本發(fā)明涉及檢測長爪沙鼠感染幽門螺旋桿菌的方法。

背景技術(shù)：

幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)形態(tài)特征與彎曲菌類似，革蘭陰性，呈螺形、S型或海鷗展翅狀，在胃粘液層中常呈魚群樣排列，傳代培養(yǎng)后活在不利環(huán)境條件下可變成桿狀或球形。菌體一端或兩端可有多根鞭毛。幽門螺旋桿菌為微需氧細(xì)菌，最適生長溫度為35-37℃。營養(yǎng)要求高，需血液或血清，生長時(shí)還需要一定濕度。球形變的細(xì)菌，通常處于休眠狀態(tài)，在體外難以傳代培養(yǎng)，但在體內(nèi)環(huán)境條件適宜時(shí)可轉(zhuǎn)化成螺旋形細(xì)菌。

此類菌主要以隱性感染形式存在于長爪沙鼠(拉丁文學(xué)名：Meriones Unguiculatus；英文名：Mongolian gerbil)的胃竇部，可引起宿主不同程度的病理反應(yīng)從而導(dǎo)致慢性胃炎、胃潰瘍、腸化生甚至胃癌的發(fā)生。模型動(dòng)物感染螺桿菌時(shí)，可引起誘發(fā)一些并發(fā)疾病，嚴(yán)重影響實(shí)驗(yàn)動(dòng)物質(zhì)量并對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性產(chǎn)生潛在的干擾。此外幽門螺旋桿菌在人和長爪沙鼠間可以相互傳播，攜帶幽門螺旋桿菌的長爪沙鼠可以通過接觸傳播給飼養(yǎng)人員和實(shí)驗(yàn)人員，造成人員感染。

目前，長爪沙鼠幽門螺旋桿菌感染的檢測方法主要有病原學(xué)、血清學(xué)、尿素酶試驗(yàn)及分子生物學(xué)方法：

(1)細(xì)菌分離培養(yǎng)。取胃竇和胃體組織，在特殊的培養(yǎng)基和微氧環(huán)境下培養(yǎng)分離該菌。本方法檢測需要對動(dòng)物進(jìn)行處死取材，成本較高實(shí)驗(yàn)周期長，需要培養(yǎng)3-6d，生化鑒定試驗(yàn)操作繁瑣，耗時(shí)費(fèi)力。雖然培養(yǎng)出細(xì)菌后可以確診，但其假陰性率較高。

(2)血清學(xué)檢測。運(yùn)用ELISA方法來檢測血清或糞便中抗幽門螺旋桿菌特異性抗體。免疫學(xué)方法操作簡便，可在同一時(shí)間內(nèi)檢測大量樣品，但長爪沙鼠作為一種正在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物化的動(dòng)物，沒有很好的抗體適用于ELISA檢測。

(3)PCR檢測。直接檢測糞便、腸內(nèi)容物及胃組織中該菌體的DNA。但該方法大多需要將動(dòng)物處死后取動(dòng)物組織、腸內(nèi)容物以及活體檢測糞便。由于 長爪沙鼠主要生活在荒漠地帶，所以其糞便含水量較低，不利于細(xì)菌生存，故糞便檢測幽門螺旋桿菌的假陰性率也比較高。

長爪沙鼠是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中使用非常廣泛及數(shù)量頗多的動(dòng)物，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，長爪沙鼠是作為幽門螺旋桿菌致病性研究的重要實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，在幽門螺旋桿菌感染的條件下，長爪沙鼠會(huì)出現(xiàn)胃炎、胃潰瘍、腸化生甚至出現(xiàn)胃癌。幽門螺旋桿菌的感染可對飼養(yǎng)人員和實(shí)驗(yàn)人員造成傷害并且可對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性產(chǎn)生嚴(yán)重的干擾。

基于目前的各種檢測方法，還需要一種操作相對簡易、結(jié)果可靠且成本低廉的檢測實(shí)驗(yàn)長爪沙鼠活體感染幽門螺旋桿菌的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測更容易、更可靠且成本低廉的實(shí)驗(yàn)長爪沙鼠活體感染幽門螺旋桿菌的方法。

因此，本發(fā)明提供了一種檢測長爪沙鼠(拉丁文學(xué)名：Meriones Unguiculatus；英文名：Mongolian gerbil)感染幽門螺旋桿菌(Helicobacter pylori)的方法，其包括以下步驟：步驟一：對所述長爪沙鼠禁食不禁水以排空其胃中的消化物；步驟二：向所述長爪沙鼠的胃中灌生理鹽水或水；步驟三：從所述長爪沙鼠的胃中抽取液體；步驟四：以所述液體為樣本提取基因組；步驟五：進(jìn)行巢式PCR：以所述基因組為模板使用第一對引物進(jìn)行第一輪PCR獲得第一PCR產(chǎn)物；以所述第一PCR產(chǎn)物為模板使用第二對引物進(jìn)行第二輪PCR獲得第二PCR產(chǎn)物；步驟六：檢測所述第二PCR產(chǎn)物，當(dāng)檢測到所述第二PCR產(chǎn)物的大小與其預(yù)期的大小相同，或所述第二PCR產(chǎn)物的序列與其預(yù)期的序列相同時(shí)，那么確認(rèn)所述長爪沙鼠感染所述幽門螺旋桿菌。在設(shè)計(jì)本發(fā)明的巢式PCR的擴(kuò)增的片段時(shí)，一般來講，第一PCR產(chǎn)物的大小為300-800bp，優(yōu)選為400-600bp；第二PCR產(chǎn)物的大小為80-150bp，優(yōu)選為80-120bp。

在本發(fā)明中，所述第一對引物為SEQ ID No.1和SEQ ID No.2；所述第二對引物為SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

在本發(fā)明中，所述長爪沙鼠禁食不禁水的時(shí)間為18-36小時(shí)，優(yōu)選為20-28小時(shí)。

在本發(fā)明中，在所述步驟二中，使用灌胃針向所述長爪沙鼠的胃中灌所述生理鹽水或水0.3-0.6ml。

在本發(fā)明中，在所述步驟三中，抽取液體的體積70-120μL。

在本發(fā)明中，在第一輪PCR的反應(yīng)程序如下：92-98℃預(yù)變性0-10min；92-98℃變性0.5-2min、40-55℃退火0.5-2min、65-78℃延伸0.5-2min，循環(huán)20-45次；65-78℃終延伸0-15min；優(yōu)選第一輪PCR的反應(yīng)程序如下：94-96℃預(yù)變性2-5min；94-96℃變性0.5-1min、42-47℃退火0.5-1min、70-73℃延伸0.5-1min，循環(huán)25-35次；70-73℃終延伸2-10min。

在本發(fā)明中，在第二輪PCR的反應(yīng)程序如下：92-98℃預(yù)變性0-7min；92-98℃變性15-60sec、43-58℃退火15-60sec、65-78℃延伸15-60sec，循環(huán)20-45次；65-78℃終延伸0-15min；優(yōu)選第二輪PCR的反應(yīng)程序如下：94-96℃預(yù)變性30-180sec；94-96℃變性20-40sec、46-51℃退火20-40sec、72℃延伸20-40sec，循環(huán)25-35次；70-73℃終延伸1-5min。

在本發(fā)明中，第一輪PCR的體系中各組分的比例關(guān)系如下：

模板：SEQ ID No.1：SEQ ID No.2：10倍的的PCR緩沖液：DNA聚合酶：水＝10-100ng：0.5-1.5μmol：0.5-1.5μmol：4-6μL：0.5-3U：32-48μL；優(yōu)選模板：SEQ ID No.1：SEQ ID No.2：10倍的PCR緩沖液：DNA聚合酶：水＝20-40ng：0.5-1μmol：0.5-1μmol：4-6μL：0.5-1U：38-42μL；更優(yōu)選模板：SEQ ID No.1：SEQ ID No.2：2×PCR Master Mix或2×PreMix rTaq：水＝20-40ng：0.5-1μmol：0.5-1μmol：23-28μL：17-25μL。其中2×PCR Master Mix購自Thermo公司；2×PreMix rTaq購自Thermo公司。并且2×PCR Master Mix或2×PreMix rTaq中的組分以說明書中為準(zhǔn)。

在本發(fā)明中，在第二輪PCR的體系中各組分的比例關(guān)系如下：

模板：SEQ ID No.3：SEQ ID No.4：10倍的的PCR緩沖液：DNA聚合酶：水＝10-100ng：0.5-1.5μmol：0.5-1.5μmol：4-6μL：0.5-3U：32-48μL；優(yōu)選模板：SEQ ID No.3：SEQ ID No.4：10倍的PCR緩沖液：DNA聚合酶：水＝20-40ng：0.5-1μmol：0.5-1μmol：4-6μL：0.5-1U：38-42μL；更優(yōu)選模板：SEQ ID No.3：SEQ ID No.4：2×PCR Master Mix或2×PreMix rTaq：水＝20-40ng：0.5-1μmol：0.5-1μmol：23-28μL：17-25μL。其中2×PCR Master Mix購自Thermo公司；2×PreMix rTaq購自Thermo公司。在進(jìn)行第二輪PCR時(shí)，為了方便起見，也可以直接上向第一輪PCR的體系中補(bǔ)加適量的DNA聚合酶(例如0.5-3U或0.5-1U的DNA聚合酶)和用于第二輪PCR的上述適量的SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

本發(fā)明還提供了一種巢式PCR擴(kuò)增幽門螺旋桿菌的引物，其中第一對引物為SEQ ID No.1和SEQ ID No.2，第二對引物為SEQ ID No.3和SEQ ID No.4。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)：

(1)動(dòng)物存活：相對于傳統(tǒng)的幽門螺旋桿菌檢測方法，該方法通過胃液對其進(jìn)行檢測，對動(dòng)物傷害較小，能夠保證動(dòng)物的存活，動(dòng)物可以繼續(xù)用做其他實(shí)驗(yàn)。這對于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)特別是與幽門螺旋桿菌相關(guān)的實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。

(2)操作簡單，例如采用2×PCR Master Mix預(yù)混酶，需2步PCR就可得到幽門螺旋桿菌感染情況。

(3)檢測速度快：相對于傳統(tǒng)方式，該方法能夠較快速直觀的反應(yīng)出幽門螺旋桿菌感染情況。

(4)實(shí)驗(yàn)結(jié)果認(rèn)定較為簡單、客觀：該方法結(jié)果的判讀可以根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳圖中條帶目的條帶的有無或者直接測序來完成，使檢測結(jié)果的判讀更加簡單、客觀。

(5)成本低廉，本實(shí)驗(yàn)只需要微量樣品DNA提取試劑盒和普通PCR引物及DNA聚合酶。相對于細(xì)菌體外培養(yǎng)等方式，成本相對較低。

附圖說明

圖1是對十只人為感染幽門螺旋桿菌的長爪沙鼠胃液提取的DNA只進(jìn)行第一輪PCR后的PCR產(chǎn)物電泳圖。其中，泳道1-10依次為十只長爪沙鼠胃液樣品的PCR產(chǎn)物，各個(gè)泳道的上樣體積相同。

圖2是使用第二對引物至第五對引物進(jìn)行第二輪PCR后進(jìn)行的電泳圖。其中，各個(gè)泳道的上樣體積相同。泳道1-5為使用第二對引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；泳道6-10為使用第三對引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；泳道11-15為使用第四對引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；泳道16-20為使用第五對引物擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物；泳道1、泳道6、泳道11和泳道16的PCR退火溫度為44.8℃；泳道2、泳道7、泳道12和泳道17的PCR退火溫度為46.1℃；泳道3、泳道8、泳道13和泳道18的PCR退火溫度為48.3℃、泳道4、泳道9、泳道14和泳道19的PCR退火溫度為51.3℃、泳道5、泳道10、泳道15和泳道20的PCR退火溫度為55.3℃。

圖3是胃液中檢測幽門螺旋桿菌檢測閾值的電泳圖。其中泳道1-8分別為2×10⁸CFU/ml、2×10⁷CFU/ml、2×10⁶CFU/ml、2×10⁵CFU/ml、2×10⁴CFU/ml、 2×10³CFU/ml、2×10²CFU/ml和2×10CFU/ml的幽門螺旋桿菌菌液提取基因組后作為模板進(jìn)行巢式擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物，各個(gè)泳道的上樣體積相同。

圖4是檢測十只感染幽門螺旋桿菌長爪沙鼠胃液檢測幽門螺旋桿菌的電泳圖。其中，泳道1-10依次為十只長爪沙鼠胃液樣品的PCR產(chǎn)物，各個(gè)泳道的上樣體積相同。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例，進(jìn)一步說明本發(fā)明。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：雄性普通級長爪沙鼠10只，8周齡，體重50-60g。所有長爪沙鼠均來自首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，飼養(yǎng)于控制溫濕度的普通環(huán)境中【SYXK(京)2013-0005】。

幽門螺旋桿菌：標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC43504由中國食品藥品檢定研究院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物資源研究所提供。

試劑和儀器：哥倫比亞血瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基(OXOID公司，批號CM0331)；無菌脫纖維羊血(北京路橋技術(shù)有限公司)；MGC微需氧產(chǎn)氣袋與密封培養(yǎng)盒(三菱瓦斯化學(xué)株式會(huì)社)，幽門螺旋桿菌診斷試劑盒(YZB/閩0455-2009，福建三強(qiáng)生物化工有限公司)，微量樣品基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技(北京)有限公司，批號：DP316)，PCR Master Mix(2×)預(yù)混酶(K0171，Thermo Scientific)，低熔點(diǎn)瓊脂糖(A8350，Amresco)，PCR儀(Applied Biosystems公司)，電泳儀(BIO-RAD公司)，凝膠成像系統(tǒng)(BIO-RAD公司)，壓力蒸汽滅菌器(Triumph公司產(chǎn)品)，超凈工作臺(tái)，滅菌灌胃針，滅菌手術(shù)器械(眼科剪、眼科鑷等)。

在下面的實(shí)施例中提取的基因組可以用紫外分光光度計(jì)進(jìn)行定量。

實(shí)施例1

采用僅進(jìn)行一次PCR的方法活體檢測幽門螺旋桿菌

將無菌脫纖維羊血加入高壓滅菌后的哥倫比亞瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，傾倒于培養(yǎng)皿中制備平板，制成含5％脫纖維羊血的哥倫比亞瓊脂平板。將幽門螺旋桿菌接種于哥倫比亞血瓊脂平板上，至于密封培養(yǎng)盒中，進(jìn)行常規(guī)的36℃微需氧培養(yǎng)48h后，將菌苔用無菌生理鹽水制成含菌量為10⁹CFU/mL濃度的菌液，分裝成小份，至-80℃冰箱備用，2周內(nèi)用完。

取10只健康的長爪沙鼠分別用0.5mL菌液灌胃，連續(xù)灌胃3次，每次間隔24h。所有長爪沙鼠灌胃前禁食不禁水24h。灌胃結(jié)束后普通環(huán)境飼養(yǎng)10周。

提取上述人為感染幽門螺旋桿菌的長爪沙鼠胃液的方法：首先對人為感染幽門螺旋桿菌的長爪沙鼠禁食不禁水24h，以便排空其胃中消化物。使用灌胃針給長爪沙鼠灌胃0.5ml生理鹽水。等待1min左右后，再用灌胃針伸入長爪沙鼠胃中抽取其胃中液體放入離心管中(約100μL)。

幽門螺旋桿菌DNA的提?。菏褂锰旄萍?北京)有限公司天根的微量樣品基因組DNA提取試劑盒(DP316)提取長爪沙鼠胃液幽門螺旋桿菌基因組。

設(shè)計(jì)了第一對引物用于第一輪PCR，上游引物F1如SEQ ID No.1所示；下游引物R1如SEQ ID No.2所示。

第一輪PCR反應(yīng)體系加樣如下：

提取的幽門螺旋桿菌基因組20ng

10μmol的上游引物F1(SEQ ID No.1)1μL；

10μmol的下游引物R1(SEQ ID No.2)1μL；

2×PCR Master Mix 10μL；

ddH₂O至20μL。

第一輪PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec、45℃退火30sec、72℃延伸30sec，循環(huán)35次；72℃終延伸5min。

完成第一輪PCR后，取PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％的瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增目的條帶為499bp(見圖1)。根據(jù)電泳圖發(fā)現(xiàn)只進(jìn)行一輪PCR不能很好地?cái)U(kuò)增出目的條帶，檢測結(jié)果出現(xiàn)假陰性率較高。

實(shí)施例2

巢式PCR中的第二輪PCR的引物對的篩選

設(shè)計(jì)了4對用于第二輪PCR的引物并通過瓊脂糖凝膠電泳檢測其準(zhǔn)確性和特異性。

其中，第二對引物中的上游引物F2如SEQ ID No.3所示，下游引物R2如SEQ ID No.4所示；第三對引物中的上游引物F3如SEQ ID No.5所示，下游引物R3如SEQ ID No.6所示；第四對引物中的上游引物F4如SEQ ID No.7所 示，下游引物R4如SEQ ID No.8所示；第五對引物中的上游引物F5如SEQ ID No.9所示，下游引物R5如SEQ ID No.10所示。

實(shí)驗(yàn)方法為使用天根生化科技(北京)有限公司天根的微量樣品基因組DNA提取試劑盒(DP316)直接提取幽門螺旋桿菌基因組，幽門螺旋桿菌濃度為2×10⁹CFU/ml。使用幽門螺旋桿菌基因組為模版，實(shí)施例1的引物序列進(jìn)行第一輪PCR；然后以第一輪PCR的產(chǎn)物為模板，以第二對引物至第五對引物、不同退火溫度進(jìn)行第二輪PCR，以篩選出合適的引物和退火溫度。

第一輪PCR反應(yīng)體系加樣及反應(yīng)條件如實(shí)施例1。

第二輪PCR反應(yīng)體系加樣如下：

第一輪PCR產(chǎn)物20ng；

10μmol的上游引物1μL；

10μmol的下游引物1μL；

2×PCR Master Mix 10μL；

ddH₂O至20μL。

第二輪PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec、分別在44.8℃、46.1℃、48.3℃、51.3℃、55.3℃退火30sec、72℃延伸30sec，循環(huán)35次；72℃終延伸5min。

分別取4對引物的第二輪PCR產(chǎn)物進(jìn)行2％的瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶為100bp(如圖2)，并對所述PCR產(chǎn)物測序，測序結(jié)果與Pubmed數(shù)據(jù)進(jìn)行比對后，100％正確。

根據(jù)電泳圖可得，使用第二對引物(即上游引物為SEQ ID No.3，下游引物為SEQ ID No.4的引物對)擴(kuò)增出的目的條帶單一，具有較高的準(zhǔn)確性和特異性。故使用第二對引物作為第二輪PCR的引物。

實(shí)施例3

活體檢測幽門螺旋桿菌檢測閾值

檢測前對健康長爪沙鼠(即沒有感染幽門螺旋桿菌的長爪沙鼠)禁食不禁水24h，以便排空其胃中消化物。使用灌胃針給長爪沙鼠灌胃0.5ml生理鹽水。等1min左右后，再用灌胃針伸入長爪沙鼠胃中抽取其胃中液體放入離心管中。

將10只長爪沙鼠的胃液混合，然后從混合的胃液中取出180μL加入濃度為2×10⁹CFU/ml濃度的幽門螺旋桿菌20μL，混勻后倍比稀釋為濃度2× 10⁸CFU/ml、2×10⁷CFU/ml、2×10⁶CFU/ml、2×10⁵CFU/ml、2×10⁴CFU/ml、2×10³CFU/ml、2×10²CFU/ml和2×10CFU/ml的混合液。

用試劑盒為天根微量樣品基因組DNA提取試劑盒(DP316)提取不同濃度混合液中幽門螺旋桿菌基因組。

第一輪PCR反應(yīng)體系加樣如下：

提取的幽門螺旋桿菌基因組40ng；

10μmol的上游引物F1(SEQ ID No.1)1μL；

10μmol的下游引物R1(SEQ ID No.2)1μL；

2×PCR Master Mix 10μL；

ddH₂O至20μL。

第一輪PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec、45℃退火30sec、72℃延伸30sec，循環(huán)35次；72℃終延伸5min。

第二輪PCR反應(yīng)體系加樣如下：

第一輪PCR產(chǎn)物40ng；

10μmol的上游引物F2(SEQ ID No.3)1μL；

10μmol的下游引物R2(SEQ ID No.4)1μL；

2×PCR Master Mix 10μL；

ddH₂O至20μL。

第二輪PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec、51.3℃退火30sec、72℃延伸30sec，循環(huán)35次；72℃終延伸5min。

取不同濃度的幽門螺旋桿菌混合液提取的基因組進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物(即第二輪的PCR產(chǎn)物)進(jìn)行2％的瓊脂糖凝膠電泳(見圖3)并測序以及Pubmed數(shù)據(jù)庫BLAST結(jié)果。

從分析結(jié)果可以看出，活體檢測幽門螺旋桿菌的檢出限為2×10²CFU/ml，該檢出限說明本發(fā)明的方法檢測具有比現(xiàn)有技術(shù)靈敏度高的特點(diǎn)，完全能夠滿足后續(xù)的實(shí)驗(yàn)需要。

實(shí)施例4

活體檢測人為感染幽門螺旋桿菌長爪沙鼠

將無菌脫纖維羊血加入高壓滅菌后的哥倫比亞瓊脂基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，傾倒于培養(yǎng)皿中制備平板，制成含5％脫纖維羊血的哥倫比亞瓊脂平板。將幽門螺旋桿菌接種于哥倫比亞血瓊脂平板上，至于密封培養(yǎng)盒中，進(jìn)行常規(guī)的36℃微需氧培養(yǎng)48h后，將菌苔用無菌生理鹽水制成含菌量為10⁹CFU/mL濃度的菌液，分裝成小份，至-80℃冰箱備用，2周內(nèi)用完。取10只健康的長爪沙鼠分別用0.5mL菌液灌胃，連續(xù)灌胃3次，每次間隔24h。所有長爪沙鼠灌胃前禁食不禁水24h。灌胃結(jié)束后普通環(huán)境飼養(yǎng)10周。

提取上述人為感染幽門螺旋桿菌的長爪沙鼠胃液的方法：首先對人為感染幽門螺旋桿菌的長爪沙鼠禁食不禁水24h，以便排空其胃中消化物。使用灌胃針給長爪沙鼠灌胃0.5ml生理鹽水。等待1min左右后，再用灌胃針伸入長爪沙鼠胃中抽取其胃中液體放入離心管中(約100μL)。

幽門螺旋桿菌DNA的提?。菏褂锰旄萍?北京)有限公司天根的微量樣品基因組DNA提取試劑盒(DP316)提取長爪沙鼠胃液幽門螺旋桿菌基因組。

PCR反應(yīng)擴(kuò)增：

PCR體系具體加樣：第一輪PCR：以上述提取的基因組為模板30ng、2×PreMix rTaq 10μL、加入第一對引物的上游引物F1(SEQ ID No.1)(10μM)1μL和下游引物R1(SEQ ID No.2)(10μM)1μL、然后以ddH₂O補(bǔ)至20μL進(jìn)行第一輪PCR反應(yīng)，以F1和R1為擴(kuò)增引物的第一輪PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30sec、45℃退火30sec、72℃延伸30sec，循環(huán)35次；72℃終延伸5min。第二輪PCR：將第一輪PCR產(chǎn)物作為模板，再以F2(SEQ ID No.3)和R2(SEQ ID No.4)為擴(kuò)增引物的第二輪PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系為：模板30ng、2×PreMix rTaq 10μL、第二對引物的上游引物F2(SEQ ID No.3)(10μM)1μL和下游引物R2(SEQ ID No.4)(10μM)1μL、然后以ddH₂O補(bǔ)至20μL進(jìn)行第二輪PCR反應(yīng)，以F2和R2為擴(kuò)增引物的第二輪PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30sec、51.3℃退火30sec、72℃延伸30sec，循環(huán)35次；72℃終延伸5min。

瓊脂糖凝膠電泳：

巢式PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物(即第二輪的PCR產(chǎn)物)進(jìn)行2％的瓊脂糖凝膠電泳，擴(kuò)增目的條帶為100bp(見圖4)。

實(shí)施例5

對以實(shí)施例4相同方法人為感染幽門螺旋桿菌的10只長爪沙鼠的胃液、胃組織、十二指腸內(nèi)容物及結(jié)腸糞便分別進(jìn)行DNA提取(即對同一只人為感染幽門螺旋桿菌的長爪沙鼠分別提取其胃液、胃組織、十二指腸內(nèi)容物及結(jié)腸糞便的DNA)后，接著以獲得DNA分別為模板，以如實(shí)施例4相同的巢式PCR(包括第一輪引物的第一對引物和第二輪引物的第二對引物相同)進(jìn)行檢測，并瓊脂糖凝膠電泳，對于擴(kuò)增出目的條帶(結(jié)合測序結(jié)果)的視為陽性。

快速尿素酶檢測方法：使用胃幽門螺旋桿菌診斷試劑盒(福建三強(qiáng)生物化工有限公司)，使用前去底物酶標(biāo)條的蓋子，每孔加入酶促反應(yīng)液2滴(或100μL)，待藥膜完全溶解后，用潔凈鑷子將殺死受感染的動(dòng)物后提取的胃黏膜放入藥液中，在10℃-30℃條件下孵育5分鐘，觀察結(jié)果。采用目測法，襯白紙?jiān)谧匀还饩€下觀察各孔內(nèi)胃組織粘膜組織邊緣藥液顏色變化。幽門螺旋桿菌陰性為黃色，幽門螺旋桿菌陽性為淺紅色至玫瑰紅色。

結(jié)果：胃液樣品和胃組織樣品中檢出10只長爪沙鼠均感染幽門螺旋桿菌，檢出率100％；十二指腸內(nèi)容物樣品中檢出9只長爪沙鼠感染幽門螺旋桿菌，檢出率為90％；結(jié)腸糞便樣品中檢出1只長爪沙鼠感染幽門螺旋桿菌，檢出率為10％；快速尿素酶試驗(yàn)檢出10只長爪沙鼠感染幽門螺旋桿菌，檢出率100％。但是使用胃組織檢測對長爪沙鼠會(huì)有損害，不利于使用長爪沙鼠繼續(xù)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)，也就失去了活體檢測的意義，因此，綜合起來看，胃液樣品的檢測效果最優(yōu)，并且對于長爪沙鼠的損傷甚微，可以作為長期監(jiān)測類似長爪沙鼠等實(shí)驗(yàn)動(dòng)物幽門螺旋桿菌感染的無創(chuàng)檢測方法。統(tǒng)計(jì)上述實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果，如表1所示。結(jié)果用檢測言行結(jié)果比例表示，分別說明各種方法的檢測陽性率。

表1

“+”為陽性，“-為陰性”。