(1H,d,J＝2.0Hz),7.20(1H,dd,J＝8.2,2.2Hz),6.94(1H,dd,J＝8.8,2.2Hz),6.86(1H,d,J＝2.2Hz),6.84(1H,d,J＝8.2Hz),5.33(1H,t,J＝7.0Hz),5.08(1H,t,J＝6.8Hz),3.27(2H,d,J＝7.2Hz),2.07(2H,dd,J＝14.2,6.8Hz),2.04–1.97(2H,m),1.69(3H,s),1.58(3H,s),1.54(3H,s)；13CNMR(150MHz,DMSO-d6)δ174.85,162.73,157.57,154.94,152.77,135.10,130.81,130.12,127.43,127.20,124.22,123.96,122.71,116.73,115.27,114.62,102.19,28.04,26.26,25.51,17.66,16.02。2、糖基轉(zhuǎn)移酶(YjiC)的表達(dá)與精制：(1)實(shí)驗(yàn)材料：儀器：PCR儀(日本TaKaRa公司)。試劑：異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(美國(guó)Sigma公司)，聚合酶鏈反應(yīng)相關(guān)酶(日本TaKaRa公司)。(2)YjiC的表達(dá)與精制：通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(polymerasechainreaction,PCR)得到Bacillus來(lái)源的糖基轉(zhuǎn)移酶(YjiC)基因，并定向克隆到pET28/-his載體上構(gòu)建重組質(zhì)粒pET302-YjiC。將重組質(zhì)粒pET302-YjiC熱激轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)宿主，并利用誘導(dǎo)劑異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-1-thiogalactopyranoside,IPTG)優(yōu)化重組質(zhì)粒pET302-YjiC的表達(dá)條件，并采用Ni2+NTA樹(shù)脂純化，如十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳分析圖所示，獲得了高純度His-tag糖基轉(zhuǎn)移酶(YjiC)(見(jiàn)圖1)。3、體外酶法糖基化反應(yīng)及其反應(yīng)條件的優(yōu)化：(1)實(shí)驗(yàn)材料：儀器：高效液相色譜儀(美國(guó)Dionex公司,P580泵，PDA-100檢測(cè)器)，液質(zhì)聯(lián)用色譜儀(美國(guó)Finnigan公司)。試劑：乙腈、甲醇(美國(guó)Fisher公司)，UDP-glucose(美國(guó)Sigma公司)。(2)體外酶法糖基化反應(yīng)：體外酶法糖基化反應(yīng)中，糖基轉(zhuǎn)移酶YjiC對(duì)底物(CorylifolA)的選擇特異性是整個(gè)反應(yīng)的關(guān)鍵。本發(fā)明中，利用LC-MS對(duì)體外酶反應(yīng)液進(jìn)行分析，確定了YjiC對(duì)CorylifolA具有催化供體上的糖轉(zhuǎn)移到底物上的功能。具體反應(yīng)條件為：將含25mmolpH值為9.6的Tris-HCl、1mmolMgCl2、0.5mgHis-tag糖基轉(zhuǎn)移酶、3mmolUDP-glucose和1mgCorylifolA的反應(yīng)液1mL在30℃反應(yīng)3小時(shí)，溶于一定體積的甲醇并將上清液利用HPLC進(jìn)行分析：流動(dòng)相(溶劑B:乙腈；溶劑A:水)、梯度洗脫(0～20分鐘，20％～100％溶劑B；20～30分鐘，100％溶劑B)流速(1mL/min)、檢測(cè)波長(zhǎng)為240nm；色譜柱為SunFireTMprepC18,4.6×150mm；以及LC-MS進(jìn)行分析，同時(shí)檢測(cè)出2個(gè)不同保留時(shí)間的峰，并且分子量分別增加，兩分子葡萄糖分子量的715.4[M+H]+和一分子葡萄糖分子量的553.5[M+H]+離子峰。(3)體外酶法糖基化反應(yīng)條件的優(yōu)化：體外酶法糖基化反應(yīng)中，除了酶對(duì)底物的選擇特異性之外，其它反應(yīng)條件也影響產(chǎn)物的產(chǎn)率，因此，本發(fā)明為了最大的提高反應(yīng)產(chǎn)率，以糖基化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，如反應(yīng)液的pH值、反應(yīng)時(shí)間、UDP-glucose的濃度對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響，如圖2所示。以糖基化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化率為指標(biāo)，通過(guò)對(duì)各反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，最終尋找出了最佳的條件為：Tris-HCl的pH值為9.6、反應(yīng)為3小時(shí)、UDP-glucose的濃度為3mmol，此時(shí)CorylifolA糖基化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化能力分別為：CorylifolA糖基化衍生物1為173.8mg/L，CorylifolA糖基化衍生物2為624.3mg/L。4、CorylifolA糖基化衍生物的制備：(1)實(shí)驗(yàn)材料：儀器：半制備高效液相色譜儀(美國(guó)Waters公司)，BrukerARX核磁共振儀(德國(guó)Bruker公司)，JMS-HX/HX110A型質(zhì)譜儀(日本JEOL公司)。試劑：乙腈、甲醇(美國(guó)Fisher公司)。(2)方法：將含25mmolpH值為9.6的Tris-HCl、1mmolMgCl2、25mgHis-tag糖基轉(zhuǎn)移酶、3mmolUDP-glucose和60mgCorylifolA的反應(yīng)液50mL在30℃反應(yīng)3小時(shí)，待反應(yīng)結(jié)束后，在100℃水浴加熱5min，清除糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，再將反應(yīng)液轉(zhuǎn)移到分液漏斗中，加入同等體積的乙酸乙酯進(jìn)行萃取，并獲得乙酸乙酯提取物49mg。乙酸乙酯提取物經(jīng)半制備高效液相精制(Waters2535Qsystem；色譜柱為SunfireTMprepC18,10×250mm；流動(dòng)相為40％乙腈；流速為4mL/min)，獲得5.2mgCorylifolA糖基化衍生物1和17.7mgCorylifolA糖基化衍生物2。(3)結(jié)構(gòu)鑒定：CorylifolA糖基化衍生物1為白色固體；HRESI-MSm/z[M+H]+＝715.2975，分子式為C37H47O14；1HNMR(600MHz,DMSO-d6)：δ8.38(1H,s,H-2),8.03(1H,d,J＝8.9Hz,H-5),7.52(2H,m,H-2',H-5'),7.23(1H,d,J＝2.3Hz,H-8),7.15(2H,m,H-6,H-5'),5.34(1H,dd,J＝7.4,6.3Hz,H-2”),5.10(1H,d,J＝7.4Hz,H-1”'),5.07(1H,dd,J＝8.7,3.4Hz,H-6”),4.83(1H,d,J＝7.5Hz,H-1””),3.76(2H,m,H-6”',H-6””),3.54-3.37overlap,3.41(2H,dd,J＝15.6,7.7Hz,H-1”),3.25(2H,m,H-5”',H-5””),2.05(2H,m,H-4”),1.99(2H,m,H-5”),1.68(3H,s,H-8”),1.55(3H,s,H-10”),1.52(3H,s,H-9”)；13CNMR(150MHz,DMSO-d6)δ174.62(C-4),161.43(C-7),157.03(C-9),155.04(C-4'),153.64(C-2),135.35(C-3”),130.64(C-7”),129.93(C-2'),129.68(C-3'),127.43(C-6'),126.94(C-5),125.20(C-1'),124.11(C-6”),123.69(C-3),122.37(C-2”),118.45(C-10),115.59(C-5'),114.67(C-6),103.38(C-8),101.14(C-1””),99.96(C-1”'),77.19(C-5”'),77.07(C-5””),76.75(C-3”'),76.46(C-3””),73.42(C-2”'),73.12(C-2””),69.80(C-4”'),69.61(C-4””),60.78(C-6”'),60.61(C-6””),40.55(C-4”),27.74(C-1”),26.10(C-5”),23.37(C-8”),17.54(C-9”),15.89(C-10”)。根據(jù)波譜數(shù)據(jù)、文獻(xiàn)綜合解析，corylifolA糖基化衍生物1的結(jié)構(gòu)式為：CorylifolA糖基化衍生物2為白色固體；HRESI-MSm/z[M+H]+＝553.2443，分子式C31H36O9；1HNMR(600MHz,DMSO-d6)：δ8.26(1H,s,H-2),7.93(1H,d,J＝8.7Hz,H-5),7.29(2H,m,H-2',H-6'),7.12(1H,m,H-6),6.90(1H,m,H-5'),6.82(1H,s,H-8),5.34(1H,t,J＝6.9Hz,H-2”),5.06(1H,m,H-6”),4.82(1H,d,J＝7.5Hz,H-1”'),3.71(1H,m,H-6”'),3.57-3.37overlap,3.40(2H,dd,J＝15.6,7.8Hz,-H-1”),2.06(2H,dd,J＝14.7,7.0Hz,H-5”),1.98(2H,m,H-4”),1.67(3H,s,H-10”),1.55(3H,s,H-9”),1.52(3H,s,H-8”)；13CNMR(150MHz,DMSO-d6)δ174.52(C-4),163.56(C-7),157.51(C-9),154.95(C-4'),152.93(C-2),135.33(C-3”),130.64(C-7”),129.89(C-2'),129.66(C-3'),127.41(C-6'),127.19(C-5),125.51(C-1'),124.11(C-6”),123.43(C-3),122.39(C-2”),116.33(C-10),115.38(C-5'),114.67(C-6),102.06(C-8),101.20(C-1”'),77.06(C-5”'),76.76(C-3”'),73.43(C-2”'),69.81(C-4”'),60.79(C-6”'),39.52(C-4”),27.73(C-1”),26.11(C-5”),25.36(C-9”),17.54(C-8”),15.88(C-10”)。根據(jù)波譜數(shù)據(jù)、文獻(xiàn)綜合解析，corylifolA糖基化衍生物2的結(jié)構(gòu)式為：實(shí)施例3.檢測(cè)CorylifolA糖基化衍生物1和CorylifolA糖基化衍生物2的水溶性：儀器：KQ5200B超聲儀(中國(guó)昆山超聲儀器有限公司)，離心機(jī)(意大利ALC公司)，HPLC(美國(guó)Dionex公司)。試劑：乙腈和甲醇(美國(guó)Fisher公司)。方法：分別取足夠量的CorylifolA糖基化衍生物1、CorylifolA糖基化衍生物2及CorylifolA，分別溶于裝有400μL蒸餾水的1.5mL離心管中，并在室溫條件下利用超聲波輔助溶解，使其呈過(guò)飽和狀態(tài)。超聲波溶解30分鐘后，再10000r/min離心20分鐘，取上清液稀釋至適當(dāng)濃度，注入HPLC進(jìn)行分析，并求算水溶液中化合物的濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示：CorylifolA糖基化衍生物1和CorylifolA糖基化衍生物2的水溶性和其底物化合物(CorylifolA)相比有顯著提高，分別是底物化合物的26.91倍和15.13倍。表1CorylifolA糖基化衍生物1和CorylifolA糖基化衍生物2的水溶性檢測(cè)：化合物水中的溶解度(μmol/L)相對(duì)溶解度CorylifolA糖基化衍生物1228.38±13.0726.91CorylifolA糖基化衍生物2128.45±1.6815.13CorylifolA8.49±0.581實(shí)施例4.檢測(cè)CorylifolA糖基化衍生物1和CorylifolA糖基化衍生物2對(duì)pH和溫度的穩(wěn)定性：儀器：MiniDryBath(杭州米歐儀器有限公司)。試劑：乙腈、甲醇(美國(guó)Fisher公司)。方法：pH穩(wěn)定性的測(cè)定：將CorylifolA糖基化衍生物1、CorylifolA糖基化衍生物2和底物(CorylifolA)分別溶于200μL不同pH(6.0、7.0、8.0、8.8、9.6、10.2)的Tris-HCl緩沖液中，在室溫下反應(yīng)0.5小時(shí)，并用HPLC直接檢測(cè)。溫度穩(wěn)定性的測(cè)定：將CorylifolA糖基化衍生物1、CorylifolA糖基化衍生物2和底物(CorylifolA)分別溶于200μL的Tris-HCl(取pH穩(wěn)定性檢測(cè)的最穩(wěn)定的pH值)在不同溫度下(40、60、80、100℃)置于MiniDryBath反應(yīng)30分鐘后，注入HPLC進(jìn)行檢測(cè)，并且與在室溫條件下進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，用降解率表示穩(wěn)定性，CorylifolA經(jīng)糖基化的修飾，在一定的pH和高溫的條件下CorylifolA糖基化衍生物1和CorylifolA糖基化衍生物2比底物(CorylifolA)更加穩(wěn)定，且CorylifolA糖基化衍生物1的穩(wěn)定性更好。實(shí)施例5.MTT法檢測(cè)CorylifolA糖基化衍生物1和CorylifolA糖基化衍生物2對(duì)三種腫瘤細(xì)胞增殖的影響：該實(shí)施例通過(guò)對(duì)人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人肝癌SMMC7721細(xì)胞、人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞的殺傷作用進(jìn)行效果評(píng)價(jià)。(1)實(shí)驗(yàn)材料：細(xì)胞株：人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人肝癌SMMC7721細(xì)胞、人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞來(lái)源于美國(guó)AmericanTypeCultureCollection(ATCC)公司。儀器：二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)SHELLLAB公司)，多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek)，倒置顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。試劑：噻唑藍(lán)(MTT)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；培養(yǎng)液、二甲基亞砜(DMSO)、0.25％胰蛋白酶、青霉素和鏈霉素購(gòu)自Hyclone；96孔培養(yǎng)板購(gòu)自Coming公司；胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Millipore公司。(2)方法：細(xì)胞培養(yǎng)：將人乳腺癌MCF-7細(xì)胞、人肝癌SMMC7721細(xì)胞、人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞細(xì)胞接種于DMEM(含10％滅活胎牛血清，100IU/1青霉素，100μg/mL鏈霉素)，置5％CO2，37℃，飽和濕度環(huán)境下培養(yǎng)并傳代。MTT法：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，用0.25％胰蛋白酶消化制成單細(xì)胞懸液，接種于96孔板中，每孔100μL培養(yǎng)液中含有5000個(gè)細(xì)胞，于5％CO2飽和濕度37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)14小時(shí)后，按不同濃度處理化合物(同時(shí)設(shè)陽(yáng)性對(duì)照組：格爾德霉素20μtmol/L)，每個(gè)處理3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)后每孔加入10μL濃度為5g/L的MTT溶液繼續(xù)孵育4小時(shí)，棄去培養(yǎng)液，每孔加入DMSO150μL，37℃孵育30分鐘，微量振蕩器振蕩10分鐘使結(jié)晶物充分溶解，用酶標(biāo)儀在570nm波長(zhǎng)下檢測(cè)每孔的吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率/％＝實(shí)驗(yàn)組A570nm/對(duì)照組A570nm×100％，繪制劑量效應(yīng)曲線。以上實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。(3)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，CorylifolA糖基化衍生物2在體外對(duì)多種腫瘤細(xì)胞具有一定的抑制其增殖的作用，IC50在114.5到146.3μmol/L之間。表2CorylifolA糖基化衍生物1和CorylifolA糖基化衍生物2的細(xì)胞毒性(IC50，μmol/L，Mean±SD，n＝3)：化合物MCF-7SMMC7721SW480CorvlifolA58.2±4.2064.6±0.7451.2±4.17CorylifolA糖基化衍生物1＞200＞200＞200CorylifolA糖基化衍生物2146.3±1.05125.7±1.58114.5±2.28當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3